專(zhuān)利名稱(chēng)：生物液體的蛋白質(zhì)組分析的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及生物液體的蛋白質(zhì)組鑒定，及其在確定母體/胎兒癥狀的狀態(tài)中的用途，該癥狀包括胎兒來(lái)源的母體癥狀，染色體非整倍性，以及與胎兒生長(zhǎng)和成熟相關(guān)的胎兒疾病。特別地，本發(fā)明涉及鑒定羊水的蛋白質(zhì)組(代表羊水組成的多種蛋白質(zhì))和正常的蛋白質(zhì)組的特征性變化與各種病理性母體/胎兒癥狀的相關(guān)性，這些癥狀例如羊膜內(nèi)感染，或染色體缺陷.
相關(guān)技術(shù)的描述蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)表達(dá)模式的大規(guī)模分析作為當(dāng)前DNA克隆方法和基因表達(dá)圖譜(gene profiling)方法的一種重要和必要的工具出現(xiàn)(Pandey和Mann，Nature405837-46(2000))。在根據(jù)同源性方法推導(dǎo)一些結(jié)構(gòu)和可能的蛋白質(zhì)修飾中，DNA序列信息是有用的，但是，不會(huì)提供關(guān)于在翻譯后修飾、蛋白質(zhì)水解或區(qū)室化(compartmentalization)中的蛋白質(zhì)功能調(diào)控的信息。
傳統(tǒng)的基于凝膠的方法，例如一維和二維的凝膠電泳用于小規(guī)模的蛋白質(zhì)檢測(cè)(＜1,000種蛋白質(zhì))，但是這些方法需要大的樣本量(Lilley KS，Razzaq A，Dupree PTwo-dimensional gel electrophoresisrecent advances insample preparation，detection and quantitation.Curr Opin Chem Biol.6(1)46-50，2002)。用于克服這種缺陷的方法包括基質(zhì)輔助或增大表面的激光吸附/電離(MALDI或SELDI)飛行時(shí)間(time-of-flight)質(zhì)譜，該方法能夠精確地生成顯示樣本中蛋白質(zhì)的質(zhì)量的圖譜。這些圖譜或模式用于鑒定和監(jiān)控各種疾病。將肽作圖與串聯(lián)質(zhì)譜分析結(jié)合，獲得第二水平的鑒定，從肽片段上獲得氨基酸序列信息。這可以例如通過(guò)將MALDI/SELDI或者ESI與四級(jí)(quadrupole)時(shí)間飛行MS(Qq-TOF MS)結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。后一種方法還可以用于量化特定肽(ICAT技術(shù))。
病理性母體/胎兒癥狀的診斷有許多病理性母體的和胎兒癥狀，例如羊膜內(nèi)感染(IAI)，先兆子癇，早產(chǎn)與分娩，染色體非整倍性，都會(huì)在懷孕過(guò)程中產(chǎn)生，包括健康狀況(well-being)，或者有時(shí)威脅母體和/或胎兒或者新生兒的生命。對(duì)這種癥狀進(jìn)行早期診斷，對(duì)于進(jìn)行及時(shí)治療和介入是關(guān)鍵的。不幸的是，對(duì)這些癥狀的大部分進(jìn)行早期診斷是困難的，因?yàn)榕R床信號(hào)和癥狀出現(xiàn)較晚，并且通常是非特異性的和不一致的。例如，IAI的臨床癥狀通常包括母體發(fā)熱和白血球增多，但是這些癥狀通常出現(xiàn)較晚，不靈敏，也不特異。因此，Gravett等，Am.J.Obstet.Gynecol.1711660-7(1994)中利用非人類(lèi)的靈長(zhǎng)類(lèi)模型，證明了在用B組鏈球菌感染進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性羊膜內(nèi)感染后，僅在感染誘導(dǎo)的早產(chǎn)(preterm labor)開(kāi)始的50％的時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)發(fā)熱和白血球增多，在實(shí)驗(yàn)性感染后的28-40小時(shí)中發(fā)生。因此，為了避免診斷延誤，應(yīng)保證高的懷疑指數(shù)和適當(dāng)采用輔助性實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。通常用于診斷IAI的臨床標(biāo)準(zhǔn)包括母體發(fā)熱(＞37.8℃)，以及如下的兩種或多種母體白血球增多(＞15,000/mm3)，母體或胎兒心動(dòng)過(guò)速，子宮疼痛(uterine tenderness)，渾濁惡臭的羊水(foul-smelling amniotic fluid)。
由于臨床特征間存在矛盾，用其他的輔助性實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)來(lái)輔助IAI診斷。這些檢測(cè)包括測(cè)量母體C-反應(yīng)活性蛋白，直接檢測(cè)羊水中白血球或，革蘭氏染色、羊水培養(yǎng)物的細(xì)菌，測(cè)量羊水葡萄糖濃度，檢測(cè)羊水中的白血球酯酶，通過(guò)氣液層析檢測(cè)細(xì)菌性有機(jī)酸羊水白血球，測(cè)量各種羊水或者陰道細(xì)胞因子(例如，白細(xì)胞介素2，4，6，粒細(xì)胞菌落刺激因子和腫瘤壞死因子-α)，基質(zhì)金屬蛋白酶-9，乳鐵傳遞蛋白和通過(guò)超聲波評(píng)價(jià)胎兒活性(生物物理表現(xiàn))。測(cè)量細(xì)胞因子或者其他生物化學(xué)因子是昂貴的，通常不能在臨床上使用，主要是作為一種研究工具。此外，這些檢測(cè)的檢測(cè)效率并不總是一貫地高于傳統(tǒng)檢測(cè)，例如羊水革蘭氏染色和培養(yǎng)，羊水葡萄糖濃度，和檢測(cè)羊水白血球酯酶。先前已經(jīng)對(duì)這些檢測(cè)的效率進(jìn)行廣泛的評(píng)述。(Ohlsson，A.和Wang，E.An analysis of antenatal tests to detect infection atpreterm rupture of the membranes.American Journal of Obstetrics andGynecology 162809，1990)。盡管所有檢測(cè)都具有合理的靈敏度、特異性和預(yù)測(cè)值，但是這些檢測(cè)都不具有作為在IAI診斷中獨(dú)立于臨床特征而使用的充足靈敏度或特異性。
因此，迫切需要可以及早和正確地檢測(cè)IAI和其他病理性母體/胎兒癥狀的新方法。
特別期望開(kāi)發(fā)新的、有效和可靠的非侵入性方法，用于診斷染色體非整倍性。目前，在母體血清篩查和超聲波檢查后，對(duì)染色體非整倍性的最后診斷需要進(jìn)行中間持續(xù)三個(gè)月的遺傳羊水診斷。這是一種侵入性過(guò)程，伴隨0.5％的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。此外，羊水細(xì)胞的染色體分析高強(qiáng)度和費(fèi)時(shí)的過(guò)程，需要2周時(shí)間。因此，需要可靠的檢測(cè)，以改善對(duì)母體血清或其他生物液體的染色體非整倍性的檢測(cè)，減少母體篩查的不可接受的高假陽(yáng)性，提高對(duì)羊水診斷后的羊水的診斷速度和效率。通過(guò)超聲波或者傳統(tǒng)的母體血清篩查進(jìn)行篩查，會(huì)完全遺漏其他病理性非整倍性的癥狀，例如Klinefelter綜合癥和Turner綜合癥。
發(fā)明概述本發(fā)明提供非侵入性的和靈敏的方法，通過(guò)生物液體的蛋白質(zhì)組分析，用以早期診斷、預(yù)后和監(jiān)控病理性的胎兒/母體癥狀。
本發(fā)明還提供生物液體如羊水和母體血清的蛋白質(zhì)組圖譜，使得可以診斷、預(yù)后和監(jiān)控各種病理性的胎兒/母體癥狀，包括但是不限于，羊膜內(nèi)感染(IAI)，染色體非整倍性，和與胎兒生長(zhǎng)和成熟相關(guān)的胎兒疾病。特別地，本發(fā)明提供IAI和染色體非整倍性的正常的和病理性的蛋白質(zhì)組圖譜。確定正常的蛋白質(zhì)組圖譜是極其重要的，該圖譜能夠消除質(zhì)疑(陰性診斷結(jié)果)中的胎兒/母體癥狀，使得受試者不需要遭受不必要的和可能危險(xiǎn)的處理或介入。
本發(fā)明還提供確定各種胎兒或母體癥狀(condition)的存在和狀態(tài)的特定生物標(biāo)記，這些癥狀例如IAI和染色體非整倍性，當(dāng)存在這種病理性的癥狀時(shí)，這些標(biāo)記在生物液體例如羊水或母體血清中差別地被表達(dá)。這種生物標(biāo)記和結(jié)合到該生物標(biāo)記上的抗體，可以例如在蛋白質(zhì)或抗體陣列上呈遞，其可用于樣本的、非侵入性診斷分析中。
一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于確定母體或胎兒癥狀的狀態(tài)的方法，包括比較從哺乳動(dòng)物受試者獲得的生物液體的檢測(cè)樣本的蛋白質(zhì)組圖譜與正常樣本的蛋白質(zhì)組圖譜，或者參考蛋白質(zhì)組圖譜比較，該參考圖譜至少包含一種這種癥狀的獨(dú)特表達(dá)特征(signature)表征。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物受試者是懷孕的雌性，優(yōu)選為靈長(zhǎng)類(lèi)或人。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，母體癥狀選自子宮內(nèi)感染、先兆子癇或早產(chǎn)(preterm labor)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，胎兒情況(condition)選自染色體非整倍性，先天性畸形，妊娠年齡或胎兒成熟，其中染色體非整倍性可以是Down綜合癥，三體性-13，三體性-18，Turner綜合癥或Klinefelter綜合癥。
任何生物液體可用于實(shí)施本發(fā)明的方法，包括，但是不限于，羊水、血清、血漿、尿液、腦脊髓液、乳汁、粘液和唾液，優(yōu)選為羊水或母體血清。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)樣本的蛋白質(zhì)組圖譜包括至少兩種蛋白質(zhì)的信息，或至少5種蛋白質(zhì)，或至少10種蛋白質(zhì)，至少20種蛋白質(zhì)，至少50種蛋白質(zhì)的信息。
在特定實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)組圖譜是質(zhì)譜。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，質(zhì)譜在其3-5kDa范圍內(nèi)包括至少一種獨(dú)特的表達(dá)特征。
在還有另一個(gè)實(shí)施方案中，質(zhì)譜在其10-12kDa范圍內(nèi)包括至少一種獨(dú)特的表達(dá)特征。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，母體癥狀為羊膜內(nèi)感染，而獨(dú)特的表達(dá)特征為檢測(cè)樣本中的，10-11kDa分子量范圍內(nèi)的額外峰值，這指示羊膜內(nèi)感染。
在不同實(shí)施方案中，通過(guò)Western印跡分析生成蛋白質(zhì)組圖譜(profile)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物液體是人的液體，蛋白質(zhì)組圖譜包括一種或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)信息，該蛋白質(zhì)選自巨噬細(xì)胞加帽蛋白、嗜中性白細(xì)胞明膠酶相關(guān)的lipocalin，髓過(guò)氧化物酶；L-網(wǎng)素(plastin)；azurocidin；抗菌蛋白FALL-39；Gp340變體蛋白；Ebner唾液腺蛋白同源物(GenBank登錄號(hào)355392)；白血球彈性蛋白酶抑制劑；鈣粒蛋白A；鈣粒蛋白B；絲切蛋白(cofilin)；膜突蛋白；抑制蛋白I，cronin樣蛋白p57；膜聯(lián)蛋白II，纖連蛋白；神經(jīng)膠質(zhì)來(lái)源的連接蛋白；抗凝血酶III；鱗片狀上皮細(xì)胞(squamous cell)癌抗原1，鱗片狀上皮細(xì)胞癌抗原2；絲氨酸蛋白酶抑制劑12；半胱氨酸蛋白酶抑制劑A；半胱氨酸蛋白酶抑制劑B；半胱氨酸蛋白酶抑制劑C；IGFBP-1；維生素D-結(jié)合蛋白；載脂蛋白A-I；14-3-3蛋白σ(sigma)；14-3-3蛋白ζ/δ(zeta/delta)；凝膠溶膠蛋白；乳運(yùn)鐵蛋白；磷酸甘油酸激酶1；磷酸甘油酸變位酶1；或轉(zhuǎn)酮醇酶；或其片段、前體或天然存在的變體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)組圖譜包括一種或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)信息，該蛋白質(zhì)選自巨噬細(xì)胞加帽蛋白；嗜中性白細(xì)胞明膠酶相關(guān)的lipocalin；髓過(guò)氧化物酶；L-網(wǎng)素；azurocidin；抗菌蛋白FALL-39；白血球彈性蛋白酶抑制劑；鈣粒蛋白A；鈣粒蛋白B；抑制蛋白I，神經(jīng)膠質(zhì)來(lái)源的連接蛋白；絲氨酸蛋白酶抑制劑12；半胱氨酸蛋白酶抑制劑A或IGFBP-1；或其片段、前體或天然存在的變體。
前述的方法適合用于診斷各種胎兒和母體的癥狀，包括，但是不限于，羊膜內(nèi)感染，發(fā)育缺陷，包括器官系統(tǒng)的缺陷，肌與骨骼畸形，由染色體非整倍性產(chǎn)生的癥狀，例如Down綜合癥，三體性(trisomy)-13，三體性-18，Turner綜合癥，或Klinefelter綜合癥。
如果檢測(cè)樣本的蛋白質(zhì)組圖譜實(shí)質(zhì)上與正常樣本的蛋白質(zhì)組圖譜相同，可以確定受試者不具有母體或胎兒病癥。
如果蛋白質(zhì)組圖譜實(shí)質(zhì)上含有與患病樣本相同的獨(dú)特表達(dá)特征，該患者被診斷為患有相應(yīng)的母體或胎兒病癥。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于診斷羊膜內(nèi)感染的方法，包括(a)將生物液體的檢測(cè)樣本的蛋白質(zhì)組圖譜與正常樣本的蛋白質(zhì)組圖或者參考蛋白質(zhì)組圖譜比較，該生物液體從懷孕的雌性哺乳動(dòng)物中獲得，其中該蛋白質(zhì)組圖譜提供存在于樣本中的蛋白質(zhì)或其蛋白質(zhì)水解片段的質(zhì)量的信息；和(b)如果檢測(cè)樣本的蛋白質(zhì)組圖譜具有處于3-5和/或10-12Kda分子量范圍內(nèi)的獨(dú)特表達(dá)特征，則診斷哺乳動(dòng)物患有羊膜內(nèi)感染。
在還有一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于診斷羊膜內(nèi)感染的方法，包括(a)將生物液體的檢測(cè)樣本的蛋白質(zhì)組圖譜與正常樣本的蛋白質(zhì)組圖譜比較，該生物液體從懷孕的雌性哺乳動(dòng)物中獲得；和(b)如果至少一種選自IGFB-1，抑制蛋白，血漿銅藍(lán)蛋白，L-網(wǎng)素和鈣粒蛋白，或其片段、前體或天然存在的變體的蛋白在檢測(cè)樣本中相對(duì)于正常樣本差別性地表達(dá)，則診斷哺乳動(dòng)物患有羊膜內(nèi)感染。
一個(gè)特定實(shí)施方案中，至少I(mǎi)GFBP-1，抑制蛋白，血漿銅藍(lán)蛋白，和鈣粒蛋白，或其片段、前體或天然存在的變體之一在檢測(cè)樣本中相對(duì)于正常樣本被過(guò)度表達(dá)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于正常樣本，L-網(wǎng)素在檢測(cè)樣本中過(guò)低表達(dá)。
在還有另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)確定如附

圖12所示蛋白質(zhì)水解片段或其片段來(lái)檢測(cè)IGFBP-1的存在。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及診斷染色體非整倍性的方法，包括(a)將生物液體的檢測(cè)樣本的蛋白質(zhì)組圖譜與正常樣本的蛋白質(zhì)組圖譜或者參考蛋白質(zhì)組圖譜比較，該生物液體從懷孕的雌性哺乳動(dòng)物中獲得，其中該蛋白質(zhì)組圖譜提供存在于樣本中的蛋白質(zhì)或其蛋白質(zhì)水解片段的質(zhì)量(mass)的信息；和(b)如果檢測(cè)樣本的蛋白質(zhì)組圖譜具有處于4-15Kda分子量范圍內(nèi)的獨(dú)特表達(dá)特征，則診斷哺乳動(dòng)物患有羊膜內(nèi)感染。
在不同方面，本發(fā)明涉及用于診斷胎兒發(fā)育缺陷的方法，包括(a)將生物液體的檢測(cè)樣本的蛋白質(zhì)組圖譜與正常樣本的蛋白質(zhì)組圖譜或者參考蛋白質(zhì)組圖譜比較，該生物液體從懷孕的雌性哺乳動(dòng)物中獲得；和(b)如果至少一種肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)蛋白或其片段、前體或天然存在的變體在檢測(cè)樣本中相對(duì)于正常樣本被差別地表達(dá)，則確定存在發(fā)育缺陷。
在本方法的特定實(shí)施方案中，肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)蛋白選自膜突蛋白，p57，凝溶膠蛋白，和14-3-3蛋白。
在還有一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于診斷母體或胎兒感染或者免疫反應(yīng)相關(guān)的異常的方法，包括(a)將生物液體的檢測(cè)樣本的蛋白質(zhì)組圖譜與正常樣本的蛋白質(zhì)組圖譜或者參考蛋白質(zhì)組圖譜比較，該生物液體從懷孕的雌性哺乳動(dòng)物中獲得；和(b)如果至少一種蛋白在檢測(cè)樣本中相對(duì)于正常樣本差別性地表達(dá)，該蛋白選自巨噬細(xì)胞加帽(capping)蛋白(MCP)，白血球彈性蛋白酶，嗜中性白細(xì)胞明膠酶相關(guān)lipcalcin(NGAL)，髓過(guò)氧化物酶，L-網(wǎng)素，鈣粒蛋白，F(xiàn)ALL-39，azyrocidin(CAP37)，蛋白酶和蛋白酶抑制劑，則確定存在母體或胎兒感染或者免疫反應(yīng)相關(guān)的異常。
在還有另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于診斷新生兒膿毒癥的方法，包括檢測(cè)從懷孕雌性哺乳動(dòng)物獲得的生物液體的蛋白質(zhì)組圖譜中是否存在Gp-340。
