專利名稱：用于體外評估個(gè)體hiv病毒感染的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及個(gè)體感染屬于人類免疫缺陷病毒(HIV)家族病毒的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)的體外診斷以及這種傳染病的治療性治療領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
AIDS疾病主要由個(gè)體感染HIV逆轉(zhuǎn)錄病毒而引起，因?yàn)槠駷橹垢腥綡IV病毒的個(gè)體估計(jì)約達(dá)4千萬人，所以AIDS疾病是目前在全世界最具破壞性的疾病。
僅在2001年間，就有5百萬個(gè)體感染HIV，而同時(shí)有3百萬個(gè)體死亡。自從1983年發(fā)現(xiàn)主要的AIDS病因物質(zhì)，即HIV病毒以來，為了解這種病毒的作用機(jī)制并研制正確的方法用于(i)可重復(fù)地診斷傳染病及(ii)對特定患者疾病進(jìn)展的預(yù)測已做出了大量的努力。
為了監(jiān)視的目的，成人或13歲或以上年齡的青少年，在存在25個(gè)AIDS指征之一的疾病如KS、PCP或彌漫性MAC，美國疾病控制中心(CDC)現(xiàn)在將其定義為AIDS。13歲以下兒童，AIDS的定義與青少年和成人相似，但包括列入AIDS定義疾病目錄下的淋巴樣間質(zhì)性肺炎和復(fù)發(fā)性細(xì)菌感染(CDC，1987b)。1993年成人和青少年病例定義擴(kuò)大到包括每立方毫米血中CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)少于200個(gè)細(xì)胞的感染HIV病毒的個(gè)體(CDC，1992)?，F(xiàn)在的監(jiān)視定義取代了1987年公布的基于臨床疾病和HIV感染證據(jù)而非CD4+T細(xì)胞測定的標(biāo)準(zhǔn)(CDC，1987)。
在臨床實(shí)踐中，癥狀學(xué)和免疫功能測量特別是CD4+T淋巴細(xì)胞水平測量常用于指導(dǎo)HIV感染患者的治療。
雖然為了在實(shí)驗(yàn)室繁殖HIV，科學(xué)家們已經(jīng)建立了永生T細(xì)胞系(Popovic等人，1984；Zagury等人，1986；Garry，1989；Clark等人，1991)，但仍有HIV于體外感染并殺傷CD4+T淋巴細(xì)胞。在體外慢病毒系統(tǒng)中已經(jīng)觀察到幾種CD4+T細(xì)胞殺傷機(jī)制并可以解釋HIV感染個(gè)體中這些細(xì)胞進(jìn)行性的丟失(Garry綜述，1989；Fauci，1993a；Pantaleo等人，1993a)。這些機(jī)制包括當(dāng)HIV在細(xì)胞表面發(fā)芽或細(xì)胞內(nèi)不均一分散的RNAs和非整合DNA的積累使細(xì)胞膜破裂(Pauza等人，1990；Koga等人，1988)。證據(jù)也顯示細(xì)胞內(nèi)絡(luò)合的CD4和病毒包膜產(chǎn)物能導(dǎo)致細(xì)胞殺傷(Hoxie等人，1986)。
除了這些CD4+T細(xì)胞缺失的直接機(jī)制外，間接的機(jī)制也可導(dǎo)致未感染的CD4+T細(xì)胞死亡(Fauci綜述，1993a；Pantaleo等人，1993a)。未感染的細(xì)胞經(jīng)常與感染的細(xì)胞融合，導(dǎo)致稱為合胞體的巨大細(xì)胞，合胞體與體外HIV的致細(xì)胞病變效應(yīng)有關(guān)(Sodroski等人，1986；Lifson等人，1986)。當(dāng)游離的HIV包膜蛋白質(zhì)gp120結(jié)合到未感染細(xì)胞表面而使之易于受到抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)時(shí)，未感染的細(xì)胞也可以受到殺傷(Lyerly等人，1987)。因HIV包膜蛋白質(zhì)與某些主要組織相容性復(fù)合體II類(MHC-II)分子有一定程度的同源性，其它自身免疫現(xiàn)象也導(dǎo)致了CD4+T細(xì)胞死亡(Golding等人，1989；Koenig等人，1988)。
