專利名稱：檢測唾液中乙醇含量的試劑條和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測乙醇的試劑條和試劑盒，具體地說涉及一種檢測唾液中乙醇含量的試劑條和試劑盒。
背景技術：
近年來，酒后引起的刑事案件和酒后駕車引起的交通事故案件不斷上升。目前，許多國家都制定了血液中乙醇濃度與交通事故責任認定的關系，建立了多種能夠檢測血液中乙醇含量的方法。如GM/MS等儀器檢測乙醇成分，雖然這些方法可以準確定量，但是存在著購買儀器價格昂貴，檢測成本高，需專門培訓，無法在案發(fā)現(xiàn)場快速檢測的缺點。呼氣式乙醇測定儀可以在現(xiàn)場使用，但是價格也十分昂貴，而且不衛(wèi)生，容易發(fā)生交叉感染疾病。
因此，近年來市場上出現(xiàn)了很多便于攜帶的檢測試劑條，如專利公開號CN1749751揭示了其中一種檢測試劑條，但是這些試劑條都存在高溫下活性不穩(wěn)定，保存時間短，不利于現(xiàn)場室外檢測的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種檢測唾液中乙醇含量的試劑條和試劑盒，以解決現(xiàn)有技術中的缺陷。
本發(fā)明根據(jù)唾液和血液中乙醇含量一致性的實驗基礎，在酶學反應的基礎之上的建立顯色反應，首先，乙醇氧化酶(ALO)將乙醇氧化成乙醛同時釋放出過氧化氫，在過氧化物酶(HRP)存在的情況下，TMB(N，N，N’，N’-四甲基聯(lián)苯胺)發(fā)生氧化而顯色，具體的反應原理如下
在以上反應中，TMB藍色的深淺和顯色速度的快慢與樣品中乙醇的含量成線形關系，并最終作為一種半定量的檢測的指標。
具體制備時采用1M的Tris-丙二酸作為緩沖系統(tǒng)，以褐藻膠和明膠作為穩(wěn)定劑，在這種條件下，乙醇氧化酶在37℃的情況下可以保持活性達一個月。而在沒有穩(wěn)定劑存在的條件下，乙醇氧化酶在37℃的情況下僅僅能保持活性不到24小時。
本發(fā)明首先提供了一種檢測唾液中乙醇含量的試劑條，該試劑條是通過如下方法制備的①配制乙醇氧化酶和辣根過氧化物酶溶液活性單位比為1∶2-10的乙醇氧化酶與辣根過氧化物，溶于pH 7.2的1M Tris-丙二酸緩沖液中，使每毫升的緩沖液中酶的總活性單位為150-550，再加與緩沖液等體積的水；②配制TMB/二甲苯溶液將TMB鹽酸鹽溶于水中，配制成10-30mg/ml的水溶液，用10mg/ml的鹽酸色氨酸進行脫色處理，然后加入與TMB鹽酸鹽水溶液等體積的二甲苯，用NaOH中和其中的鹽酸；溶液靜置后分層，棄去水溶液，得到TMB/二甲苯溶液；③酶和底物的固相化將濾紙浸入①的酶混合液中，取出濾紙干燥；將TMB/二甲苯溶液滴在已干燥的濾紙上，干燥；④制備試劑條把干燥后的濾紙貼在單面含膠的白色聚酯板的前端，用切紙機切成寬0.5-1cm的長條，即制成檢測試劑條。
其中步驟①中的乙醇氧化酶和辣根過氧化物酶溶液中還含有褐藻膠和明膠，其中酶溶液中褐藻膠的含量為0.25-0.75mg/ml，明膠含量為5-15mg/ml。優(yōu)選的每20ml的酶溶液中褐藻膠和明膠的含量分別為10mg和200mg。
乙醇檢測試劑條最終是通過TMB的顯色來判斷乙醇的含量，此反應體系中TMB的用量直接導致反應后的顏色的不同，如果使用大劑量的TMB，則結果顯示從綠色到藍色，與乙醇濃度呈比例的梯度變化，如果使用小劑量的TMB，高濃度乙醇顯示為棕色或黑色，而低濃度則顯示為藍色。本發(fā)明根據(jù)我國有關乙醇含量的規(guī)定，調(diào)整了TMB的量，使顯色結果明顯區(qū)分0，0.2，0.8，1.5和3.0mg/ml，從而制備了用于乙醇檢測的標準比對卡。