在還有另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及生物液體的蛋白質(zhì)組圖譜，包含一種或多種蛋白的信息，該蛋白選自巨噬細(xì)胞加帽(capping)蛋白，嗜中性白細(xì)胞明膠酶相關(guān)的lipocalin，髓過(guò)氧化物酶；L-網(wǎng)素；azurocidin；抗菌蛋白FALL-39；Gp340變體蛋白；Ebner唾液腺蛋白同源物(GenBank登錄號(hào)355392)；白血球彈性蛋白酶抑制劑；鈣粒蛋白A；鈣粒蛋白B；絲切蛋白(cofilin)；膜突蛋白；抑制蛋白I，cronin樣蛋白p57；膜聯(lián)蛋白II，纖連蛋白(fibronectin)；神經(jīng)膠質(zhì)來(lái)源的連接蛋白；抗凝血酶-III；鱗片狀上皮細(xì)胞癌抗原1，鱗片狀上皮細(xì)胞癌抗原2；絲氨酸蛋白酶抑制劑12；半胱氨酸蛋白酶抑制劑A；半胱氨酸蛋白酶抑制劑B；半胱氨酸蛋白酶抑制劑C；IGFBP-1；維生素D-結(jié)合蛋白；載脂蛋白A-1；14-3-3蛋白σ；14-3-3蛋白ζ/δ；凝溶膠蛋白；乳運(yùn)鐵蛋白；磷酸甘油酸激酶1；磷酸甘油酸變位酶1；和轉(zhuǎn)酮酶(transketolase)；或其片段、前體或天然存在的變體。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及生物液體的蛋白質(zhì)組圖譜，包含一種或多種蛋白的信息，該蛋白選自巨噬細(xì)胞加帽蛋白；嗜中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)lipocalin；髓過(guò)氧化物酶；L-網(wǎng)素；azurocidin；抗菌蛋白FALL-39；白血球彈性蛋白酶抑制劑；鈣粒蛋白A；鈣粒蛋白B；抑制蛋白I，神經(jīng)膠質(zhì)來(lái)源的連接蛋白；絲氨酸蛋白酶抑制劑12；半胱氨酸蛋白酶抑制劑A；或IGFBP-1；或其片段、前體或天然存在的變體。
本發(fā)明還涉及羊膜內(nèi)感染的生物液體的蛋白質(zhì)組圖譜，包括確認(rèn)是否存在選自IGFB-1，抑制蛋白，血漿銅藍(lán)蛋白，L-網(wǎng)素或鈣粒蛋白的蛋白質(zhì)的信息。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及羊膜內(nèi)感染的生物液體的蛋白質(zhì)組圖譜，表現(xiàn)為提供存在于生物液體中的蛋白質(zhì)或其蛋白質(zhì)水解片段的分子量信息，包括在3-5KDa和/或10-12KDa分子量范圍內(nèi)的獨(dú)特表達(dá)特征信息。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及基本上如附圖1A-1C任何之一所示的、或者基本上如附圖2A-C任何之一所示的、或者基本上如附圖3A-C任何之一所示的、或者基本上如附圖4A或4B所示的、或者基本上如附圖6-10任何之一所示的蛋白質(zhì)組圖譜。
在特定實(shí)施方案中，以微陣列形式分析蛋白質(zhì)組圖譜。
附圖簡(jiǎn)介附圖1A-C.靈長(zhǎng)類(lèi)羊水中的感染誘導(dǎo)的差別性的蛋白質(zhì)表達(dá)。/SELDI-TOF分析結(jié)合到化學(xué)定義的常相(Normal phase)芯片陣列上的羊水提取物。A)在235激光強(qiáng)度下收集的整個(gè)光譜顯示了峰值強(qiáng)度的差別。B)詳細(xì)光譜顯示了對(duì)照和感染組在約10-12KDa區(qū)域的差別。C)詳細(xì)光譜顯示了對(duì)照和感染組在約3-5KDa區(qū)域的差別。實(shí)線用于表示表達(dá)中的顯著差別(獨(dú)特的表達(dá)特征)，這可用于開(kāi)發(fā)診斷性的檢測(cè)。
附圖2A-C.時(shí)程(time course)分析靈長(zhǎng)類(lèi)羊水對(duì)感染的反應(yīng)(GBS)。在接種細(xì)菌之前和在感染后連續(xù)收集羊水，并如下所述進(jìn)行SELDI-TOF分析。附圖2A感染前；2B感染后12小時(shí)；2C感染后36小時(shí)。
附圖3A-C.人羊水中的感染誘導(dǎo)的差別性蛋白質(zhì)表達(dá)。SELDI-TOF分析結(jié)合到化學(xué)定義的Normal Phase芯片陣列上的羊水提取物。A)在235激光強(qiáng)度下收集的整個(gè)光譜顯示了峰值強(qiáng)度的差別。B)詳細(xì)光譜顯示了對(duì)照和感染組在約10-12KDa區(qū)域的差別。C)詳細(xì)光譜顯示了對(duì)照和感染組在約3-5KDa區(qū)域的差別。
附圖4A和4B.用普通(generic)MALDI-TOF質(zhì)譜分析儀獲得的質(zhì)譜，使用來(lái)自人羊水A)對(duì)照，未發(fā)生子宮內(nèi)感染，和B)樣本，發(fā)生子宮內(nèi)感染。
附圖5.SDS-PAGE考馬斯藍(lán)染色凝膠。A)匯集的4種人對(duì)照AF樣本；B)單一的對(duì)照AF樣本；C)匯集的4種人的被感染AF樣本；D)單一的被感染AF樣本。
附圖6.檢測(cè)人羊水中的差別性蛋白質(zhì)表達(dá)。A)對(duì)照AF樣本(匯集的)；B)被感染的AF樣本(匯集的)。
附圖7.檢測(cè)人羊水中的差別性蛋白質(zhì)表達(dá)。A)對(duì)照AF樣本(匯集的)；B)被感染的AF樣本(匯集的)。
附圖8顯示對(duì)人羊水和母體血清中的差別性蛋白質(zhì)表達(dá)。A)對(duì)照樣本(匯集的)；B)被感染的樣本(匯集的)。
附圖9顯示用蛋白質(zhì)陣列(arrays)檢測(cè)母體血清中的差別性表達(dá)的蛋白質(zhì)。1)蛋白質(zhì)陣列的偽彩色(pseudocolor)圖像顯示相應(yīng)蛋白與其抗體結(jié)合；2)放大的陣列區(qū)域；3)鈣粒蛋白IP的Western印跡。
附圖10顯示母體血清中的差別性蛋白質(zhì)表達(dá)模式，用獨(dú)特的模式辨別三體性。
附圖11.重新鑒定羊水蛋白的蛋白質(zhì)序列(de novo protein sequence)的示意圖。PRO1_HUMAN(P07737)抑制蛋白I(SEQ ID NOs5-11)。
附圖12.IGFBP-1的重新鑒定和蛋白質(zhì)水解片段序列(SEQ ID NO1)。Ms/MS確定的存在于樣本0426se_H1_12和0425se_H1_13的肽序列顯示在小寫(xiě)(lower case)中(SEQ ID NOs2和3)。這些肽序列來(lái)自感染的羊水，用胰蛋白酶消化，在凝膠條帶上電泳，并進(jìn)行MS/MS分析。在對(duì)來(lái)自感染的羊水的用胰蛋白酶消化后的～10.5-12Kda條帶進(jìn)行1-D凝膠電泳(小分子量范圍，附圖5)、Western印跡(附圖6)和MS/MS分析(附圖13)，檢測(cè)到IGF-BP-1的蛋白質(zhì)水解片段，其存在于下劃線序列的區(qū)域中(SEQ ID NO4)。
附圖13.來(lái)自感染的羊水的～10.5-11KD的胰蛋白酶消化ID凝膠條帶的LCQ-MS圖譜。LCQ-MS表明在樣本中存在親本的離子呈遞潛能蛋白(ionsrepresenting potential protein)。
附圖14.附圖13中的17.55-18.21分鐘保持(retention)時(shí)間的峰值的質(zhì)譜。
附圖15.附圖14中顯示的434.9峰值的親本離子的MSIMS圖譜。
附圖16.IAI的生物標(biāo)記免疫檢測(cè)。16a)靈長(zhǎng)類(lèi)對(duì)照(-)和被感染的(+)AF。16b)人對(duì)照(-)和被感染的(+)AF。16c)人對(duì)照(-)和被感染的(+)AF。維生素D結(jié)合蛋白(VDBP)未被調(diào)節(jié)(unregulate)的對(duì)照標(biāo)記。IGFBP-1條帶呈現(xiàn)完整的蛋白質(zhì)(-30kDa)和蛋白質(zhì)水解片段(-11kDa)。16d)免疫沉淀檢測(cè)匯集母體血清中的IGFBP1。對(duì)照(-)和被感染的(+)血清。16e)免疫沉淀檢測(cè)匯集的母體血清中鈣粒蛋白B。對(duì)照(-)和被感染的(+)血清。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述A.定義除非另外定義，在此所用的科技術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解相同的含義。對(duì)于在本申請(qǐng)中所使用的許多術(shù)語(yǔ)，Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第2版，J.Wiley & Sons(紐約，NY 1994)給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供全面的教導(dǎo)。
術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)組”用于此是描述在特定時(shí)間內(nèi)，生物樣本中的蛋白質(zhì)的重要部分。蛋白質(zhì)組的概念從根本上區(qū)別于基因組?；蚪M實(shí)質(zhì)上是靜止的，而蛋白質(zhì)組對(duì)內(nèi)部和外部事件相應(yīng)時(shí)，持續(xù)地發(fā)生改變。
術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)組圖譜”用于此是指在特定時(shí)間內(nèi)，生物樣本如生物液體中的大量蛋白質(zhì)的表達(dá)圖譜的表示。蛋白質(zhì)組圖譜可以如被表示為質(zhì)譜，但是還可以包括基于蛋白質(zhì)的物理化學(xué)或生物化學(xué)特征的其他表示方法。因此，蛋白質(zhì)組圖譜可以例如基于蛋白質(zhì)的電泳特征的差別，通過(guò)雙向凝膠電泳確定，例如通過(guò)2-D PAGE確定，而且可以被表示為，如雙向凝膠電泳中的大量斑點(diǎn)。即使缺乏被明確鑒定的蛋白質(zhì)時(shí)，差別性表達(dá)圖譜也具有重要的診斷價(jià)值。例如可以通過(guò)免疫印跡，檢測(cè)單個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，用蛋白質(zhì)微陣列檢測(cè)多個(gè)斑點(diǎn)和蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組圖譜通常表示或含有信息，該信息從少數(shù)峰值到表示50個(gè)或更多峰值的復(fù)雜圖譜。因此，例如，蛋白質(zhì)組圖譜含有或表示至少2種，或至少5種或至少10種或至少15種，或至少20種，或至少25種，或至少30種，或至少35種，或至少40種，或至少45種，或至少50種蛋白質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“病理癥狀”以廣義使用，包括所有的變化和現(xiàn)象，包括受試者的健康狀況(well-being)。病理性的母體癥狀包括，但是不限于羊膜內(nèi)感染，胎兒或母體來(lái)源的癥狀和情況，例如，先兆子癇，和早產(chǎn)分娩(preterm labourand delivery)。病理性的胎兒癥狀包括，但是不限于染色體缺陷(非整倍性)，例如Down綜合癥，妊娠年齡(gestational age)和胎兒成熟的所有異常。
術(shù)語(yǔ)“病理性的[母體或胎兒]癥狀的狀態(tài)”以廣義在此使用，是指病理性癥狀的缺乏、存在、程度、階段、性質(zhì)、進(jìn)展或衰退。
術(shù)語(yǔ)“獨(dú)特的表達(dá)特征”用于此來(lái)描述生物樣本(例如，參比樣本)的蛋白質(zhì)組圖譜中的獨(dú)特特征或基序，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地區(qū)別于相應(yīng)的正常生物樣本(從相同類(lèi)型來(lái)源獲得，例如生物液體)的蛋白質(zhì)組圖譜。
術(shù)語(yǔ)“羊膜內(nèi)感染(IAI)”、“羊水感染”、“羊膜炎”(anmionitis)和“臨床絨毛膜羊膜炎(chorioamnionitis)”可以互換使用，是指懷孕過(guò)程中的羊水和子宮內(nèi)容物的急性感染，包括，但是不限于細(xì)菌感染。
“患者反應(yīng)”可以用指示對(duì)患者的益處的任何終點(diǎn)評(píng)價(jià)，包括，而不是限制，(1)抑制病理性癥狀的進(jìn)展，至少在某種長(zhǎng)度上，(2)預(yù)防病理性的癥狀，(3)減輕一種或多種與病理性癥狀相關(guān)的癥狀，至少在某種長(zhǎng)度上；(4)延長(zhǎng)治療后的存活時(shí)間；和/或(5)降低在治療后的特定時(shí)間點(diǎn)的死亡率。
術(shù)語(yǔ)“治療”是指治療性治療和預(yù)防性或防止性措施，其中目的在于阻止或減緩(減輕)所靶向的病理性的癥狀或異常。需要治療的那些癥狀包括已經(jīng)出現(xiàn)異常的那些以及傾向于發(fā)生異常的那些和異常將被阻止的那些。
“先天性畸形”是非遺傳的、但是出生就有的畸形。
B.詳細(xì)描述本發(fā)明涉及用于根據(jù)母親或胎兒的生物液體的蛋白質(zhì)組圖譜，早期、可靠和非侵入性地檢測(cè)母體和胎兒癥狀的方法和裝置(means)。本發(fā)明利用本領(lǐng)域熟知的蛋白質(zhì)組技術(shù)，被描述在例如如下教科書(shū)中，這些教科書(shū)的內(nèi)容在此被明確地引入作為參考Proteome ResearchNew Frontiers inFunctional Genomics(Principles and Practice)，M.R.Wilkins等，編輯，SpringerVerlag，1007；2-D Proteome Analysis Protocols，Andrew L Link，編輯，HumanaPress，1999；Proteome ResearchTwo-Dimensional Gel Electrophoresis andIdentification Methods(Principles and Practice)，T.Rabilloud編輯，SpringerVerlag，2000；Proteome ResearchMass Spectrometry(Principles and Practice)，P.James編輯，Springer Verlag，2001；Introduction to Proteomics，D.C.Liebler編輯，Humana Press，2002；Proteomics in PracticeA Laboratory Manual ofProteome Analysis，R.Westermeier等人，編輯，John Wiley & Sons，2002。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，許多與在此描述的那些類(lèi)似或相當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧峡捎糜趯?shí)施本發(fā)明。實(shí)際上，本發(fā)明無(wú)論如何不限制于所描述的方法和材料。
1.生物液體中表達(dá)的蛋白質(zhì)和多肽的鑒定按照本發(fā)明，可以用各種本領(lǐng)域已知的方法來(lái)進(jìn)行生物液體的蛋白質(zhì)組分析。
通常，比較不同來(lái)源的樣本的蛋白質(zhì)圖譜(蛋白質(zhì)組圖譜)，這些來(lái)源例如正常的生物液體(正常樣本)和檢測(cè)生物液體(檢測(cè)樣本)，檢測(cè)在一種疾病中被上調(diào)或下調(diào)的蛋白質(zhì)。然后，切取這些蛋白質(zhì)，用于鑒定和完全表征，例如采用肽質(zhì)量指紋識(shí)別和/或質(zhì)譜分析和測(cè)序方法，或者正常的和/或疾病特異性的蛋白質(zhì)組圖譜被直接用于診斷感興趣的疾病，或者用于證實(shí)這種疾病的存在與否。
在比較分析中，用完全相同的方式處理正常和檢測(cè)樣本是重要的，以恰當(dāng)?shù)爻蔬f(represent)相對(duì)豐富的蛋白質(zhì)，獲得精確的結(jié)果?？偟鞍踪|(zhì)的所需量將取決于所用的分析技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。通常通過(guò)雙向凝膠電泳(2-DE)，根據(jù)pI和分子量分離存在于生物樣本中蛋白質(zhì)。首先用等電聚焦(一向凝膠電泳)，根據(jù)其電荷分離蛋白質(zhì)。該步驟可以用例如固定的Ph梯度(IPG)條帶來(lái)進(jìn)行，該條帶可以購(gòu)買(mǎi)得到。第二向(dimension)是常規(guī)的SDS-PAGE分析，其中聚焦IPG條帶用作樣本。在進(jìn)行2-DE分離后，用傳統(tǒng)染料可視化蛋白質(zhì)，例如考馬斯藍(lán)或者銀染色，用已知技術(shù)和設(shè)備產(chǎn)生圖像，例如，Bio-Rad GS800顯像密度計(jì)和PDQUEST軟件，它們都可以購(gòu)買(mǎi)得到。然后，從凝膠上切取單獨(dú)的斑點(diǎn)，脫色，進(jìn)行胰蛋白酶消化。肽混合物通過(guò)質(zhì)譜(MS)分析。可替代地，可以例如通過(guò)毛細(xì)管高壓液相層析(HPLC)來(lái)分離肽，單獨(dú)或者匯集在一起進(jìn)行MS分析。
質(zhì)譜分析儀由離子源、質(zhì)量分析器、離子檢測(cè)器和數(shù)據(jù)獲取單元組成。首先，在離子源中使肽離子化。然后，在質(zhì)量分析器中按照質(zhì)量與電荷的比例，分離被離子化的肽，檢測(cè)分離的離子。質(zhì)譜分析被廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析，特別是從發(fā)明了基質(zhì)輔助激光吸附電離/飛行時(shí)間(MALDI-TOF)和電子噴射電離(ESI)方法以來(lái)。有多種版本的質(zhì)量分析器，包括，例如MALDI-TOF和三極或四極-TOF，或偶聯(lián)到ESI上的離子捕獲質(zhì)量分析器。因此，例如Q-Tof-2質(zhì)譜儀采用一種正交(orthogonal)的時(shí)間飛行分析器，該分析器使得可以在整個(gè)質(zhì)譜范圍內(nèi)同時(shí)檢測(cè)離子。進(jìn)一步的詳細(xì)描述，參見(jiàn)例如Chemusevich等人，J.Mass Spectrom.36849-865(2001)。
如果需要，肽片段和甚至該片段所來(lái)源的蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)來(lái)確定，例如質(zhì)譜法的某種改變形式，或者Edman降解。
2.從早期和非侵入性的診斷中獲益的胎兒-母體癥狀a.羊膜內(nèi)感染羊膜內(nèi)感染(IAI)是懷孕過(guò)程中發(fā)生的羊水和子宮內(nèi)容物的急性細(xì)菌感染。前瞻性研究表明，在所有分娩4％-10％中發(fā)生IAI(Newton，E.R.，Prihoda，T.J.，和Gibbs，R.S.Logistic regression analysis of riskfactors for intra-amniotic infection.Obstet.Gynecol.73571，1989；Soper，D.E.，Mayhall，C.G.，和Dalton，H.P.Risk factors for intraamniotic infectiona prospectiVe epidemicologic study.American Journal of Obstetrics andGynecology 161562，1989；和Lopez-Zeno，J.A.，Peaceman，A.M.，Adashek，J.A.和Socol，M.L.A controlled trial of a program for the active management of labor.N.Engl.J Med.326450，1992)。用于描述IAI的其他術(shù)語(yǔ)包括羊水感染、羊膜炎和臨床絨毛膜羊膜炎。臨床上，通過(guò)母體發(fā)熱、子宮疼痛(uterine tenderness)、白血球增多和胎兒心動(dòng)過(guò)速來(lái)診斷羊膜內(nèi)感染，應(yīng)當(dāng)與組織學(xué)的絨毛膜羊膜炎區(qū)別開(kāi)。羊膜內(nèi)感染是母體和新生兒發(fā)病的重要誘因。羊膜內(nèi)感染占圍產(chǎn)期(peripartum period)發(fā)熱病例的10-40％有關(guān)，與早期新生兒膿毒病和肺炎病例的20-40％有關(guān)(Newton，E.R.Chorioamnionitis and intraamnioticinfection.Clin.Obstet.Gynecol.36795，1993)。在2-6％的患有IAI的患者中發(fā)生母體細(xì)菌病，并且產(chǎn)后感染發(fā)病率升高。在患有IAI的患者中，功能紊亂的分娩和剖腹產(chǎn)的危險(xiǎn)性也升高。Duff等人報(bào)道，在分娩發(fā)生羊膜內(nèi)感染的患者中，發(fā)生75％功能紊亂的分娩和34％剖腹產(chǎn)(Duff，P.，Sanders，R.，和Gibbs，R.S.The course of labor in term pregnancies with chorioamnionitis.American Journal of Obstetrics and Gynecology 147391，1983)。羊膜內(nèi)感染還與新生兒的發(fā)病率和死亡率相關(guān)，特別是在早產(chǎn)嬰兒中?？傊?，在患有IAI母親生出的低出生重的新生兒中，圍產(chǎn)期死亡率增加3-4倍(Gibbs，R.S.，Castillo，M.A.，和Rodgers，P.J.Management of acute地chorioamnionitis.American Journal Of Obstetrics and Gynecology136709，1980；Gilstrap，L.C.，III，Leveno，K.J.，Cox，S.M.，Burris，J.S.，Mashburn，M.，和Rosenfeld，C.R.intrapartum treatment of acute chorioamnionitisimpacton neonatal sepsis.Am.J.Obstet.Gynecol.159579，1988)。呼吸窘迫綜合癥、心室內(nèi)出血和新生兒膿毒病也增加Morales，W.J.The effect of chorioamnionitison the developmental outcome of preterm infants at one year.Obstetrics andGynecology 70183，1987)。最近，IAI被暗示與新生兒周室白血病(periventricular leukomalacia)和腦癱瘓(cerebralpalsy)有關(guān)；在羊膜內(nèi)感染的情況下，腦白質(zhì)(cerebral white matter)損傷和腦癱瘓的危險(xiǎn)性增加9倍Bejar，R.，Wozniak，P.，Allard，M.，Benirschke，K.，Vaucher，Y.，Coen，R.，Berry，C.，Schragg，P.，Villegas，I.，和Resnik，R.Antenatal origin of neurologic damage innewborn infants.I.Preterm infants.Am.J.Obstet.Gynecol.159357，1988；Grether，J.K.和Nelson，K.B.Maternal infection and cerebral palsy in infants ofnormal birth weight.JAMA 278207，1997)。最后，在至少10％的具有完整胎膜的早產(chǎn)婦女中存在亞臨床IAI，表明IAI是一種重要的和可預(yù)防的早熟的誘因(Romero，R.，Avila，C.，Brekus，C.A.，和Morotti，R.The role of systemic andintrauterine infection in preterm parturition.Annuals of the New York Academy ofSciences 622355，1991)。Newton的文獻(xiàn)綜述證明，41％發(fā)生率的臨床IAI發(fā)生在小于27周的懷孕期，15％發(fā)生在27-37周的懷孕期，2％發(fā)生在38周或更長(zhǎng)的懷孕期內(nèi)(Newton等人，同上文)。在無(wú)任何臨床的羊膜內(nèi)感染信號(hào)，并具有完整胎膜的早產(chǎn)中，從10-20％的婦女的羊水中獲得下生殖道固有的細(xì)菌(Romero等，同上文)，而在23-24周終止妊娠的早產(chǎn)中，多達(dá)67％婦女的羊水中獲得下生殖道固有的細(xì)菌(Watts，D.H.，Krohn，M.A.，Hillier，S.L.，和Eschenbach，D.A.The association of occult amniotic fluid infection withgestational age and neonatal outcome among women in pretenn labor.ObstetGnecol 79351，1992)。大部分這種患者生產(chǎn)迅速，并且在許多人中產(chǎn)生臨床上明顯的IAI。這些觀察結(jié)果支撐一種假設(shè)，即升高的初始亞臨床的子宮內(nèi)感染領(lǐng)先于早產(chǎn)，是過(guò)早分娩(preterm deliverries)的重要誘因。
b.先兆子癇先兆子癇被定義為伴隨蛋白尿、浮腫或者兩者的母體高血壓，在7％懷孕者中發(fā)生，并且在妊娠前3個(gè)月不會(huì)終結(jié)。雖然不知曉其誘因，但是更常見(jiàn)于分娩后期(extremes of age in childbearing)、母體糖尿病、具有多胎懷孕(multiple gestations)和預(yù)先存在的母體腎臟疾病和高血壓的懷孕中。先兆子癇與圍產(chǎn)期死亡率相關(guān)，會(huì)引起驚厥，特征在于母體癲癇和母體死亡率升高。目前先兆子癇的最主要治療方法是進(jìn)行引產(chǎn)和用硫酸鎂抗驚厥預(yù)防。在使用硫酸鎂治療之前，觀察到的母體死亡率為20-30％。但是，及時(shí)診斷使得可以用硫酸鎂、進(jìn)行抗驚厥治療，抗高血壓和引產(chǎn)，母體死亡率降低到接近零。
不幸的是，基于通常公認(rèn)的癥狀和征兆的先兆子癇的診斷往往是困難的，并且發(fā)生疾病的后期。通常，胎兒的生長(zhǎng)或健康狀況受到威脅是首個(gè)被公認(rèn)的先兆子癇的表現(xiàn)。先兆子癇的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)記包括定量蛋白尿，尿酸和肌氨酸酐的血清濃度升高。對(duì)于早期的先兆子癇，目前還沒(méi)有可獲得的血清標(biāo)記，也沒(méi)有獲得鑒定將會(huì)發(fā)生先兆子癇的婦女的標(biāo)記。最近，一項(xiàng)研究證明，包括leptin和尿酸的預(yù)計(jì)的血清標(biāo)記與隨后發(fā)生的先兆子癇相關(guān)(Gursoy T，等人.Preeclampsia disrupts the normal physiology of leptin.Am JPerinatol.19(6)303-10，2002)。但是，需要更多的工作來(lái)驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)。需要開(kāi)發(fā)用以先兆子癇的早期和可靠的標(biāo)記來(lái)允許進(jìn)行治療和介入以優(yōu)化新生兒和母親的結(jié)果。
c.早產(chǎn)和分娩早產(chǎn)被定義為第37個(gè)完全懷孕周之前的生產(chǎn)。在美國(guó)，早產(chǎn)發(fā)生率占所有成活生產(chǎn)的10-11％，盡管對(duì)早產(chǎn)進(jìn)行侵入性處理，該比例在升高。一般地，早熟及其結(jié)果導(dǎo)致早產(chǎn)80％的圍產(chǎn)期死亡，而不是由于先天性畸形，每年增加約50億美元的國(guó)家衛(wèi)生保健預(yù)算。早產(chǎn)的危險(xiǎn)因素包括非白種種族(non-white race)、年齡小、低社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀況、母體體重小于55kg、未產(chǎn)婦女、前3個(gè)月出血、多胎妊娠(Meis PJ，Michielutte R，Peters TJ，等人.Factorsassociated with preterm birth inCardiff，WalesII.Indicated andspontaneouspretenn birth.Am J Obstet Gynecol 173597-602，1995)。
不幸的是，對(duì)處于自然早產(chǎn)危險(xiǎn)中的患者的預(yù)報(bào)通常是令人失望的(Creasy RK，Iams JD.Preterm labor and delivery.In Maternal-Fetal Medicine，Creasy RK，Resnik R(編輯)。W.B.Saunders Company，Philadelphia，PA4thedition，1999.Pages 498-531)。定義處于極度早產(chǎn)危險(xiǎn)中并將可能從早期干涉中獲益的群體的先前嘗試包括風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分指數(shù)、生物化學(xué)檢測(cè)子宮頸的胎兒纖連蛋白、超聲波測(cè)量子宮頸長(zhǎng)度、和家族的子宮活動(dòng)監(jiān)控。這些程序花費(fèi)昂貴，并且受到不能精確地預(yù)測(cè)的妨礙，妨礙患者可以從早期干涉或預(yù)防中獲益。所有人都受到約30％的低陽(yáng)性預(yù)測(cè)值的困擾，大部分患者被鑒定為“處于危險(xiǎn)”的足月分娩。介入，包括藥物處理來(lái)抑制子宮收縮是有效的，但是依賴于對(duì)早產(chǎn)的早期和可靠的診斷。因此，對(duì)于降低與早產(chǎn)相關(guān)的巨大開(kāi)支和新生兒死亡率和發(fā)病率來(lái)說(shuō)，用于鑒定處于極度早產(chǎn)危險(xiǎn)中的患者的早期和可靠標(biāo)記是必需的。
d.染色體非整倍性染色體非整倍性是圍產(chǎn)期發(fā)病率和死亡率的頻繁誘因。在200名活出生兒中，染色體非整倍性的發(fā)生率為1。這種畸形的重要原因是染色體非整倍性，從雙親遺傳得到異常數(shù)量的染色體。最常見(jiàn)的染色體非整倍性之一是三體性-21(Down綜合癥)，在800名活出生兒中有1名患有該病(Hook EB，Hamerton JLThe frequency of chromosome abnormalities detected inconsecutive newborn studiesDifferences between studiesResults by sex and byseverity of phenotypic involvement.In Hook EB，Porter IH(編輯)PopulationCytogenetics，63-79.紐約，Academic Press，1978)。三體性-21的最主要危險(xiǎn)因素是母體年齡超過(guò)35歲，但是80％患有三體性-21的兒童是由年齡小于35歲的婦女生育的。其他常見(jiàn)的非整倍性癥狀包括三體性13和18、Turner綜合癥和Klinefelter綜合癥。
由于80％患有三體性-21的兒童是由年齡小于35歲的婦女生育的，單獨(dú)采用基于母體年齡設(shè)計(jì)的出生前診斷篩選程序是無(wú)效的。因此，出生前篩選程序應(yīng)補(bǔ)充母體血清篩選與胎兒染色體非整倍性相關(guān)的分析物，超聲波或者兩者的結(jié)合。被廣泛使用的候選血清標(biāo)記包括α-胎蛋白(AFP)，未被偶聯(lián)的雌激素三醇，人絨毛膜促性腺激素(choriogonadotrophic hormone)(hHCG)，和抑制素-A。但是，僅有2-5％的陽(yáng)性篩選率，三體性-21和其他非整倍性的檢測(cè)率是令人失望的，檢測(cè)率僅為70-86％(Cuckle H.Biochemicalscreening for Down syndrome.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol.92(1)97-101，2000)。此外，真陽(yáng)性檢測(cè)率，即在陽(yáng)性檢測(cè)中的三體性-21僅為1-2％，產(chǎn)生了超過(guò)98％的假陽(yáng)性比例。
在母體血清篩選和超聲波后對(duì)染色體非整倍性的確定診斷需要中間3個(gè)月遺傳羊水診斷。這種侵入性的操作與0.5％的妊娠丟失危險(xiǎn)相關(guān)。此外，羊水細(xì)胞的染色體分析是一個(gè)勞動(dòng)強(qiáng)度大而且費(fèi)時(shí)的方法，需要2周時(shí)間。因此，需要可靠的檢測(cè)來(lái)提高從母體血清中檢測(cè)染色體非整倍性，降低難以接受的母體篩選的高假陽(yáng)性，并且提高從羊水診斷后的羊水進(jìn)行診斷的速度和效率。
3.用生物液體的蛋白質(zhì)組圖譜診斷母體/胎兒癥狀本發(fā)明提供用于通過(guò)蛋白質(zhì)組分析生物液體，診斷前述的和其他類(lèi)似母體/胎兒癥狀的早期、可靠和非侵入性的方法，生物液體例如羊水、血清、血漿、尿液、腦脊髓、乳汁、粘液或唾液。
如前面指出，在本發(fā)明的內(nèi)容中，所用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)組圖譜”是指在特定時(shí)間，生物樣本如生物液體中的大量蛋白質(zhì)的表達(dá)圖譜的表示特征。蛋白質(zhì)組圖譜可以例如被表示為質(zhì)譜，但是還包括基于蛋白質(zhì)的任何物理化學(xué)或生物化學(xué)特征的其他表示方法。雖然，有可能鑒定和測(cè)序在生物液體的蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)的全部或一些，但是對(duì)于按照本發(fā)明產(chǎn)生的蛋白質(zhì)組圖譜的診斷用途來(lái)說(shuō)是不必要的。當(dāng)存在將要被診斷的疾病或病理性的癥狀時(shí)，特定疾病的診斷可以基于正常的蛋白質(zhì)組圖譜和從某些條件下獲得的同樣的生物液體的蛋白質(zhì)組圖譜之間的特征性差異(獨(dú)特的表達(dá)特征)。獨(dú)特的表達(dá)特征可以是存在于檢測(cè)或參考生物樣本的蛋白質(zhì)組圖譜中的任何獨(dú)特的特征或基序，其在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著區(qū)別于從相同類(lèi)型來(lái)源獲得的相應(yīng)正常生物樣本的蛋白質(zhì)組圖譜。例如，如果蛋白質(zhì)組圖譜以質(zhì)譜的方式表示，獨(dú)特的表達(dá)特征通常是峰值或者多個(gè)峰值的組合，在數(shù)量和質(zhì)量上區(qū)別于相應(yīng)的正常樣本的質(zhì)譜。因此，質(zhì)譜中出現(xiàn)新峰值或者新峰值的組合，或者質(zhì)譜中所存在的峰值或者所存在的峰值的組合的振幅或形狀的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著改變，被認(rèn)為是獨(dú)特的表達(dá)特征。當(dāng)將從哺乳動(dòng)物受試者獲得的檢測(cè)樣本的蛋白質(zhì)組圖譜與包含病理性的母體或胎兒癥狀的獨(dú)特表達(dá)特征的參比樣本的蛋白質(zhì)組圖譜相比時(shí)，如果哺乳動(dòng)物與參比樣本共有獨(dú)特的表達(dá)特征，則被診斷為患有這種病理性的病癥。
可以通過(guò)將從將被診斷的受試者獲得的生物液體的蛋白質(zhì)組圖譜與相同種類(lèi)的并用相同方式獲得和處理的正常生物液體的蛋白質(zhì)組圖譜比較，診斷特定的病理性的母體/胎兒癥狀。如果檢測(cè)樣本的蛋白質(zhì)組圖譜與正常樣本的蛋白質(zhì)組圖譜基本上相同，該受試者被認(rèn)為未患有病理性的母體/胎兒癥狀。如果檢測(cè)樣本的蛋白質(zhì)組圖譜相對(duì)于正常樣本的蛋白質(zhì)組圖譜，具有獨(dú)特的表達(dá)特征，該受試者被診斷為患有所檢測(cè)的母體/胎兒病癥。
可替代地或另外地，將檢測(cè)樣本的蛋白質(zhì)組圖譜與參比樣本的蛋白質(zhì)組圖譜比較，該參比樣本從被獨(dú)立地診斷為患有所檢測(cè)的病理性母體/胎兒癥狀的受試者的生物液體中獲得。在這種情況下，如果檢測(cè)樣本與參比樣本的蛋白質(zhì)組圖譜共有至少一種特征或者表示獨(dú)特表達(dá)特征的組合，則受試者被診斷為患有病理性的癥狀。
在本發(fā)明的方法中，正常生物樣本的蛋白質(zhì)組圖譜具有重要的診斷作用，如上所討論，如果檢查樣本的蛋白質(zhì)組圖譜與正常生物樣本的蛋白質(zhì)組圖譜實(shí)質(zhì)上相同，該患者被診斷為未患有被鑒定的病理性的母體/胎兒癥狀。這種“陰性”診斷具有重要意義，其去除了對(duì)患者進(jìn)行不必要的治療和干涉，這種治療或干涉可能具有潛在的副作用，或?qū)颊摺⑻夯蛐律鷥涸斐晌ｋU(xiǎn)。分析數(shù)據(jù)，確定差別是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
在分析前，用常規(guī)的蛋白質(zhì)分離方法，去除以實(shí)質(zhì)上相同表達(dá)水平存在于正常的和患病蛋白質(zhì)組組中的蛋白質(zhì)(共同蛋白質(zhì)，例如白蛋白和免疫球蛋白)，可以提高本發(fā)明的診斷方法的靈敏度。不是獨(dú)特的表達(dá)特征部分的這種共同蛋白去除會(huì)導(dǎo)致靈敏度和診斷精確度提高?？商娲鼗蛄硗獾兀谟?jì)算分析結(jié)果的過(guò)程中，可以消除共同蛋白的表達(dá)特征(或者去除信號(hào))，通常采用光譜選擇算法，其是機(jī)械引導(dǎo)的(machice oriented)以產(chǎn)生診斷呼叫。在下面實(shí)施例中詳細(xì)描述的結(jié)果提供特征為羊膜內(nèi)感染(IAI)的蛋白質(zhì)組圖譜，統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地區(qū)別于正常的羊水蛋白質(zhì)組圖譜。此外，實(shí)施例分別提供了特征為IAI和Down綜合癥的表達(dá)標(biāo)記和獨(dú)特的表達(dá)特征。
比較蛋白質(zhì)組圖譜的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法在本領(lǐng)域是公知的。例如，在為質(zhì)譜的情形下，蛋白質(zhì)組圖譜被定義為光譜水平軸上的關(guān)鍵質(zhì)量/電荷(M/Z)位置上的峰值振幅值。因此，特征性蛋白質(zhì)組圖譜可以用由給定M/Z值上的光譜振幅的組合形成的模式來(lái)表征。通過(guò)用合適的算法，比較檢測(cè)樣本的蛋白質(zhì)組圖譜(模式)與參比或正常樣本的蛋白質(zhì)組圖譜(模式)，確定特征性表達(dá)特征存在與否或者兩種圖譜是否基本上相同。公開(kāi)了用于分析蛋白質(zhì)組圖譜的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，例如在Petricoin III，等，The Lancet 359572-77(2002).；Issaq等人，Biochezn BiophysCommun 292587-92(2002)；Ball等人，Bioinformatics 18395-404(2002)；和Li等人，Clinical Chemistry Journal，481296-1304(2002)中。