本發(fā)明的另外目的在于提供一種用于檢測唾液中乙醇含量的試劑盒，該試劑盒包括上述試劑條，標準比對卡和和反應終止液，所述的反應終止液為重量百分比濃度為0.2％的SDS(十二烷基磺酸鈉)溶液。
TMB(N，N，N’，N’-四甲基聯(lián)苯胺)是一種非致癌性顯色劑，經(jīng)過氧化物酶作用后，約40分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時可消退至無色。SDS是酶的抑制劑，可以使反應終止，而且使顏色維持12-24小時不褪，是肉眼判斷的良好終止劑。本產(chǎn)品配備SDS終止劑后，檢測結果在24小時后沒有發(fā)生改變，十分有利于現(xiàn)場物證的保存。
本產(chǎn)品具有以下特點1.高度的熱穩(wěn)定性，便于常溫下使用和保存。本發(fā)明的產(chǎn)品在常溫下可以保存一年，在50℃下可以保存24小時以上，其檢測的靈敏度仍可以達到0.1mg/ml。與國外的其它同類產(chǎn)品進行比較，國外產(chǎn)品在50℃高溫下都只能保存1-3小時。
2.靈敏度高，本試紙條的靈敏度可以達到0.1mg/ml。并且不產(chǎn)生假陽性。
3.反應速度快。在20秒鐘就可以完成一個人份的檢測。
4.色差好。不但陰性和陽性0.2mg/ml的樣品存在明顯的顏色不同，而且憑肉眼也能很容易判斷0.2mg/ml和0.8mg/ml的色差。
5.標本多樣化。根據(jù)使用者的需要，本產(chǎn)品可以用來檢測尿液或其它體液或滲出物中的乙醇濃度，雖然顯色與唾液略有不同，但同樣可以明顯區(qū)分陰性(0.0O)和陽性(0.4mg/ml)和0.8mg/ml的色差。(尿液中的乙醇濃度高于唾液中的濃度)通過下表中可見本發(fā)明的乙醇測試條的特點表1唾液乙醇含量測試條與呼氣檢測議的比較

具體實施方式
實施例1制備檢測試劑條
①配制乙醇氧化酶和辣根過氧化物酶溶液取褐藻膠10mg，乙醇氧化酶500單位，辣根過氧化物2500單位，明膠200mg溶于10ml pH7.2的1M Tris-丙二酸緩沖液中，再加10ml的雙蒸水。
②配制TMB溶液稱取400mgTMB鹽酸鹽溶于20ml的雙蒸水中，用0.1ml的10mg/ml鹽酸色氨酸進行脫色處理，再加入20ml的二甲苯，用NaOH中和其中的鹽酸?；旌虾骉MB溶于二甲苯，靜置后溶液分層，棄去水溶液。得到TMB/二甲苯溶液。
③酶和底物的固相化將0.5CM寬的濾紙浸入以上的酶混合液中，取出濾紙在30℃熱風、避光下干燥20分鐘。將TMB/二甲苯溶液均勻地滴在已干燥的濾紙上，再經(jīng)30℃熱風、避光下干燥20分鐘。
④制備試劑條把干燥后的濾紙貼在單面含膠的白色聚酯板的前端，用切紙機切成寬0.5cm的長條，即制成檢測試劑條。
然后將該試劑條、標準比色卡和反應終止液配成試劑盒。
實施例2試劑條現(xiàn)場檢測結果1.唾液乙醇檢測試劑條與氣相色譜頂空法血液檢測數(shù)據(jù)的比較派發(fā)試劑條在上海市4個交警支隊進行推廣應用，進行現(xiàn)場測試，所有測試的結果與氣相色譜頂空法(GC/MS)檢測比較。結果顯示，唾液乙醇檢測試劑條檢測結果與血液中氣相色譜頂空法檢測基本相符。準確率為98.0％。
2.樣品收集方式1)將測試條直接放入嘴中，等10秒鐘后取出，觀察顏色變化；或2)將唾液吐入檢測器皿中。
權利要求