在特定實(shí)施方案中，將從患者獲得的樣本應(yīng)用于蛋白質(zhì)芯片，通過(guò)質(zhì)譜分析生成蛋白質(zhì)圖譜。如上所述，用合適的生物信息軟件分析光譜中的峰值的圖譜。
4.篩選分析本發(fā)明的蛋白質(zhì)組圖譜可進(jìn)一步用于篩選分析，鑒定用于治療特定的母體/胎兒癥狀的藥物候選。這種篩選分析是基于檢測(cè)分子將含有特征為將被治療的母體/胎兒癥狀的表達(dá)特征的蛋白質(zhì)組圖譜轉(zhuǎn)化為缺乏該表達(dá)特征的蛋白質(zhì)組圖譜的能力。在一特定實(shí)施方案中，檢測(cè)測(cè)試化合物將病理性的表達(dá)圖譜轉(zhuǎn)化為正常的表達(dá)圖譜的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，篩選分析檢測(cè)測(cè)試化合物將特征為病理性的癥狀的獨(dú)特表達(dá)特征轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的正常表達(dá)特征的能力。
可以通過(guò)處理患病生物樣本，并比較處理前后的蛋白質(zhì)組表達(dá)圖譜，體外進(jìn)行這種篩選分析。可替代地或另外地，可以通過(guò)用測(cè)試化合物處理具有靶病理性母體/胎兒癥狀的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在處理前后獲取該動(dòng)物的生物液體的樣本，比較兩種樣本的蛋白質(zhì)組圖譜，進(jìn)行藥物篩選。在該分析中，還有可能在處理后的不同時(shí)間點(diǎn)上獲取生物液體樣本，跟蹤處理的時(shí)程(follow the time course of treatment)。還可以用這些方法學(xué)類(lèi)表征藥物試劑的毒性，以及用于鑒定特定治療方法的最佳候選。
測(cè)試化合物可以是例如肽、非肽的有機(jī)小分子、蛋白質(zhì)、多肽、抗體(包括抗體片段)、反義分子、寡核苷酸decoy和先前被用作藥物或藥物候選的任何其他類(lèi)型的分子。
生物液體可以是例如羊水、血清(如母體血清)、血漿、尿液、腦脊髓、乳汁、粘液或唾液。
可以將所鑒定的治療活性化合物配制在常規(guī)的藥物制劑中。本領(lǐng)域知曉的制劑綱要可見(jiàn)于Remington′s Pharmaceutical Sciences，最新版，MackPublishing Company，Easton，PA.參考該手冊(cè)是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。
5.蛋白質(zhì)和抗體陣列上面討論的診斷和篩選分析都可以采用蛋白質(zhì)陣列來(lái)進(jìn)行。近年來(lái)，蛋白質(zhì)陣列被公認(rèn)是檢測(cè)蛋白質(zhì)、監(jiān)控蛋白質(zhì)表達(dá)水平和研究蛋白質(zhì)相互作用和功能的有力手段。采用自動(dòng)化手段，可以同時(shí)進(jìn)行大量檢測(cè)，進(jìn)行高通量的蛋白質(zhì)分析。在最早開(kāi)發(fā)用于DNA陣列的微陣列或芯片形式中，可以用最少材料進(jìn)行這種檢測(cè)，而獲得大量數(shù)據(jù)。
雖然，如上所述通過(guò)2D凝膠電泳和質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析是非常有效的，但是并不總是產(chǎn)生所需的高靈敏度，并且會(huì)丟失許多以低豐度表達(dá)的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)微陣列除了其高效率外，還提供了改進(jìn)的靈敏度。
蛋白質(zhì)陣列是通過(guò)將蛋白質(zhì)固定在固體表面上形成的，例如玻璃、硅片、微孔板，硝化纖維，PVDF膜和微珠，用各種本領(lǐng)域熟知的共價(jià)和非共價(jià)的連接化學(xué)方法。固體支持物在進(jìn)行偶聯(lián)操作前后應(yīng)當(dāng)是化學(xué)穩(wěn)定的，具有良好的斑點(diǎn)形態(tài)，顯示最少的非特異結(jié)合，不在檢測(cè)系統(tǒng)中產(chǎn)生背景，并且與不同檢測(cè)系統(tǒng)相容。
總之，蛋白質(zhì)微陣列采用與通常用于讀取DNA陣列相同的檢測(cè)方法。類(lèi)似地，與用于讀取DNA陣列相同的儀器被應(yīng)用于蛋白質(zhì)陣列。
因此，捕獲陣列(例如抗體陣列)用熒光標(biāo)記的來(lái)自兩種不同來(lái)源的蛋白來(lái)探查，例如來(lái)自正常的或患病的生物液體。在這種情形下，讀數(shù)是基于熒光信號(hào)的改變，反映目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的改變?？商娲淖x數(shù)包括，但是不限于熒光共振能量轉(zhuǎn)移、表面胞質(zhì)基因組共振、轉(zhuǎn)動(dòng)循環(huán)(rolling circle)的DNA擴(kuò)增、質(zhì)譜分析、共振光散射和原子場(chǎng)顯微鏡。
進(jìn)一步詳細(xì)描述參見(jiàn)，例如Zhou H，等人，Trends Biotechnol.19S34-9(2001)；Zhu等，Current Opin.Chem.Biol.540-45-(2001)；Wilson和Nock，Angew Chem Int Ed Engl 42494-500(2003)；以及Schweitzer和Kingsmore，Curr Opin Biotechnol 1314-9(2002)。生物分子陣列還被公開(kāi)在美國(guó)專(zhuān)利6,406,921，2002年6月18日出版，其全部包括在此完全引入作為參考。
根據(jù)如下非限制性實(shí)施例，本發(fā)明的其他詳細(xì)內(nèi)容將是顯然的。
實(shí)施例1一般操作羊膜內(nèi)感染的靈長(zhǎng)類(lèi)模型該操作得到Institutional Animal Care Utilization Committee of the OregonNational Primate Research Center的許可，對(duì)人護(hù)理的指導(dǎo)方針如下。如先前所述(Haluska GJ，等人，Temporal changes in uterine activity and prostaglandinresponse to RU 486 in rhesus macaques in late gestation.，Arra J Obstet Gynecol1571487-95(1987)和Gravett MG，等人，An experimental model forintra-amniotic infection and preterm labor in rhesus monkeys.Am J ObstetGynecol 1711660-7(1994))，給時(shí)控(timed)妊娠的19只懷孕的恒河猴(Macaca mulatta)長(zhǎng)期插入導(dǎo)管，并進(jìn)行手術(shù)后的飼養(yǎng)。
簡(jiǎn)而言之，在妊娠的約第110天(妊娠期為167天)，使懷孕動(dòng)物飼養(yǎng)習(xí)慣護(hù)套和拴系系統(tǒng)(jacket and tether system)(Ducssay CA，等人，Simplifiedvest and tether system for maintenance of chronically catheterized pregnantrhesus monkeys.Lab.Anim Sci 38343-4(1988))。在習(xí)慣該系統(tǒng)后，在妊娠的第119天到126天，在全身麻醉下進(jìn)行子宮內(nèi)手術(shù)。手術(shù)植入母體股動(dòng)脈和靜脈導(dǎo)管，胎兒動(dòng)脈和靜脈導(dǎo)管，兩條開(kāi)口的羊膜內(nèi)壓力導(dǎo)管，myometrial肌電電極和胎兒心電圖(electrocardio graphic)電極。手術(shù)后，所有動(dòng)物接受硫酸特布他林(terbutaline sulfate)(每天兩次3-5小時(shí)靜脈注射1mg)1-5天，以控制子宮過(guò)敏。動(dòng)物還接受cefazolin(每12小時(shí)靜脈內(nèi)注射250mg)，至少持續(xù)到接種細(xì)菌之前的48小時(shí)。
在手術(shù)后穩(wěn)定8-13天后(妊娠126-138天)，通過(guò)羊膜內(nèi)接種a)106菌落形成單位(cfu)的B組鏈球菌(streptococcus)，III型，懸浮在生理鹽水中(n＝7)，b)107cfu的Ureaplasma parvum(先前的Ureaplasma urealyticum，serovar1)懸浮在10B培養(yǎng)基中(n＝6)，或c)106-107cfu的Mycoplasaa hominis(n＝6)，懸浮在含有10％蔗糖和無(wú)內(nèi)毒素的胎牛血清的磷酸緩沖鹽水中，建立實(shí)驗(yàn)性羊膜內(nèi)感染(IAI)。B組鏈球菌分離物最初從患有腦膜炎的嬰兒中獲得。Ureaplasma parvum來(lái)自患有絨毛膜羊膜炎和新生兒膿毒病的患者的胎盤(pán)和膜的低傳代(low passaged)臨床分離物。Mycoplasma hominis是患有產(chǎn)后子宮內(nèi)肌肉炎(endomyometritis)的患者的子宮內(nèi)膜分離物。
在試驗(yàn)階段(每天接種前和接種后的每4-12小時(shí))，連續(xù)從所有動(dòng)物中收集羊水樣本，用于定量細(xì)菌培養(yǎng)物，通過(guò)血球計(jì)分析白血球，和細(xì)胞因子和前列腺素濃度(先前報(bào)道的Gravett MG，等人，An experimental model forintra amniotic infection and preterm labor in rhesus monkeys.Am J ObstetGynecol 1711660-7(1994))，和用于蛋白質(zhì)組分析。
從手術(shù)到分娩，連續(xù)記錄胎兒心電圖和子宮活動(dòng)(肌電圖和羊膜內(nèi)壓)。將子宮收縮性記錄為每小時(shí)的收縮曲線的面積，表達(dá)為毫米水銀時(shí)間秒/小時(shí)的每小時(shí)收縮面積(hourly contraction area)(HCA)。
感染前和此后連續(xù)地通過(guò)陰道觸診母體子宮頸。每次檢查都記錄一致性、消除和擴(kuò)張。在分娩后，除了一只動(dòng)物通過(guò)陰道生產(chǎn)外，所有的動(dòng)物通過(guò)剖腹產(chǎn)，獲得胎兒、蛻膜、胎盤(pán)將內(nèi)膜細(xì)菌培養(yǎng)物，以證實(shí)發(fā)生感染，進(jìn)行組織病理性研究來(lái)證明發(fā)生絨毛膜羊膜炎。
在如上進(jìn)行所述羊膜內(nèi)接種后，快速產(chǎn)生感染。子宮收縮性從基線水平的100升高到10,000mmHg x秒/小時(shí)，發(fā)生在用B組鏈球菌接種后的33±9小時(shí)內(nèi)，在用Ureaplasma parvum接種后的43±14小時(shí)內(nèi)；和在用Mycoplasma hominis接種后的62±14內(nèi)。如先前報(bào)道(Gravett等人，AmJ.Obstet Gynecol 1711660-7(1994))，在所有情形下，子宮收縮引起進(jìn)行性子宮頸膨脹和消退。子宮收縮性升高在促炎癥細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-8以及前列腺素E2和F2α顯著增加之前。無(wú)動(dòng)物表明，IAI的臨床信號(hào)發(fā)生在分娩開(kāi)始之前。在所有情形下，都證實(shí)了絨毛膜羊膜炎。
人類(lèi)研究(婦女中的亞臨床的IAI)研究群體從309位婦女中選出，如先前所述(Hitti J，等人，Amniotic fluidtumor necrosis factor-α and the risk of respiratory distress syndrome amongpreterm infants.Am J Obstet Gynecol 17750-6(1997))，她們是從1991年6月25日到1997年6月30日，在妊娠22-34周在華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心(Universityof Washington Medical Center)或西雅圖的聯(lián)合醫(yī)院進(jìn)行早產(chǎn)，具有完整的胎膜。所有婦女提供書(shū)面的同意意見(jiàn)，該研究方案得到所有參與醫(yī)院的Institutional Review Boards的許可。在試驗(yàn)記錄中，所有的參與者具有完整的胎膜。早產(chǎn)被定義為有規(guī)律的子宮收縮，＜10分鐘的頻率，具有文獻(xiàn)記載的子宮頸變化或者子宮頸擴(kuò)張＞1厘米或者消除＞50％。
亞臨床IAI定義為陽(yáng)性AF微生物培養(yǎng)物和/或AF白細(xì)胞介素-6(IL-6)濃度＞2ng/ml，絨毛膜羊膜炎的組織證據(jù)(定義為在10個(gè)不相連的視野內(nèi)，每個(gè)400X視野中存在＞10多型核白血球，不存在子宮觸痛或發(fā)熱)。本發(fā)明人先前已經(jīng)報(bào)道AF IL-6濃度＞2ng/ml占所有研究群體的75％或更高，與通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的細(xì)菌檢測(cè)相關(guān)(Hitti等人，Clin Infect Dis 241228-32(1997))。排出子宮頸擴(kuò)張(dilatation)＞4厘米或者在接收時(shí)發(fā)生膜破裂的婦女。如果具有多胎妊娠、子宮頸環(huán)扎、胎盤(pán)、胎盤(pán)剝落、糖尿病、高血壓和先兆子癇的婦女還滿足試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，則被認(rèn)為是符合條件的。
在超聲波引導(dǎo)下，對(duì)所有的試驗(yàn)參與者進(jìn)行腹部穿刺羊水(transabdominal aminocentesis)診斷，并且在登記時(shí)通過(guò)靜脈穿刺收集母體靜脈血。從該試驗(yàn)群體中，確定用于如在此報(bào)道的蛋白質(zhì)組分析的亞組(表1A和B)。該亞組包括三個(gè)11位患者的組組I-患者具有上面定義的亞臨床IAI的跡象；組II-隨機(jī)選擇的患者亞組，不具有文獻(xiàn)記載的子宮內(nèi)感染，但是發(fā)生妊娠＜34周的早產(chǎn)，和組III-患者未被感染，但是具有對(duì)產(chǎn)科(tocaytic)治療響應(yīng)的早產(chǎn)，患者在近足月(term)時(shí)生產(chǎn)(在＞35個(gè)妊娠周)。在母親年齡、種族或生育狀況(parity)沒(méi)有差別(表1A和B)。但是，登記(enrollment)時(shí)，患有子宮內(nèi)感染的患者具有稍微較早的妊娠年齡(gestationage)(p＝0.10)，并且與未被感染的早產(chǎn)患者或者足月生產(chǎn)(term delivery)的那些婦女相比，在顯著較早的妊娠年齡生產(chǎn)(分別為27.3±0.9周比29.8±1.0周和37.0±0.9周，p＜0.0001)。此外，那些患有子宮內(nèi)感染的患者具有較短的從登記到生產(chǎn)的間隔(2.1±5.6天，而其他兩組分別為8.4±6.3天和46.9±5.6天，p＜0.0001)。91％患有子宮內(nèi)感染的那些患者在登記后的7天內(nèi)生產(chǎn)。將樣本存儲(chǔ)在-20℃下，直到進(jìn)行分析，并且解凍不超過(guò)兩次(not thawed morethan twice)。
在被感染的11位患者中，從4位收集到微生物(兩位具有大腸桿菌，一位具有白色假絲酵母(Candida albicans)，一位具有混合的厭氧性生物)；所有這些患者在7天之內(nèi)生產(chǎn)。7位其他患者根據(jù)羊水IL-6濃度超過(guò)2,000pg/ml來(lái)確定。在這些患者中，平均的白細(xì)胞介素-6的羊水濃度為27.7±7.8ng/ml，而未被感染的早產(chǎn)患者中為0.68±0.20ng/ml，在早產(chǎn)和足月生產(chǎn)的那些婦女中為0.25±0.13ng/ml(p＜0.01)。
表1A.試驗(yàn)群體的特征
數(shù)據(jù)表示為平均標(biāo)準(zhǔn)方差。通過(guò)ANOVA分析連續(xù)數(shù)據(jù)，用卡方(chi-square)檢驗(yàn)分析分類(lèi)數(shù)據(jù)。縮寫(xiě)PMD，早產(chǎn)＜35周；IUI，子宮內(nèi)感染；PML，未生產(chǎn)的早產(chǎn)(premature labor without delivery)。
表1B.篩選結(jié)果
*該集合中的兩個(gè)陽(yáng)性樣本表示亞臨床感染，這兩位受試者的AF具有低的細(xì)菌含量，通過(guò)PCR操作證明是陽(yáng)性的。這表明繪制蛋白質(zhì)圖譜可被用于鑒定亞臨床的羊膜內(nèi)感染。
在前面的表格中，數(shù)據(jù)被表示為平均標(biāo)準(zhǔn)方差。通過(guò)ANOVA分析連續(xù)數(shù)據(jù)，用卡方檢驗(yàn)分析分類(lèi)數(shù)據(jù)?？s寫(xiě)PMD，早產(chǎn)＜35周；IUI，子宮內(nèi)感染；PML，未生產(chǎn)的早產(chǎn)。
表1C.篩選檢測(cè)結(jié)果的Fisher檢驗(yàn)顯著值
11位患有隱秘(occult)的IAI患者中的四位中獲得微生物(兩位具有大腸桿菌，一位具有白色假絲酵母，一位具有混合的厭氧性生物)。其他七位感染的患者根據(jù)顯著升高的AF IL-6濃度＞2ng/ml而確定。在這些患者中，IL-6的平均AF濃度為27.7±7.8ng/ml，而那些未被感染的早產(chǎn)婦女的濃度為0.68±0.20ng/ml，而在具有早期收縮(preterm contraction)但是足月生產(chǎn)的組III的婦女中的濃度為0.25±0.13ng/ml(p＜0.01)。
羊水的蛋白質(zhì)組分析通過(guò)LC-MS/MS分析進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定將100μg來(lái)自對(duì)照和感染樣本的羊水用吲哚乙酰胺(iodoacetamide)還原，并溶解在15％SDS-PAGE凝膠中。在80V下進(jìn)行電泳，將樣本中的蛋白質(zhì)分開(kāi)。電泳后，用考馬斯藍(lán)R-250染色凝膠，用Bio-Rad GS800顯像密度計(jì)和PDQUEST軟件來(lái)采集圖像。從凝膠上切取各個(gè)泳道的明顯條帶，脫色，采用Courchesne和Patterson的方法(Methods Mol Biol 112487-511(1999))，在37℃下，用胰蛋白酶消化凝膠24-48小時(shí)。用0.1％TFA提取肽，在speedvac中干燥。將提取物溶解在0.1％TFA中，用Millipore的ZipTipc18移液管尖頭(Marvin L.，等人，Identification of proteins from one-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis usingelectrospray quadrupole-time-of-flight tandem mass spectrometry.RapidCommun Mass Spectrom.14(14)1287-92，2000)，使用連接到CapLC(Waters，Inc)上的Q-Tof-2質(zhì)譜分析儀(Micromass，UK)和/或在連接到110Capillary LC System(Agilent Technologies，F(xiàn)oster City，CA)上的離子阱(iontrap)(LGQ，ThermoFinnigan，San Jose，CA)進(jìn)行純化。
2-維(2-D)凝膠電泳將去除或未去除白蛋白的羊水(400-2000μg)溶解在IEF緩沖液中，室溫下，再水合到24cm IPG條帶(pH3-10)上12小時(shí)。再水合后，IPG條帶在70-90kVhrs下進(jìn)行1-D電泳。然后在進(jìn)行第二向SDS-PAGE分析之前，IPG條帶用DTT平衡緩沖液I和IAA平衡緩沖液II連續(xù)地平衡15分鐘。然后將IPG條帶加載到4-20％SDS-PAGE凝膠上，在120V下進(jìn)行電泳12小時(shí)，將蛋白質(zhì)溶解在第二向(dimension)中。用考馬斯藍(lán)R-250染色，用Bio-RadGS800顯像密度計(jì)(densitometer)和PDQUEST軟件獲取圖像。從凝膠上切取單一的斑點(diǎn)，脫色，37℃下，在凝膠內(nèi)用胰蛋白酶消化24-48小時(shí)。用0.1％TFA提取肽，并用Millipore的ZipTipc18移液管尖頭(2-D Proteome analysisprotocolsMethods in Molecular Biology112，1999)進(jìn)行純化。
HPLC分離(fractionation)在去除白蛋白和IgG(1-15mg蛋白)后，將人的羊水樣本溶解在20mMTris-HCI，pH 7.5中。用裝載在制備了自動(dòng)取樣器和UV吸收(absorbance)探測(cè)器的Waters 1525HPLC中的TSK凝膠DEAE-5PW柱進(jìn)行陰離子交換層析。用線性的鹽洗脫梯度來(lái)分離蛋白質(zhì)。以1分鐘的間隔收集級(jí)分。匯集級(jí)分，用胰蛋白酶消化，用質(zhì)譜儀(Q-Tof-2)分析肽混合物。
質(zhì)譜分析(1)Q-Tof-2在凝膠內(nèi)消化后，在連接到Micromass CapLC上的Micromass Q-Tof-2質(zhì)譜儀中分析樣本。Q-Tof-2裝備了常規(guī)的Z-噴霧或nanospray源，并且連接到Integrafrit C 18 75um ID×15cm融合硅毛細(xì)管柱上。該儀器由安裝了Windows NT和MassLynx 3.5軟件的Compaq工作站控制，并獲取數(shù)據(jù)。Q-Tof-2用Glul血纖維蛋白肽(Fibrinopeptide)B校準(zhǔn)，該肽直接灌注或注射到CapLC中。用MS/MSMS測(cè)量方法來(lái)獲取MS/MSMS光譜。掃描質(zhì)量(mass)400-1500，用于MS測(cè)量，掃描質(zhì)量50-1900用于MSMS。在安裝了Windows 2000和SEQUEST(版本1.3)和/或LUTEFISK的PC上進(jìn)行原始數(shù)據(jù)分析。生成峰值列表，用內(nèi)置的自動(dòng)功能來(lái)進(jìn)行峰值抓取(peak-picking)，并對(duì)各個(gè)峰值進(jìn)行質(zhì)心擬合(centroid fitting)。
(2)LCQ-MS切取來(lái)自干燥的考馬斯藍(lán)染色的凝膠的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，在0.5ml的20mM碳酸氫銨、50％乙腈溶液中再水合/洗滌30分鐘。然后通過(guò)真空離心干燥凝膠區(qū)域，然后通過(guò)在20nM順序梯度的改進(jìn)胰蛋白酶中再水合，進(jìn)行原位消化(ProMega，Madison，WI，USA)，采用Courchesne和Patterson.Identificationof proteins by matrix-assisted laser desorption/ionization masses，MethodsMol.Biol.112487-511(1999)的方法。然后通過(guò)真空離心濃縮胰蛋白酶消化物，通過(guò)反向?qū)游鲞M(jìn)行分離，并通過(guò)型號(hào)LCQ離子阱質(zhì)譜儀(ThermoFinnigan，San Jose，CA)分析肽。用ZorbaxC-18 0.5mm×150mm微孔柱分離樣本，用1100 Capillary LC System(Agilent Technologies，F(xiàn)oster City，CA)，采用10μLmin-1流速，和濃度梯度為0-40％B(溶于水的75％乙腈)進(jìn)行1小時(shí)以上。將肽直接導(dǎo)入標(biāo)準(zhǔn)的ThermoFinnigan電子噴射源中。用標(biāo)準(zhǔn)的LCQ軟件，以自動(dòng)方式獲取MS/MS光譜，然后進(jìn)一步用SEQUEST(ThermoFinnigan)分析。對(duì)于進(jìn)一步的詳細(xì)描述參見(jiàn)，Courchesne，P.L.和Patterson，S.D.，同上文。
數(shù)據(jù)分析(1)Sequest和DTASelect如Yates等人，Methods Mol.Biol.112553-69(1999)所描述，用SEQUEST軟件(ThermoFinnigan)對(duì)串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)進(jìn)行自動(dòng)分析。SEQUEST將連續(xù)串聯(lián)質(zhì)譜與數(shù)據(jù)庫(kù)肽序列匹配。利用組合的非冗余(non-redundant)的蛋白質(zhì)序列的數(shù)據(jù)庫(kù)，用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行檢索，該數(shù)據(jù)庫(kù)從Protein InformationResource(發(fā)布日期)和SwissProt(發(fā)布日期(release date))獲得。用XcaliburDatabase Manager(ThermoFinnigan)構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)。S-羧基酰胺化半胱氨酸是僅被考慮的改變。
用DTASelect(The Scripps Research Institute，Tabb，2002)進(jìn)一步分析Sequest結(jié)果。DTASelect組織并過(guò)濾SEQUEST的鑒定結(jié)果。使用默認(rèn)參數(shù)，除了如下1)排除在蛋白質(zhì)描述中包括一串“角蛋白(keratin)”的任何數(shù)據(jù)庫(kù)匹配(matches)和2)對(duì)于雙倍帶電(doubly charged)離子，來(lái)自LCQ質(zhì)譜儀的光譜用2.4的交叉相關(guān)截取值(cross correlation score cut-off)過(guò)濾。對(duì)各個(gè)光譜和通過(guò)DTASelect選擇的序列對(duì)進(jìn)行眼測(cè)(visually inspected)，將最終結(jié)果輸入到電子數(shù)據(jù)表(Microsoft Excel)或者數(shù)據(jù)庫(kù)(Microsoft Access)中，進(jìn)行處理。
進(jìn)一步詳細(xì)描述，還可以參見(jiàn)Tabb DL，等人，DTASelect and ContrastTools for Assembling and Comparing Protein Identifications from ShotgunProteomics.J.Proteome Res.121-26(2002)。
(2)Lutefisk
用計(jì)算機(jī)程序Lutefisk 1900v1.2.5(Taylor JA，Johnson RS.Implementationand uses of automated de novo peptide sequencing by tandem mass spectrometry.Anal Chem 73(11)2594-604(2001)，對(duì)所有光譜進(jìn)行自動(dòng)重新測(cè)序。Lutefisk生成光譜的肽序列，其一些被充分地描述，用于基于同源性的序列檢索?？紤]修飾、丙烯酰胺、氨基甲酰胺甲基化和磷酸化。
MALDI檢測(cè)操作和參數(shù)在客戶定制的時(shí)間飛行發(fā)射質(zhì)譜儀上(Jensen ON，等人，Directobservationof UV-crosslinked protein-nucleic acid complexes by matrix-assistedlaser desorption ionization mass spectrometry.Rapid Commun Mass Spectrom7(6)496-501(1993))進(jìn)行MALDI質(zhì)譜分析，該質(zhì)譜儀裝備了兩階段延時(shí)提取源(two-stage delayed extraction source)。將約1μL的樣本溶液與1μL SA混合(溶解在最終濃度為60∶40水/乙腈0.1％TFA的芥子酸)。將1.0μL的這種分析物/基質(zhì)溶液液滴沉淀到預(yù)結(jié)晶樣本探針上，在空氣中干燥。通過(guò)用(355nm)Nd:YAG激光(Spectra Physics)照射樣本，并在23kV下以700ns/l.OkV延遲(delay)操作離子源，制備質(zhì)譜。每個(gè)質(zhì)譜記錄為20個(gè)連續(xù)光譜的總和，每個(gè)光譜通過(guò)單個(gè)光子脈沖來(lái)制備。來(lái)自添加標(biāo)準(zhǔn)物的離子用于質(zhì)量校準(zhǔn)。
羊水的SELDI分析將來(lái)自羊水樣本的總共0.5-3.0μg蛋白質(zhì)點(diǎn)樣到常相NP20(SiO2表面)、反相H4(疏水表面C-16(長(zhǎng)鏈脂肪族)，或固定的鎳(IMAC)SELDIProteinChip芯片(Ciphergen Biosystems，Inc.Fremont，CA)上。在室溫下溫育1小時(shí)，用5μl水洗滌NP1和H4芯片，去除未被結(jié)合的蛋白質(zhì)和干擾物質(zhì)(即緩沖液、鹽、去垢劑)。在空氣中干燥2-3分鐘后，加入兩份0.5μl的溶于50％乙腈(v/v)，0.5％三氟乙酸(v/v)中的飽和芥子酸溶液，在CiphergenProtein Biology System II(PBSII)中，用時(shí)間飛行質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)量分析，Issaq，J.H等人The SELDI-TOF MS Approach to proteomicsProtein Profilingand Biomarker Identification.Biochem Biophys Res Commun.5；292(3)587-92，2000。
多克隆抗體和Western免疫印跡用來(lái)自相應(yīng)蛋白質(zhì)的免疫原性肽生成兔多克隆抗體(DSL Laboratories，Webster，TX)。然后用親合純化的抗體進(jìn)行Western印跡。將100μg的AF蛋白質(zhì)溶解在4-20％SDS-PAGE中，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。對(duì)于母體血清，將300μg蛋白質(zhì)用于免疫沉淀，使用IGFBP1單克隆抗體(DSLLaboratories)，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行western印跡。對(duì)于檢測(cè)母體血清中的鈣粒蛋白B，將150μg的去除白蛋白的母體血清用于western印跡。用溶于PBST中的5％脫脂奶，在室溫下封閉膜45分鐘，并用1μg/ml第一抗體(IGFBP-1，azurocidin，維生素D結(jié)合蛋白和鈣粒蛋白-B，來(lái)自DSLhic.，Santa Cruz，CA)在4℃下溫育過(guò)夜。在用TBST洗滌三次后，膜用IgG-HRP第二抗體(Sigma)溫育，并用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光可視化。
實(shí)施例2在羊水中表達(dá)的蛋白質(zhì)和多肽的鑒定使用實(shí)施例1中所述的材料與方法，鑒定在正常的和被感染的羊水中所表達(dá)的蛋白質(zhì)和多肽。對(duì)人和靈長(zhǎng)類(lèi)羊水樣本(匯集的和單獨(dú)的)進(jìn)行如實(shí)施例1所述的蛋白質(zhì)分離(1-D，2-D和HPLC分離)。被分開(kāi)的蛋白質(zhì)(凝膠條帶、斑點(diǎn)和級(jí)分)用胰蛋白酶消化，生成肽集合(pool)。用串聯(lián)MS分析肽集合，以分析它們的氨基酸序列和組成。
采用光譜驗(yàn)證(verification)程序，選擇5000種MS光譜。用重新測(cè)序程序(Lutefisk，Peaks)，分析這些光譜文件，生成對(duì)應(yīng)于各肽的氨基酸序列。從肽集合中生成的新(de novo)序列用于檢索實(shí)施例1所述的蛋白質(zhì)和DNA數(shù)據(jù)庫(kù)。
采用同源性作圖和序列驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在羊水中表達(dá)各種蛋白質(zhì)。根據(jù)已知的結(jié)構(gòu)相似性(序列同源性作圖)分析被檢測(cè)的蛋白質(zhì)的潛在功能。發(fā)現(xiàn)屬于與大量疾病有關(guān)的重要功能種類(lèi)的蛋白質(zhì)。在人羊水中首次發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)和多肽列舉在下文表2的這些潛在的功能分類(lèi)中。
分別地標(biāo)記免疫測(cè)定所證實(shí)的被差別性地表達(dá)的蛋白質(zhì)以及在被感染羊水中更為廣泛或者獨(dú)特地出現(xiàn)的蛋白質(zhì)。在本文中，相對(duì)豐度被定義為代表測(cè)試樣本中的特定多肽或蛋白質(zhì)的肽的量，相對(duì)于參比樣本。因此，如果在被感染的羊水在出現(xiàn)比未被感染的參比羊水樣本中更多來(lái)源于相同蛋白的肽，則該蛋白質(zhì)更加豐富地被呈遞在被感染的羊水中。
表3列舉已知存在于羊水中的蛋白質(zhì)和多肽，它們的存在通過(guò)本發(fā)明的分析再次確定。作為與感染相關(guān)的事件的已知標(biāo)記的蛋白質(zhì)被分別地標(biāo)記。
表2.在人的羊水中首次發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)和多肽。
*免疫分析中證明被差別性地表達(dá)的蛋白質(zhì)#在被感染的羊水中，更加豐富或獨(dú)特地檢測(cè)到的代表這些蛋白的肽。
表3.先前已知存在于羊水中的蛋白質(zhì)和多肽，用重新測(cè)序鑒定。
*感染相關(guān)事件的已知標(biāo)記。
在羊水中首次發(fā)現(xiàn)的其他蛋白質(zhì)被提供在如下的表4中。
表4
IPI＝國(guó)際蛋白質(zhì)索引(index)
子宮內(nèi)病征的診斷標(biāo)記在上面的表格中列舉的蛋白質(zhì)是用于檢測(cè)和監(jiān)控子宮內(nèi)病征的有前景候選物。一些這種癥狀和相應(yīng)的蛋白質(zhì)標(biāo)記將在下文中詳細(xì)討論。
肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)的和相關(guān)的蛋白作為發(fā)育缺陷的標(biāo)記膜突蛋白(膜組織伸展刺突蛋白)，列舉在表2的結(jié)構(gòu)蛋白中，已知其負(fù)責(zé)將跨膜蛋白連接到肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架上，與各種細(xì)胞信號(hào)路徑相關(guān)(Speck O，等人Moesin functions antagonistically to the Rho pathway to maintainepithelial integrity.Nature 2；421(6918)83-7，2003)。已經(jīng)顯示，Rho家族的GTP酶及其效應(yīng)子調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白修飾分子的活性，例如絲切蛋白(cofilin)和抑制蛋白(也作為結(jié)構(gòu)蛋白列舉在表2中)，引起與生長(zhǎng)錐延伸或者收縮相關(guān)的細(xì)胞骨架的變化(Tang BL.Inhibitors of neuronal regenerationmediatorsand signaling mechanisms.Neurochem Int，42(3)189-203，2003)。冠蛋白樣蛋白p57(另一種列舉在表2中的結(jié)構(gòu)蛋白)也與肌動(dòng)蛋白的交聯(lián)和加帽有關(guān)(Weitzdoerfer R等人Reduction of actin-related protein complex 2/3 in fetalDown syndrom.Biochem Biophys res Commun.293836，2002)，并且在已知的發(fā)育缺陷是失調(diào)。凝溶膠蛋白(參見(jiàn)，列舉在表2中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白/結(jié)合蛋白的凝溶膠蛋白前體)，另一種肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)蛋白也在發(fā)育上被調(diào)控，而且在器官系統(tǒng)中是重要的(Arai M，Kwiatkowski DJ.Differential developmentallyregulated expression of gelsolin family members in the mouse.DevDyn，215，297，1999)。已知14-3-3蛋白是上皮標(biāo)記，其參與信號(hào)轉(zhuǎn)換和分化路徑，對(duì)于大腦和其他重要器官的發(fā)育是關(guān)鍵的(Wu C，Muslin AJ.Role of14-3-3proteins in early Xenopus development.Mech Dev，119，45，2002)。
因此，所列舉的肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)蛋白和其他相關(guān)分子在發(fā)育過(guò)程中具有重要作用，它們首次在人羊水中鑒定，可用于檢測(cè)各種器官系統(tǒng)的發(fā)育缺陷，例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)心血管系統(tǒng)和其他的肌肉骨骼畸形，它們可能是由例如染色體非整倍性造成。這對(duì)Profiling I來(lái)說(shuō)，尤其如此，已經(jīng)證明Profiling I在被感染的羊水中差別性地表達(dá)，并且這種差別性表達(dá)已經(jīng)通過(guò)免疫分析證實(shí)。