1.一種檢測唾液中乙醇含量的試劑條，其特征在于該試劑條是由以下方法制備成的①配制乙醇氧化酶和辣根過氧化物酶溶液活性單位比為1∶2-10的乙醇氧化酶與辣根過氧化物，溶于pH 7.2的1MTris-丙二酸緩沖液中，使每毫升緩沖液中酶的總活性單位為150-550，再加與緩沖液等體積的水；②配制TMB/二甲苯溶液將TMB鹽酸鹽溶于水中，配制成10-30mg/ml的水溶液，用10mg/ml的鹽酸色氨酸進行脫色處理，然后加入與TMB鹽酸鹽水溶液等體積的二甲苯，用NaOH中和其中的鹽酸；溶液靜置后分層，棄去水溶液，得到TMB/二甲苯溶液；③酶和底物的固相化將濾紙浸入①的酶混合液中，取出濾紙干燥；將TMB/二甲苯溶液滴在已干燥的濾紙上，干燥；④制備試劑條把干燥后的濾紙貼在單面含膠的白色聚酯板的前端，用切紙機切成長條，即制成檢測試劑條。
2.根據(jù)權利要求1所述的試劑條，其特征在于步驟①中的乙醇氧化酶和辣根過氧化物酶溶液中還含有褐藻膠和明膠，其中酶溶液中褐藻膠的含量為0.25-0.75mg/ml，明膠含量為5-15mg/ml。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的試劑條，其特征在于步驟②中，TMB鹽酸鹽溶于水中的含量為20mg/ml。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的試劑條，其特征在于步驟③中浸入酶混合液后的濾紙在30℃熱風、避光下干燥20分鐘；滴過TMB/二甲苯溶液的已干燥濾紙再經(jīng)30℃熱風、避光下干燥20分鐘。
5.一種制備權利要求1所述的試劑條的方法，其特征在于該方法包括如下步驟①配制乙醇氧化酶和辣根過氧化物酶溶液活性單位比為1∶2-10的乙醇氧化酶與辣根過氧化物，溶于pH 7.2的1MTris-丙二酸緩沖液中，使每毫升緩沖液中酶的總活性單位為150-550，再加與緩沖液等體積的水；②配制TMB/二甲苯溶液將TMB鹽酸鹽溶于水中，配制成10-30mg/ml的水溶液，用10mg/ml的鹽酸色氨酸進行脫色處理，然后加入與TMB鹽酸鹽水溶液等體積的二甲苯，用NaOH中和其中的鹽酸；溶液靜置后分層，棄去水溶液，得到TMB/二甲苯溶液；③酶和底物的固相化將濾紙浸入①的酶混合液中，取出濾紙干燥；將TMB/二甲苯溶液滴在已干燥的濾紙上，干燥；④制備試劑條把干燥后的濾紙貼在單面含膠的白色聚酯板的前端，用切紙機切成長條，即制成檢測試劑條。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于步驟①中的乙醇氧化酶和辣根過氧化物酶溶液中還含有褐藻膠和明膠，其中酶溶液中褐藻膠的含量為0.25-0.75mg/ml，明膠含量為5-15mg/ml。
7.根據(jù)權利要求5或6所述的方法，其特征在于步驟②中，TMB鹽酸鹽溶于水中的含量為20mg/ml。
8.根據(jù)權利要求5或6所述的方法，其特征在于步驟③中浸入酶混合液后的濾紙在30℃熱風、避光下干燥20分鐘；滴過TMB/二甲苯溶液的已干燥濾紙再經(jīng)30℃熱風、避光下干燥20分鐘。
9.一種檢測唾液中乙醇含量的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括權利要求1所述的試劑條、標準比對卡和反應終止液，所述的反應終止液為重量百分比濃度為0.2％的SDS溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測唾液中乙醇含量的試劑條和試劑盒，通過試劑條中乙醇氧化酶、過氧化物酶將N，N，N’，N’－四甲基聯(lián)苯胺氧化后顏色改變的深淺，半定量地檢測唾液中乙醇的含量。該方法簡便、易攜帶，靈敏度高、反應速度快、穩(wěn)定性高，尤其適合現(xiàn)場檢測。
文檔編號G01N33/52GK1904619SQ200610029610
公開日2007年1月31日 申請日期2006年8月1日 優(yōu)先權日2006年8月1日
發(fā)明者吳獻斌, 胡小龍, 王學生, 黃建東, 張艷, 顧琳, 周華山 申請人:上海唯卓生物科技有限公司