感染和免疫反應(yīng)相關(guān)異常的標(biāo)記本發(fā)明檢測(cè)巨噬細(xì)胞加帽蛋白，白血球彈性蛋白酶，嗜中性粒細(xì)胞明膠酶(gelatenase)相關(guān)lipocalicn，myleoperoxidase，L-網(wǎng)素(淋巴細(xì)胞胞質(zhì)蛋白)和鈣粒蛋白(參見(jiàn)表2中的免疫反應(yīng)相關(guān)基因的目錄)，感染的羊水是這些蛋白在羊膜內(nèi)感染時(shí)存在與調(diào)控的首個(gè)證明。這些蛋白質(zhì)的數(shù)種是對(duì)感染、炎癥和應(yīng)激響應(yīng)的免疫細(xì)胞的已知應(yīng)答者。巨噬細(xì)胞加帽蛋白(MCP)是Ca(2+)敏感性蛋白，其調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲，參與炎癥過(guò)程(Dabiri GA，Molecular cloning of human macrophage capping protein cDNA.A uniquemember of the gelsolin/villin family expressed primarily in macrophages J BiolChem 15；267(23)16545-52，1992)。類(lèi)似地，鈣粒蛋白是鈣結(jié)合蛋白，已知在損傷和傷口愈合中起作用(Thorey IS.等人，The Ca2+-binding proteinsS100A8and S100A9 are encoded by novel injury-regulated genes.J Biol Chem21；276(38)35818-25，2001)。白血球彈性蛋白酶和嗜中性白細(xì)胞明膠酶相關(guān)lipocalcin(NGAL)與細(xì)菌抑制和細(xì)菌溶解機(jī)制相關(guān)(Goetz DH.等人.Theneutrophil lipocalin NGAL is a bacteriostatic agent that interferes withsiderophore-mediated iron acquisition.Mol Cell 10(5)1033-43，2002)。
除了上面的免疫調(diào)節(jié)物，本發(fā)明人還首次在被感染的羊水中發(fā)現(xiàn)兩種抗菌蛋白Fall-39和azurocidin?？咕鞍譌all-39(LL-37)結(jié)合到細(xì)菌的脂多糖(lps)上，在骨髓、睪丸和嗜中性粒細(xì)胞中表達(dá)。Fall-39刺激肥大細(xì)胞脫粒，是肥大細(xì)胞的潛在趨化因子。除了抗菌活性外，F(xiàn)all-39潛在地能夠?qū)⒎蚀蠹?xì)胞補(bǔ)充到炎癥病灶上。在存在基礎(chǔ)培養(yǎng)基E時(shí)，合成的FALL-39抵抗大腸桿菌D21和Bacillus megaterium Bmll的活性很高。已經(jīng)有人提出了Fall 39的保護(hù)作用，當(dāng)皮膚屏障的完整性被破壞時(shí)，其參與第一道防線，防止局部感染和系統(tǒng)性細(xì)菌侵入(Agerberth B，等人FALL-39，a putativehuman peptide antibiotic，is cysteine-free and expressed in bone marrow andtestis.Proc Natl Acad Sci U S A，3；92(1)195-9，1995)。
Azurocidin(CAP37)是一種陽(yáng)離子抗菌蛋白，從人的嗜中性粒細(xì)胞中分離得到，與宿主防御和發(fā)炎十分相關(guān)。Azurocidin在炎癥過(guò)程中被釋放，調(diào)節(jié)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞功能，例如化學(xué)趨向性，提高存活，和分化(PereiraHA.CAP37，a neutrophil-deriVed multifunctional inflammatory mediator.JLeukoc Biol；57(6)805-12，1995)。
蛋白酶和蛋白酶抑制劑在蛋白調(diào)節(jié)中起重要作用，從而控制多個(gè)關(guān)鍵的生理學(xué)機(jī)制。本發(fā)明人已經(jīng)首次確定，在人的羊水中，包含羊膜內(nèi)感染，表達(dá)蛋白酶的絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)家族(Serpin，鱗片狀上皮細(xì)胞癌抗原1&2，神經(jīng)膠質(zhì)來(lái)源的連接蛋白)。絲氨酸蛋白酶抑制劑的serpin超家族在控制許多生物學(xué)路徑中的蛋白酶中起重要作用，與構(gòu)象疾病相關(guān)，例如淀粉樣變性病(amyloidoses)、朊病毒腦病和享廷頓病(Huntington)和阿茨海默氏病(Alzheimer disease)(Lomas DA，Carrell RW，Serpinopathies and theconformational dementias.Nat Rev Genet；3759，2002)。
另外，在羊膜內(nèi)感染中，本發(fā)明人確定的半胱氨酸蛋白酶抑制劑的表達(dá)，半胱氨酸蛋白酶抑制劑是公知的蛋白酶抑制劑，其參與免疫調(diào)節(jié)(Vray B，Hartmann S，Hoebeke J.Immunomodulatory properties of cystatins.Cell MolLife Sci；59(9)1503-12，2002)。
所列舉的蛋白質(zhì)是感染和/或免疫反應(yīng)相關(guān)異常的有前景的標(biāo)記。
值得注意的是，相對(duì)于正常的羊水，在被感染的羊水中更加豐富或獨(dú)特地檢測(cè)到肽呈遞(representing)巨噬細(xì)胞加帽蛋白，嗜中性白細(xì)胞明膠酶相關(guān)lipocalin，髓過(guò)氧化物酶前體，L-網(wǎng)素，azurocidin，抗菌蛋白Fall-39，鈣粒蛋白A，抑制蛋白I，神經(jīng)膠質(zhì)來(lái)源的連接蛋白，serpinI2，和半胱氨酸蛋白酶抑制劑A，和/或在免疫測(cè)定中顯示出差別性的表達(dá)。
因此，這些蛋白特別重要地作為羊膜內(nèi)感染和/或免疫反應(yīng)相關(guān)異常的標(biāo)記。
在人的羊水檢測(cè)到的其他疾病(感染)特異蛋白在人的被感染羊水中檢測(cè)到列舉在表2中的Gp-340變體蛋白，該蛋白是一種先前在肺部鑒定的清除劑(scavenger)的受體。已知這種蛋白會(huì)結(jié)合到細(xì)菌上(鏈球菌及其變體)。在被感染的羊水中檢測(cè)到這種蛋白補(bǔ)充了一種本發(fā)明的靈敏的蛋白質(zhì)組方法，用于鑒定IAI的生物標(biāo)記。因此，在被感染的羊水中鑒定的Gp-340變體蛋白使之可用于檢測(cè)新生兒膿毒病)。
IGFBP-1(蛋白質(zhì)水解片段)如表2中所示，IGFBP-1被證明在被感染的羊水中差別性的表達(dá)。胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)系統(tǒng)與胎兒和胎盤(pán)生長(zhǎng)密切相關(guān)，在子宮內(nèi)膜中通過(guò)自分泌/旁分泌機(jī)制調(diào)節(jié)甾類(lèi)激素作用。IGF-I和IGF-II刺激增殖和分化，并且在體外以多個(gè)細(xì)胞類(lèi)型維持分化細(xì)胞功能。子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞生產(chǎn)IGF-I和IGF-II以及高親合性的IGF-結(jié)合蛋白(IGFBPs)。六種高親合性的IGFBP的mRNA在人的子宮內(nèi)膜中表達(dá)，IGFBP調(diào)節(jié)IGF的作用。人的子宮內(nèi)膜中最豐富的IGFBP是IGFBP-1，是由預(yù)蛻膜化/蛻膜化的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞在較晚的分泌階段和懷孕過(guò)程中分泌。這與臨床產(chǎn)科學(xué)和婦科醫(yī)學(xué)有關(guān)，有證據(jù)表明IGFBP-1在先兆子癇、子宮內(nèi)生長(zhǎng)受限、多囊性卵巢綜合癥以及滋養(yǎng)層和子宮內(nèi)膜贅生物中具有病理生理作用。
IGFBP-1的蛋白質(zhì)水解片段在人的羊水和母體血清中存在和調(diào)控，開(kāi)辟一條新的用于監(jiān)控與懷孕相關(guān)的子宮內(nèi)的和母體的癥狀的途徑。
對(duì)于進(jìn)一步的詳細(xì)描述參見(jiàn)，下文的實(shí)施例12。
實(shí)施例3子宮內(nèi)感染后的靈長(zhǎng)類(lèi)和人的羊水的蛋白質(zhì)表達(dá)模式在235激光強(qiáng)度下收集結(jié)合到化學(xué)確定的常相芯片陣列上的AF提取物的完整光譜SELDI-TOF MS分析結(jié)果，顯示在被感染的和未被感染的靈長(zhǎng)類(lèi)和人AF之間，在3-5kDa和11-12kDa區(qū)域存在數(shù)個(gè)峰值強(qiáng)度差異。
子宮內(nèi)感染后的靈長(zhǎng)類(lèi)羊水的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜與相應(yīng)的正常表達(dá)圖譜比較，顯示在附圖1A-C中。如附圖1A-C中所闡明，對(duì)照和被感染的羊水的完整(global)蛋白表達(dá)圖譜是明顯不同的。較小質(zhì)量范圍內(nèi)的羊水圖譜的詳細(xì)光譜(附圖1B和1C)表明，約在3-5Kda和10-12Kda的范圍內(nèi)，對(duì)照的和被感染的樣本之間的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜具有明顯和特征性的差別。這闡明了對(duì)子宮內(nèi)感染反應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)的總體調(diào)控以及能夠檢測(cè)診斷子宮內(nèi)感染的獨(dú)特表達(dá)特征。
附圖2顯示靈長(zhǎng)類(lèi)羊水對(duì)感染反應(yīng)的時(shí)程分析(GBS)。在接種細(xì)菌之前，收集羊水，并且在感染之后進(jìn)行連續(xù)收集，進(jìn)行如實(shí)施例1中所述的SELDI-TOF分析。附圖2A顯示感染前的蛋白質(zhì)蛋白圖譜，附圖2B為感染后12小時(shí)，而附圖2C為感染后36小時(shí)。
如附圖2C中所示，子宮內(nèi)感染的診斷性峰值(10-11KDa)在急性感染的36小時(shí)內(nèi)明顯達(dá)到高表達(dá)水平。這表明診斷性蛋白質(zhì)圖譜可用于監(jiān)控疾病狀態(tài)和對(duì)處理的反應(yīng)。
附圖3顯示對(duì)結(jié)合到化學(xué)確定(chemicaily defined)的常相芯片陣列上的人羊水提取物的SELDI-TOF分析結(jié)果。附圖3A顯示235激光強(qiáng)度下的完整光譜。附圖3B顯示在10-12kDa區(qū)域內(nèi)，被感染的和對(duì)照樣本之間的差異的詳細(xì)光譜。附圖3顯示在3-5kDa區(qū)域內(nèi)，被感染的和對(duì)照樣本之間的特征性差異的詳細(xì)光譜。
如附圖3A-C中所示，對(duì)照和被感染的羊水的完整蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜是明顯不同的。在較小質(zhì)量范圍內(nèi)的羊水圖譜的詳細(xì)光譜(附圖3B和C)表明，在對(duì)照和被感染樣本之間，過(guò)度表達(dá)的蛋白質(zhì)(3-5Kda和10-12Kda范圍)明顯不同。對(duì)蛋白峰值相對(duì)強(qiáng)度的分析表明，存在兩個(gè)明顯不同的診斷簇(10-12kDa和3-5kDa范圍)。這闡明了對(duì)子宮內(nèi)感染反應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)的總體調(diào)控以及能夠在人和靈長(zhǎng)類(lèi)模型中檢測(cè)診斷子宮內(nèi)感染的獨(dú)特表達(dá)特征。
值得注意的是，人羊水的診斷圖譜與靈長(zhǎng)類(lèi)羊水的診斷圖譜十分一致(實(shí)施例3和4)。
實(shí)施例4使用不同的質(zhì)譜儀生成診斷性的圖譜用不同類(lèi)型的質(zhì)譜儀檢測(cè)診斷性的蛋白質(zhì)蛋白圖譜。已經(jīng)檢查不同的質(zhì)譜儀是否生成類(lèi)似的診斷圖譜。如果診斷性圖譜基本上不依賴于質(zhì)譜儀的類(lèi)型，在羊水中檢測(cè)到的差別性蛋白表達(dá)給子宮內(nèi)感染提供診斷性的特征。
附圖4顯示在普通MALDI-TOF質(zhì)譜儀上獲得的質(zhì)量光譜(Jensen ON，等人，Direct observation of W-crosslinked protein-nucleic acid complexes bymatrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry.Rapid CommunMass Spectrom 7(6)496-501(1993))，使用未發(fā)生子宮內(nèi)感染的人對(duì)照(A)的羊水和發(fā)生子宮內(nèi)感染的樣本(B)。
如附圖4A和B中所示，用可替代的質(zhì)譜儀，檢測(cè)10-12KDa范圍內(nèi)的子宮內(nèi)感染的診斷性圖譜，其與用SELDI-TOF儀器檢測(cè)的圖譜類(lèi)似。這表明差別性蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜是恒定的(robust)，可用大量的現(xiàn)有質(zhì)譜儀來(lái)檢測(cè)。
總之，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)羊水蛋白質(zhì)和多肽表現(xiàn)出診斷疾病狀態(tài)的差別性表達(dá)圖譜。在此提供的結(jié)果證明，可以用多種質(zhì)譜分析方法檢測(cè)疾病特異性圖譜。在人和靈長(zhǎng)類(lèi)之間進(jìn)行圖譜或蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜的比較。該圖譜用于監(jiān)控時(shí)程(感染或處理)的結(jié)果。
實(shí)施例5量化羊水中的蛋白和多肽表達(dá)，用于診斷和預(yù)后監(jiān)控
SDS-PAGE用丙酮從含有高濃度鹽的羊水(AF)中沉淀蛋白質(zhì)。在15％SDS-PAGE上，對(duì)100μg的羊水蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳。凝膠用考馬斯藍(lán)R-250染色。用Bio-Rad凝膠掃描儀掃描凝膠圖像。
附圖5顯示A)4種人對(duì)照AF匯集樣本；B)單一的對(duì)照AF樣本；C)4種被感染的AF匯集樣本；和D)單一的被感染的AF樣本的SDS-考馬斯藍(lán)染色凝膠。
附圖5顯示在10-15Kda范圍內(nèi)，對(duì)照和被感染的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的顯著差別。一般認(rèn)為，用質(zhì)譜儀檢測(cè)的具有該質(zhì)量的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)水解片段中的一些生成反應(yīng)該蛋白質(zhì)表達(dá)水平的診斷性圖譜，具有診斷性和預(yù)后用途。
實(shí)施例6來(lái)自子宮內(nèi)感染的羊水的Western印跡分析在200V下，在4-20％SDS-PAGE上對(duì)100μg的AF蛋白電泳60分鐘，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以90mM處理75分鐘。該膜用5％奶PBST在室溫下封閉45分鐘，并且用1μg/ml第一抗體(Santa Cruz and Dako)在4℃下溫育過(guò)夜。在用TBST洗滌3次后，該膜用第二抗體IgG-HRP(Sigma)在室溫下溫育90分鐘，用ECL(Pierce)可視化。
結(jié)果顯示在附圖6中A)對(duì)照AF樣本(匯集的)；B)感染的AF樣本(匯集的)。附圖6表明，與未被感染的AF相比，IGFBP1(11KDa)、抑制蛋白和血漿銅藍(lán)蛋白(130KDa)在被感染的AF中高水平表達(dá)。與對(duì)照AF樣本相比，被感染樣本中的L-網(wǎng)素水平較低。用MS方法(重新測(cè)序)，還從人的被感染樣本中鑒定這些蛋白，列舉在上文的實(shí)施例2中。
實(shí)施例7來(lái)自子宮內(nèi)感染的羊水的免疫沉淀分析將2毫克的第一抗體與600μg的AF蛋白混合，并在4℃下溫育過(guò)夜。加入15μl蛋白G瓊脂糖珠，室溫下在搖床上溫育60分鐘。用IP緩沖液洗滌洗滌珠6次。
結(jié)果顯示在附圖7中，其中(A)顯示對(duì)照羊水樣本(匯集的)，(B)顯示被感染的羊水樣本。附圖7表明，與對(duì)照羊水相比，血漿銅藍(lán)蛋白(～130KDa)和鈣粒蛋白(～16KDa)在被感染的羊水中的表達(dá)水平較高。
實(shí)施例8人的羊水和母體血清中的差別性蛋白表達(dá)的檢測(cè)已經(jīng)檢查，在羊水中差別性地表達(dá)的蛋白質(zhì)是否可用作一種引導(dǎo)，檢測(cè)母體血清中的類(lèi)似蛋白質(zhì)。這使得能夠開(kāi)發(fā)用于診斷和監(jiān)控的快速而非侵入性的檢測(cè)方法。結(jié)果顯示在附圖8中，其中(A)顯示對(duì)照羊水樣本(匯集的)，(B)顯示被感染的羊水樣本(匯集的)。附圖8表明，在對(duì)子宮內(nèi)感染反應(yīng)時(shí)，較小的IGFBP-1蛋白質(zhì)水解片段一致地在AF和母體血清中被差別性地表達(dá)。
實(shí)施例9來(lái)自子宮內(nèi)感染的羊水的蛋白微陣列分析抗體IGFBP-1(DSL)；補(bǔ)體C3，結(jié)蛋白(Desmin)，嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶，NSE抗體(DAKO)；鈣粒蛋白，血漿銅藍(lán)蛋白，TIMP-1，網(wǎng)素和Profiling(Santa Cruz)。
抗體打點(diǎn)將抗體溶解在40％甘油，60％PBS，pH 7.5中，濃度為100μg/ml，用Arrayer(Cartesian)打點(diǎn)到乙醛載玻片上。
室溫下，在濕潤(rùn)的腔室中溫育3小時(shí)，接著，室溫下，載玻片在含有1％BSA(w/v)的PBS溶液，pH 7.5中溫育1小時(shí)，輕輕攪拌。
蛋白質(zhì)的生物素化將生物素-NHS以50mg/l溶解在雙蒸(DD)水中。將10μl這種溶液添加到母體血清蛋白溶液(以5mg/ml溶解在10mM PB中，pH8.5)中，在搖床上溫育3小時(shí)。加入5μl乙醇胺來(lái)終止反應(yīng)。將生物素化的蛋白質(zhì)稀釋在200μl的TNB緩沖液中，并添加到抗體陣列中，在4℃下溫育過(guò)夜。在TNT緩沖液中洗滌3次后，加入鏈霉抗生物素蛋白-HRP，在室溫下溫育30分鐘。用Cy5-tyramide熒光檢測(cè)抗原-抗體的相互作用。在PE熒光掃描儀上掃描載玻片，進(jìn)行量化。用圖像分析程序，將對(duì)照的和被感染的載玻片的圖像重疊，生成相對(duì)豐度的偽色彩圖像。該結(jié)果顯示在附圖9中，其是顯示相應(yīng)的蛋白與其抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)陣列的偽色彩(pseudocolor)圖像。綠色表示被感染的樣本，紅色表示對(duì)照樣本。部分II是放大的陣列區(qū)域，顯示鈣粒蛋白在被感染血清樣本中的表達(dá)水平較高(綠色)。部分III是鈣粒蛋白IP的western印跡，顯示在被感染的羊水樣本中表達(dá)水平類(lèi)似地升高。
實(shí)施例10
進(jìn)一步分析以被感染羊水的獨(dú)特診斷特征呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)已經(jīng)證明，對(duì)照的和被感染的羊水的SELDI-TOF圖譜在10-12Kda的質(zhì)量范圍顯示具有獨(dú)特的特征(附圖1，2和3)，代表陽(yáng)性感染的樣本。溶解在1-D凝膠中的對(duì)照和被感染的羊水(附圖5)也具有質(zhì)量范圍為10-12Kda的條帶，在匯集的或單獨(dú)的被感染的羊水樣本中，該條帶更為豐富。如附圖13中所示，分離這些1-D凝膠條帶，并用LCQ-MS進(jìn)行進(jìn)一步分析，所鑒定的肽代表IGF-BR-1和S-100鈣結(jié)合蛋白。如附圖8中所示，用抗IGF-BPl抗體Western印跡分析對(duì)照和被感染的羊水，也證明了蛋白質(zhì)水解片段(～11KDa)在感染中被差別性地表達(dá)。
對(duì)羊水多肽進(jìn)行測(cè)序，還確定在被感染的羊水中存在IGF-BPl和鈣粒蛋白(表3)。
所鑒定的新的IGFBP-1的蛋白質(zhì)水解片段的序列顯示在附圖12中(SEQID NO1)。在該附圖中，在對(duì)被感染的羊水進(jìn)行1-D凝膠電泳、胰蛋白酶消化和MS/MS分析后，存在于樣本“0426seq_HI_12”和“0425seq_HI-113”中的肽序列顯示在小寫(xiě)中(lower case)(SEQ ID NOs2和3)。在對(duì)來(lái)自被感染羊水的胰蛋白酶消化的～10.5-12Kda的條帶進(jìn)行1-D凝膠(小分子量范圍，附圖5)、Western印跡(附圖6)和MS/MS分析(附圖13)，檢測(cè)到IGF-BP-1的蛋白質(zhì)水解片段，表示為下劃線序列區(qū)域(SEQ ID NO4)。
實(shí)際上，MS/MS分析和序列檢索結(jié)果證明顯示在附圖13中的質(zhì)譜中的母離子(parent ion)434.89表示IGF-BP-1序列(RSPGSPEIR)，還顯示在附圖12的IGF-BP-1的蛋白質(zhì)水解片段的序列圖譜上。母離子1082.97代表S-100鈣結(jié)合蛋白(即，鈣粒蛋白A和B)，還通過(guò)對(duì)AF重新測(cè)序獨(dú)立地鑒定(表2和3)。
附圖14顯示在附圖13中的17.55-18.21分鐘的保持時(shí)間峰值的質(zhì)譜。顯然，主要峰值出現(xiàn)在質(zhì)量434.9上。附圖15顯示附圖14中的434.9峰值的母離子的MS/MS光譜。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，母體離子對(duì)應(yīng)于IGFBP-1的部分序列。
實(shí)施例11IAI生物標(biāo)記的免疫檢測(cè)為了評(píng)價(jià)在IAI中鑒定的蛋白質(zhì)的差別性表達(dá)，從11-kDa SELDI-TOFMS圖譜中選擇兩個(gè)標(biāo)記(鈣粒蛋白B和IGFBP-1)，在完整的(global)蛋白質(zhì)表達(dá)分析中，鑒定一種免疫調(diào)節(jié)分子(azurocidin)和一種未被調(diào)節(jié)的蛋白(維生素D結(jié)合蛋白)。如附圖16中所示，western印跡分析證實(shí)了所有的三種顯示出差別性表達(dá)的生物標(biāo)記，這與在IAI羊水中進(jìn)行的蛋白質(zhì)鑒定試驗(yàn)結(jié)果一致。
采用被開(kāi)發(fā)來(lái)抵抗IGFBP-1和鈣粒蛋白B的特異抗體，研究在匯集母體血清中是否能夠鑒定到被差別性地表達(dá)的蛋白質(zhì)，血清來(lái)自有限數(shù)量患者(n＝5)，血清是可獲得的。IGFBP-1和鈣粒蛋白B的11kDa蛋白質(zhì)水解片段對(duì)應(yīng)于11-kDa峰值，與對(duì)照羊水相比，該片段差別性地存在于被感染的羊水，在該有限分析中，在對(duì)IAI反應(yīng)的母體血清中也檢測(cè)到該片段(附圖16d和e)。在母體血清中未檢測(cè)到Azurocidin。
實(shí)施例12表征染色體非整倍性的診斷性圖譜對(duì)蛋白質(zhì)組作圖的有效性(utility)進(jìn)行檢查，用母體血清篩選更加精確地鑒定三體性-21。用(對(duì)照(n＝6)，三體性-21(n＝6)和三體性-18(n＝4)的組進(jìn)行該研究，充分表征的母體血清樣本(相同情形下與羊水樣本匹配，用標(biāo)準(zhǔn)的染色體作圖方法檢測(cè)，確定存在三體性)，用上述用于子宮內(nèi)感染模型的SELDI-TOF方法學(xué)進(jìn)行分析。
附圖10顯示在母體血清中的差別性的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，具有辨別三體性的獨(dú)特模式。如較早所描述，將1毫克的母體血清(在用蛋白質(zhì)分離柱除去白蛋白和免疫球蛋白后，BioRad technologies)用于進(jìn)行母體血清提取物的SELDI-TOF分析，該提取物結(jié)合到化學(xué)確定的常相芯片陣列上。在235的激光強(qiáng)度下收集的整個(gè)光譜顯示出峰值強(qiáng)度上的差別。A)對(duì)照血清；B)三體性-21(Down′s)血清；C)三體性-18血清。詳細(xì)的光譜顯示在4-15Kda范圍內(nèi)，獨(dú)特于各種情況的差別。箭頭指示診斷性峰值，該峰值被組合用于表示一種算法，以開(kāi)發(fā)診斷性的篩選檢測(cè)。這進(jìn)一步闡明，檢測(cè)各種生物液體(例如母體血清)中的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜能夠更加精確地和以非侵入的途徑鑒定胎兒-母體癥狀。
在利用臨床上相關(guān)的微生物的試驗(yàn)靈長(zhǎng)類(lèi)模型中和在感染不同微生物的婦女中，在SELDI-TOF MS中檢測(cè)在發(fā)生IAI的情形下顯著過(guò)度表達(dá)的11-kDa峰值，確認(rèn)這種特征對(duì)由廣泛的病原體引起的IAI的特異性。該過(guò)度表達(dá)的簇可能代表一種對(duì)感染的基礎(chǔ)子宮內(nèi)的免疫反應(yīng)，因?yàn)樵摢?dú)特的簇中的一組被鑒定蛋白質(zhì)，即鈣粒蛋白，是S-100鈣結(jié)合蛋白家族的成員，由急性發(fā)炎組織中的巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞表達(dá)。來(lái)自該簇的第二種候選，IGFBP-1的特異的蛋白質(zhì)水解片段，指示對(duì)感染反應(yīng)的潛在蛋白酶相關(guān)機(jī)制。完整的IGFBP-1是存在于AF中的主要IGFBP，由胎膜和母體蛻膜合成。雖然，IGFBP的蛋白質(zhì)水解斷裂是一種被充分表征的現(xiàn)象(Maile等人.IGFbinding protein hydrolysis in various clinical states.InThe IGF System，InRosenfeld CR，Roberts C，Jr.，編輯.Totowa，NJHumana Press，1999)，在本研究中描述的特定片段先前未被描述。
在第二種方法中，用LC-MS/MS，對(duì)在對(duì)照和IAI的AF中表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行表征，首次在IAI中鑒定了相當(dāng)多的感染和免疫反應(yīng)相關(guān)分子。巨噬細(xì)胞加帽蛋白(MCP)是一種Ca+2-敏感蛋白，其調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲，與炎癥過(guò)程相關(guān)(Dabri等人.J Biol Chem 26716545-52(1992))。白血球彈性蛋白酶和嗜中性白細(xì)胞明膠酶相關(guān)lipocalcin(NGAL)與細(xì)菌抑制和細(xì)菌溶解機(jī)制相關(guān)(Goetz等，Mol Cell1)1033-43(2002))。
除了上面的免疫調(diào)節(jié)物外，在對(duì)感染反應(yīng)時(shí)，在AF中檢測(cè)到抗菌蛋白Fall-39和azurocidin，給子宮內(nèi)免疫反應(yīng)提供新的視角?？咕鞍譌all-39(LL-37)結(jié)合到細(xì)菌脂多糖上，是肥大細(xì)胞的一種潛在趨化因子，作為第一道防線，防止局部感染和系統(tǒng)性的細(xì)菌侵入(Agerberth等人，ProcNatlAcadsCI usa 92195-9(1995))。Azurocidin(CAP37)是一種陽(yáng)離子抗菌蛋白，從人的嗜中性粒細(xì)胞分離得到，與宿主防御和感染密切相關(guān)(pEREIRA，j.IEUKOC bIOL 57805-12(1995))。Gp-340變體蛋白是先前在肺部鑒定的清除劑(scavenger)受體，結(jié)合細(xì)菌(Prakobhol等人，J Biol Chem27539860-6(2000))。這些蛋白的鑒定補(bǔ)充了用于鑒定IAI的生物標(biāo)記的靈敏的蛋白質(zhì)組方法。
目前可獲得的用于確認(rèn)對(duì)IAI的診斷的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)包括，測(cè)量母體C-反應(yīng)活性蛋白，直接檢查AF中的白血球或者革蘭氏染色細(xì)菌，AF微生物培養(yǎng)或PCR，測(cè)量AF葡萄糖和IL-6的濃度，以及檢測(cè)AF白血球酯酶。僅對(duì)羊水進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和廣譜的細(xì)菌rDNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是靈敏的和對(duì)IAI特異。但是，對(duì)生殖器支原體進(jìn)行微生物培養(yǎng)或者基于PCR的檢測(cè)并不是可以廣泛獲得，羊水診斷要求獲得羊水?；诘鞍踪|(zhì)組的方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是候選的肽生物標(biāo)記可以開(kāi)發(fā)快速的點(diǎn)服務(wù)(point-of-service)和低成本(cost-effective)的診斷免疫分析方法。用其他AF和血清篩選檢測(cè)進(jìn)行類(lèi)推(例如，用于神經(jīng)管缺陷的α-胎蛋白)，在被感染的羊水中鑒定的肽也在母體血清中檢測(cè)到，并且用于非侵入性的診斷檢測(cè)中。在前面的實(shí)施例特別是那些利用匯集的母體血清的實(shí)施例中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)證明，這些方法的可行性，在這些方法中，IGFBP-1限制性片段和鈣粒蛋白B是兩種這樣的生物標(biāo)記，它們存在于IAI過(guò)程中的AF和母體血清中，但是在不存在感染時(shí)則不存在這種生物標(biāo)記。
總之，對(duì)AF的基于蛋白質(zhì)組分析被用于在實(shí)驗(yàn)性非人靈長(zhǎng)類(lèi)模型和一群具有早產(chǎn)和occult IAI的婦女中鑒定IAI的生物標(biāo)記。通過(guò)SELDI-TOF MS作圖鑒定診斷性的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，在檢測(cè)IAI時(shí)，該圖譜是靈敏和特異的。高通量分析在AF中表達(dá)的蛋白質(zhì)，首次鑒定數(shù)種免疫調(diào)控分子的表達(dá)。在診斷性11kDa峰值(IGFBP-1和鈣粒蛋白B)中檢測(cè)蛋白質(zhì)的免疫檢測(cè)證明在IAI過(guò)程中在羊水和母體血液中存在和差別性表達(dá)這些生物標(biāo)記。在此呈遞的數(shù)據(jù)作為用于快速和非侵入性分析的基礎(chǔ)，以檢測(cè)懷孕過(guò)程中的神秘IAI。這是一個(gè)重要突破，因?yàn)檫@使得臨床醫(yī)生和研究人員為特定研究和在治療試驗(yàn)中，確定特定亞組的處于高度早產(chǎn)危險(xiǎn)的婦女。最后，這些研究證明，基于蛋白質(zhì)組方法用于鑒定傳染性和炎癥過(guò)程和懷孕的病理生理性的癥狀的特定生物標(biāo)記和診斷性圖譜的用途。因此，在此提供的數(shù)據(jù)證明，羊水以及其他生物液體如血清中的蛋白的差別性表達(dá)，提供了一種用于快速、非侵入性的和精確的診斷、預(yù)后和監(jiān)控各種母體/胎兒癥狀和染色體非整倍性的有效方法。
在整個(gè)前述說(shuō)明書(shū)中，本發(fā)明參考確定的實(shí)施方案被討論，但是這些實(shí)施方案不是如此被限制的。實(shí)際上，除了在此給出和描述的那些，根據(jù)前面的說(shuō)明，本發(fā)明的各種修改對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯然的，并且落入附隨的權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中引用的所有參考文獻(xiàn)，以及其中引用的參考文獻(xiàn)，在此全文清楚地引入作為參考。
序列表<110>普羅特奧格尼克斯公司(PROTEOGENIX，INC.)ROSENFELD，RonNAGALLA，SriGRAVETT，Mike<120>生物液體的蛋白質(zhì)組分析<130>39767-0002PCT<140>Unassigned<141>Herewith<150>US 10/400,005<151>2003-03-25<160>11<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>259<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Met Ser Glu Val Pro Val Ala Arg Val Trp Leu Val Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Thr Val Gln Val Gly Val Thr Ala Gly Ala Pro Trp Gln Cys Ala Pro20 25 30Cys Ser Ala Glu Lys Leu Ala Leu Cys Pro Pro Val Ser Ala Ser Cys35 40 45Ser Glu Val Thr Arg Ser Ala Gly Cys Gly Cys Cys Pro Met Cys ALa50 55 60Leu Pro Leu Gly Ala Ala Cys Gly Val Ala Thr Ala Arg Cys Ala Arg65 70 75 80Gly Leu Ser Cys Arg Ala Leu Pro Gly Glu Gln Gln Pro Leu His Ala85 90 95Leu Thr Arg Gly Gln Gly Ala Cys Val Gln Glu Ser Asp Ala Ser Ala100 105 110Pro His Ala Ala Glu Ala Gly Ser Pro Glu Ser Pro Glu Ser Thr Glu115 120 125Ile Thr Glu Glu Glu Leu Leu Asp Asn Phe His Leu Met Ala Pro Ser130 135 140Glu Glu Asp His Ser Ile Leu Trp Asp Ala Ile Ser Thr Tyr Asp Gly145 150 155 160Ser Lys Ala Leu His Val Thr Asn Ile Lys Lys Trp Lys Glu Pro Cys165 170 175Arg Ile Glu Leu Tyr Arg Val Val Glu Ser Leu Ala Lys Ala Gln Glu180 185 190Thr Ser Gly Glu Glu Ile Ser Lys Phe Tyr Leu Pro Asn Cys Asn Lys195 200 205Asn Gly Phe Tyr His Ser Arg Gln Cys Glu Thr Ser Met Asp Gly Glu210 215 220Ala Gly Leu Cys Trp Cys Val Tyr Pro Trp Ash Gly Lys Arg Ile Pro225 230 235 240Gly Ser Pro Glu Ile Arg Gly Asp Pro Asn Cys Gln Ile Tyr Phe Ash245 250 255Val Gln Asn
<210>2<211>14<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Ala Leu Pro Gly Glu Gln Gln Pro Leu His Ala Leu Thr Arg1 5 10<210>3<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3Arg Ile Pro Gly Ser Pro Glu Ile Arg1 5<210>4<211>94<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Ala Leu His Val Thr Asn Ile Lys Lys Trp Lys Glu Pro Cys Arg Ile1 5 10 15Glu Leu Tyr Arg Val Val Glu Ser Leu Ala Lys Ala Gln Glu Thr Ser20 25 30Gly Glu Glu Ile Ser Lys Phe Tyr Leu Pro Asn Cys Asn Lys Asn Gly35 40 45Phe Tyr His Ser Arg Gln Cys Glu Thr Ser Met Asp Gly Glu Ala Gly50 55 60Leu Cys Trp Cys Val Tyr Pro Trp Asn Gly Lys Arg Ile Pro Gly Ser65 70 75 80Pro Glu Ile Arg Gly Asp Pro Asn Cys Gln Ile Tyr Phe Asn85 90<210>5<211>139<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>5Ala Gly Trp Asn Ala Tyr Ile Asp Asn Leu Met Ala Asp Gly Thr Cys1 5 10 15Gln Asp Ala Ala Ile Val Gly Tyr Lys Asp Ser Pro Ser Val Trp Ala20 25 30Ala Val Pro Gly Lys Thr Phe Val Asn Ile Thr Pro Ala Glu Val Gly35 40 45Val Leu Val Gly Lys Asp Arg Ser Ser Phe Tyr Val Asn Gly Leu Thr50 55 60Leu Gly Gly Gln Lys Cys Ser Val Ile Arg Asp Ser Leu Leu Gln Asp65 70 75 80Gly Glu Phe Ser Met Asp Leu Arg Thr Lys Ser Thr Gly Gly Ala Pro85 90 95Thr Phe Asn Val Thr Val Thr Lys Thr Asp Lys Thr Leu Val Leu Leu100 105 110Met Gly Lys Glu Gly Val His Gly Gly Leu Ile Asn Lys Lys Cys Tyr
115 120 125Glu Met Ala Ser His Leu Arg Arg Ser Gln Tyr130 135<210>6<211>10<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>6Pro Ser Val Trp Ala Ala Ala Gly Pro Arg1 5 10<210>7<211>14<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>7Ser Thr Gly Gly Ala Pro Thr Phe Asn Val Thr Val Thr Lys1 5 10<210>8<211>16<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>8Thr Phe Val Asn Ile Thr Pro Ala Glu Val Gly Val Leu Val Gly Lys1 5 10 15<210>9<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>9Asp Ser Pro Ser Val Trp Ala Ala Val Pro Gly Lys1 5 10<210>10<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>10Asp Ser Pro Ser Val Trp Ala Ala Val Pro Gly Lys1 5 10<210>11<211>16<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>11Thr Phe Val Asn Ile Thr Pro Ala Glu Val Gly Val Leu Val Gly Lys1 5 10 1權(quán)利要求
1.用于確定母體或胎兒癥狀的狀態(tài)的方法，包括將從哺乳動(dòng)物受試者獲得的生物液體的測(cè)試樣本的蛋白質(zhì)組圖譜與正常樣本的蛋白質(zhì)組圖譜或者參比蛋白質(zhì)組圖譜比較，該參比蛋白質(zhì)圖譜包含至少一種表征所述癥狀的獨(dú)特表達(dá)特征和確定所述母體或胎兒癥狀的狀態(tài)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物受試者是懷孕的雌性。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述懷孕雌性是人。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述母體癥狀選自羊膜內(nèi)感染、先兆子癇或早產(chǎn)。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述母體癥狀選自染色體非整倍性、先天畸形、妊娠年齡或胎兒成熟。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物液體選自羊水、血清、血漿、尿液、腦脊髓、乳汁、粘液或唾液。
7.權(quán)利要求3的方法，其中所述生物液體是羊水或母體血清。
8.權(quán)利要求1的方法，其中測(cè)試樣本的蛋白質(zhì)組圖譜包含至少兩種蛋白質(zhì)的信息。
9.權(quán)利要求1的方法，其中蛋白質(zhì)組圖譜是質(zhì)譜。
10.權(quán)利要求9的方法，其中蛋白質(zhì)組圖譜在質(zhì)譜的3-5kDa范圍內(nèi)包含至少一種獨(dú)特的表達(dá)特征。
11.權(quán)利要求9的方法，其中蛋白質(zhì)組圖譜在質(zhì)譜的10-12kDa范圍內(nèi)包含至少一種獨(dú)特的表達(dá)特征。
12.權(quán)利要求9的方法，其中母體癥狀是羊膜內(nèi)感染，獨(dú)特的表達(dá)特征是測(cè)試樣本中的10-12kDa分子量范圍內(nèi)的額外峰值，其指示羊膜內(nèi)感染。
13.權(quán)利要求12的方法，其中生物液體是羊水或母體血清。
14.權(quán)利要求1的方法，其中蛋白質(zhì)組圖譜通過(guò)Western印跡分析生成。
15.權(quán)利要求1的方法，其中生物液體是人的液體，而蛋白質(zhì)組圖譜包括一種或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)信息，該蛋白質(zhì)選自巨噬細(xì)胞加帽蛋白，嗜中性白細(xì)胞明膠酶相關(guān)lipocalin，髓過(guò)氧化物酶；L-網(wǎng)素；azurocidin；抗菌蛋白FALL-39；Gp340變體蛋白；Ebner唾液腺蛋白同系物(GenBank登錄號(hào)355392)；白血球彈性蛋白酶抑制劑；鈣粒蛋白A；鈣粒蛋白B；絲切蛋白；膜突蛋白；抑制蛋白I，cronin樣蛋白p57；連接蛋白II，纖連蛋白；神經(jīng)膠質(zhì)來(lái)源的連接蛋白；抗凝血酶-III；鱗片狀上皮細(xì)胞癌抗原1，鱗片狀上皮細(xì)胞癌抗原2；絲氨酸蛋白酶抑制劑12；半胱氨酸蛋白酶抑制劑A；半胱氨酸蛋白酶抑制劑B；半胱氨酸蛋白酶抑制劑C；IGFBP-1；維生素D-結(jié)合蛋白；載脂蛋白A-I；14-3-3蛋白σ；14-3-3蛋白ζ/δ；凝溶膠蛋白；乳運(yùn)鐵蛋白；磷酸甘油酸激酶1；磷酸甘油酸變位酶1；或轉(zhuǎn)酮酶；或其片段、前體或天然存在的變體。
16.權(quán)利要求15的方法，其中蛋白質(zhì)組圖譜包括兩種或多種所述蛋白的表達(dá)信息。
17.權(quán)利要求15的方法，其中蛋白質(zhì)組圖譜包括所有所述蛋白的表達(dá)信息。
18.權(quán)利要求15的方法，其中生物液體是羊水。
19.權(quán)利要求15的方法，其中蛋白質(zhì)組圖譜是正常樣本的蛋白質(zhì)組圖譜。
20.權(quán)利要求15的方法，其中蛋白質(zhì)組圖譜是測(cè)試樣本或參比樣本的蛋白質(zhì)組圖譜。
21.權(quán)利要求15的方法，其中相對(duì)于所述正常樣本，一種或多種所述蛋白在所述測(cè)試樣本中被差別性地表達(dá)。
22.權(quán)利要求21的方法，其中蛋白質(zhì)組圖譜包括一種或多種蛋白的表達(dá)信息，該蛋白選自巨噬細(xì)胞加帽蛋白；嗜中性白細(xì)胞明膠酶相關(guān)lipocalin；髓過(guò)氧化物酶；L-網(wǎng)素；azurocidin；抗菌蛋白FALL-39；白血球彈性蛋白酶抑制劑；鈣粒蛋白A；鈣粒蛋白B；抑制蛋白I，神經(jīng)膠質(zhì)來(lái)源的連接蛋白；絲氨酸蛋白酶抑制劑12；半胱氨酸蛋白酶抑制劑A；或IGFBP-1；或其片段、前體或天然存在的變體。
23.權(quán)利要求22的方法，其中蛋白質(zhì)組圖譜包括兩種或多種所述蛋白的表達(dá)信息。
24.權(quán)利要求22的方法，其中蛋白質(zhì)組圖譜包括所有所述蛋白的表達(dá)信息。
25.權(quán)利要求22的方法，其中所述受試者被診斷為羊膜內(nèi)感染。
26.權(quán)利要求22的方法，其中所述受試者被診斷為發(fā)育缺陷。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述發(fā)育缺陷是器官系統(tǒng)發(fā)育中的缺陷。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述器官系統(tǒng)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)或者心血管系統(tǒng)。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述發(fā)育缺陷是肌肉與骨骼的畸形。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述發(fā)育缺陷是由于染色體非整倍性造成。
31.權(quán)利要求22的方法，其中測(cè)試樣本的蛋白質(zhì)圖譜基本上與正常樣本的蛋白質(zhì)組圖譜相同，該受試者被確定為無(wú)所述母體或胎兒癥狀。
32.權(quán)利要求22的方法，其中蛋白質(zhì)組圖譜包括一種或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)信息，該蛋白質(zhì)選自由列舉在表3和4中的蛋白質(zhì)組成的組。
33.權(quán)利要求22的方法，其中蛋白質(zhì)組圖譜含有與參比樣本相同的獨(dú)特表達(dá)特征。
34.權(quán)利要求32的方法，其中獨(dú)特的表達(dá)特征表征羊膜內(nèi)感染。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述受試者被診斷為患有羊膜內(nèi)感染。
36.用于診斷羊膜內(nèi)感染的方法，包含(a)將從懷孕的雌性哺乳動(dòng)物獲得的生物液體的測(cè)試樣本的蛋白質(zhì)組圖譜與正常樣本的蛋白質(zhì)組圖譜，或者參比蛋白質(zhì)圖譜比較，其中所述蛋白質(zhì)組圖譜提供存在于所述樣本中的蛋白質(zhì)或其蛋白質(zhì)水解片段的質(zhì)量的信息；和(b)如果測(cè)試樣本的蛋白質(zhì)組圖譜在3-5和/或10-12Kda分子量范圍內(nèi)具有獨(dú)特的表達(dá)特征，診斷所述哺乳動(dòng)物患有羊膜內(nèi)感染。
37.權(quán)利要求36的方法，其中蛋白質(zhì)組圖譜表示為質(zhì)譜的形式。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是靈長(zhǎng)類(lèi)。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述靈長(zhǎng)類(lèi)是人。
40.權(quán)利要求39的方法，還包括監(jiān)控所述羊膜內(nèi)感染的進(jìn)程的步驟。
41.權(quán)利要求39的方法，其中生物液體是羊水或母體血清。
42.用于診斷羊膜內(nèi)感染的方法，包含(a)將從懷孕的雌性哺乳動(dòng)物獲得的生物液體的測(cè)試樣本的蛋白質(zhì)組圖譜與正常樣本的蛋白質(zhì)組圖譜比較；和(b)如果相對(duì)于正常樣本，至少一種蛋白質(zhì)在所述測(cè)試樣本中被差別性地表達(dá)，則診斷所述哺乳動(dòng)物患有羊膜內(nèi)感染，該蛋白質(zhì)選自IGFB-1，鈣粒蛋白，azurocidin，抑制蛋白，血漿銅藍(lán)蛋白，或L-網(wǎng)素，或其片段、前體或天然存在的變體。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是靈長(zhǎng)類(lèi)。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述靈長(zhǎng)類(lèi)是人。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述生物液體是羊水或母體血清。
46.權(quán)利要求42的方法，其中相對(duì)于所述正常樣本，至少I(mǎi)GFBP-1，鈣粒蛋白，azurocidin，抑制蛋白，和血漿銅藍(lán)蛋白，或其片段、前體或天然存在的變體之一在所述測(cè)試樣本中被過(guò)度表達(dá)。
47.權(quán)利要求42的方法，其中相對(duì)于所述正常樣本，L-網(wǎng)素在所述測(cè)試樣本中低表達(dá)。
48.權(quán)利要求46的方法，其中通過(guò)鑒定如附圖12所示的蛋白質(zhì)水解片段或其片段，檢測(cè)IGFBP-1的存在。
49.權(quán)利要求48的方法，還包括監(jiān)控所述羊膜內(nèi)感染的狀態(tài)的步驟。
50.用于診斷染色體非整倍性的方法，包含(a)將從懷孕的雌性哺乳動(dòng)物獲得的生物液體的測(cè)試樣本的蛋白質(zhì)組圖譜與正常樣本的蛋白質(zhì)組圖譜，或者參比蛋白質(zhì)圖譜比較，其中所述蛋白質(zhì)組圖譜提供存在于所述樣本中的蛋白質(zhì)或其蛋白質(zhì)水解片段的質(zhì)量的信息；和(b)如果測(cè)試樣本的蛋白質(zhì)組圖譜在4-5Kda分子量范圍內(nèi)具有獨(dú)特的表達(dá)特征，診斷所述哺乳動(dòng)物患有染色體非整倍性。
51.權(quán)利要求50的方法，其中染色體非整倍性是Down綜合癥。
52.用于診斷胎兒發(fā)育缺陷的方法，包含a)將從懷孕的雌性哺乳動(dòng)物獲得的生物液體的測(cè)試樣本的蛋白質(zhì)組圖譜與正常樣本的蛋白質(zhì)組圖譜或者參比蛋白質(zhì)組圖譜比較；和b)如果相對(duì)于正常樣本，至少一種肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)蛋白或其片段、前體或天然存在的變體在所述測(cè)試樣本中被差別性地表達(dá)，則確定存在所述發(fā)育缺陷。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)蛋白選自膜突蛋白，p57，凝溶膠蛋白和14-3-3蛋白。
54.用于診斷母體或胎兒感染或免疫反應(yīng)相關(guān)異常的方法，包含(a)將從懷孕的雌性哺乳動(dòng)物獲得的生物液體的測(cè)試樣本的蛋白質(zhì)組圖譜與正常樣本的蛋白質(zhì)組圖譜或者參比蛋白質(zhì)組圖譜比較；和(b)如果相對(duì)于正常樣本，至少一種蛋白質(zhì)在所述測(cè)試樣本中被差別性地表達(dá)，則確定存在所述母體或胎兒感染或免疫反應(yīng)相關(guān)異常，該蛋白質(zhì)選自巨噬細(xì)胞加帽蛋白(MCP)，白血球彈性蛋白酶，嗜中性白細(xì)胞明膠酶相關(guān)lipcalcin(NGAL)，髓過(guò)氧化物酶，L-網(wǎng)素，鈣粒蛋白，F(xiàn)ALL-39，azyrocidin(CAP37)，蛋白酶或蛋白酶抑制劑。
55.用于診斷新生兒膿毒病的方法，包含在從懷孕的雌性哺乳動(dòng)物的生物液體的蛋白質(zhì)組圖譜中檢測(cè)Gp-340的存在。
56.生物液體的蛋白質(zhì)組圖譜，包含一種或多種蛋白質(zhì)的信息，該蛋白質(zhì)選自巨噬細(xì)胞加帽蛋白，嗜中性白細(xì)胞明膠酶相關(guān)lipocalin，髓過(guò)氧化物酶；L-網(wǎng)素；azurocidin；抗菌蛋白FALL-39；Gp340變體蛋白；Ebner唾液腺蛋白同系物(GenBank登錄號(hào)355392)；白血球彈性蛋白酶抑制劑；鈣粒蛋白A；鈣粒蛋白B；cofilin；膜突蛋白；抑制蛋白I，cronin樣蛋白p57；連接蛋白II，纖連蛋白；神經(jīng)膠質(zhì)來(lái)源的連接蛋白；抗凝血酶-III；鱗片狀上皮細(xì)胞癌抗原1，鱗片狀上皮細(xì)胞癌抗原2；絲氨酸蛋白酶抑制劑12；半胱氨酸蛋白酶抑制劑A；半胱氨酸蛋白酶抑制劑B；半胱氨酸蛋白酶抑制劑C；IGFBP-1；維生素D-結(jié)合蛋白；載脂蛋白A-I；14-3-3蛋白σ；14-3-3蛋白ζ/δ；凝溶膠蛋白；乳運(yùn)鐵蛋白；磷酸甘油酸激酶1；磷酸甘油酸變位酶1；和轉(zhuǎn)酮酶；或其片段、前體或天然存在的變體。
57.生物液體的蛋白質(zhì)組圖譜，包含一種或多種蛋白質(zhì)的信息，該蛋白質(zhì)選自巨噬細(xì)胞加帽蛋白；嗜中性白細(xì)胞明膠酶相關(guān)lipocalin；髓過(guò)氧化物酶；L-網(wǎng)素；azurocidin；抗菌蛋白FALL-39；白血球彈性蛋白酶抑制劑；鈣粒蛋白A；鈣粒蛋白B；抑制蛋白I，神經(jīng)膠質(zhì)來(lái)源的連接蛋白；絲氨酸蛋白酶抑制劑12；半胱氨酸蛋白酶抑制劑A；或IGFBP-1；或其片段、前體或天然存在的變體。
58.生物液體的蛋白質(zhì)組圖譜，包含一種或多種蛋白質(zhì)的信息，該蛋白質(zhì)選自列舉在表3和4中的蛋白質(zhì)。
59.權(quán)利要求56-58的任何一項(xiàng)的蛋白質(zhì)組圖譜，確認(rèn)一種或多種所述蛋白質(zhì)或其片段、前體或天然存在的變體的存在。
60.表征羊膜內(nèi)感染的生物液體的蛋白質(zhì)組圖譜，包含確定存在一種蛋白質(zhì)的信息，該蛋白質(zhì)選自IGFB-1，抑制蛋白，血漿銅藍(lán)蛋白，L-網(wǎng)素或鈣粒蛋白。
61.表征羊膜內(nèi)感染的生物液體的蛋白質(zhì)組圖譜，表示為提供在所述生物液體中存在的蛋白質(zhì)或其蛋白質(zhì)水解片段的分子量的信息的形式，包含3-5KDa和/或10-12Kda分子量范圍內(nèi)的獨(dú)特表達(dá)特征。
62.權(quán)利要求60的蛋白質(zhì)組圖譜，表示為質(zhì)譜。
63.權(quán)利要求61的蛋白質(zhì)組圖譜，其中生物液體是羊水或母體血清。
64.基本上如附圖1A-1C的任意一個(gè)中所示的蛋白質(zhì)組圖譜。
65.基本上如附圖2A-C的任意一個(gè)中所示的蛋白質(zhì)組圖譜。
66.基本上如附圖3A-C的任意一個(gè)中所示的蛋白質(zhì)組圖譜。
67.基本上如附圖4A或4B的任意一個(gè)中所示的蛋白質(zhì)組圖譜。
68.基本上如附圖6-10的任意一個(gè)中所示的蛋白質(zhì)組圖譜。
69.權(quán)利要求63-67任一個(gè)的蛋白質(zhì)組圖譜，以微陣列的形式分析。
70.蛋白質(zhì)陣列，包含一種或多種固定在固體支持物上的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)選自列舉在表2-4中的蛋白質(zhì)。
71.抗體陣列，包含固定在固體支持物上的能特異地結(jié)合到一種或多種列舉在表2-4中的蛋白質(zhì)的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物液體的蛋白質(zhì)組的鑒定，及其在確定母體/胎兒癥狀的狀態(tài)中的用途，該癥狀包括胎兒來(lái)源的母體癥狀，染色體非整倍性，以及與胎兒生長(zhǎng)和成熟相關(guān)的胎兒疾病。特別地，本發(fā)明涉及鑒定羊水的蛋白質(zhì)組(代表羊水組成的多種蛋白質(zhì))和正常的蛋白質(zhì)組的特征性變化與各種病理性母體/胎兒癥狀的相關(guān)性，這些癥狀例如羊膜內(nèi)感染，或染色體缺陷。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1795387SQ200480014441
公開(kāi)日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2004年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月25日
發(fā)明者羅恩·羅森菲爾德, 斯里·納加拉, 邁克·格雷維特 申請(qǐng)人:普羅特奧格尼克斯公司