許多研究者提出HIV編碼或源于無關(guān)因素的超抗原可以啟動大量刺激CD4+T細(xì)胞并使之?dāng)U充，最終導(dǎo)致這些細(xì)胞缺失或無反應(yīng)性(Janeway，1991；Hugin等人，1991)。已經(jīng)提出不適時(shí)地誘導(dǎo)產(chǎn)生程序性細(xì)胞死亡即凋亡是HIV感染中CD4+T細(xì)胞丟失的又一種機(jī)制(Ameisen和Capron，1991；Terai等人，1991；Laurent-Crawford等人，1991)。最近的報(bào)導(dǎo)指出HIV感染個(gè)體外周血和淋巴結(jié)的細(xì)胞凋亡都比非HIV感染個(gè)體廣泛得多(Finkel等人，1995；Pantaleo和Fauci，1995b；Muro-Cacho等人，1995)。
還觀察到HIV感染骨髓和胸腺的CD4+T細(xì)胞前體并破壞這些器官中祖先細(xì)胞最佳營養(yǎng)和成熟所必需的微環(huán)境(Schnittman等人，1990b；Stanley等人，1992)。這些發(fā)現(xiàn)可有助于解釋AIDS患者CD4+T細(xì)胞群的缺乏(Fauci，1993a)。
近來的研究證明甚至在HIV感染初期外周血和胸腺組織中就有相當(dāng)多的病毒負(fù)荷和活躍的病毒復(fù)制(Fox等人，1989；Coombs等人，1989；Ho等人，1989；Michael等人，1992；Bagnarelli等人，1992；Pantaleo等人，1993b；Embretson等人，1993；Piatak等人，1993)。一個(gè)小組已報(bào)道在疾病進(jìn)程的早期HIV感染個(gè)體的淋巴結(jié)中25％CD4+T細(xì)胞內(nèi)潛伏有HIVDNA(Embretson等人，1993)。其它數(shù)據(jù)也提議HIV感染是每天新病毒感染、破壞及替換10億以上CD4+T細(xì)胞的連續(xù)巡回持續(xù)的動態(tài)過程(Wei等人，1995；Ho等人，1995)。
關(guān)于HIV感染患者病情進(jìn)展的預(yù)測，當(dāng)前第一種方法由評估患者全血樣本中HIV病毒數(shù)量的增加組成，例如用特異性地直接針對HIV蛋白的抗體、特別是針對HIV衣殼糖蛋白gp120的抗體進(jìn)行常規(guī)免疫測定。
當(dāng)前第二種AIDS患者進(jìn)展預(yù)測的方法由測量患者全血樣本的HIV基因組拷貝數(shù)組成，例如通過采用與HIV基因組RNA特異性雜交的一種或幾種核酸引物進(jìn)行該樣本核酸的定量PCR擴(kuò)增。
上述這二種方法是有用的，因?yàn)楸姸嘌芯恳扬@示血流中擁有高水平HIV的人比擁有低病毒水平的個(gè)體更可能發(fā)展為AIDS相關(guān)癥狀或死亡。
當(dāng)前的第三種針對AIDS患者進(jìn)展的預(yù)測方法由測量感染患者(HIV+患者)全血中絕對CD4+T細(xì)胞水平組成，例如采用直接針對CD4抗原的抗體標(biāo)記進(jìn)行該患者血液樣本的流式細(xì)胞術(shù)分析。
上述所有預(yù)測方法可以重復(fù)使用但也有各自的技術(shù)局限性，例如在有關(guān)疾病進(jìn)展與它們的生物學(xué)意義方面的技術(shù)局限性。
由于所用抗體的特異性，評估患者生物學(xué)樣本的HIV病毒粒子數(shù)量而使用抗體包括一些缺點(diǎn)，因?yàn)楸娝苤a(chǎn)生于不同HIV病毒分離株的HIV結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的抗原特異性明顯不同并可由此產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
測量患者生物樣本的HIV基因組拷貝數(shù)的確預(yù)示著已整合到感染個(gè)體細(xì)胞基因組內(nèi)的前病毒已經(jīng)進(jìn)入了活躍的復(fù)制周期并且疾病在活躍地進(jìn)展。然而，該技術(shù)不能同時(shí)反映患者針對病毒進(jìn)展的免疫應(yīng)答。
因?yàn)楂@得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的發(fā)病機(jī)理大多歸因于具有CD4受體(CD4+)的T淋巴細(xì)胞減少，所以測量患者CD4+T細(xì)胞水平也預(yù)示疾病進(jìn)展。進(jìn)行性的CD4+T細(xì)胞缺失與臨床并發(fā)癥的增加有關(guān)。因?yàn)檫@種關(guān)聯(lián)，所以將測量CD4+T細(xì)胞水平用于建立監(jiān)測治療AIDS相關(guān)的決定點(diǎn)。CD4+T淋巴細(xì)胞水平也用做人類免疫缺陷病毒(HIV)疾病患者預(yù)測的標(biāo)識。
然而，測量患者CD4+T細(xì)胞水平除了能得知免疫缺陷外，并不能直接反映患者的免疫狀態(tài)。特別是測量CD4+T細(xì)胞水平不能說明導(dǎo)致或介導(dǎo)觀測到的CD4+缺失的可能生物效應(yīng)細(xì)胞狀態(tài)，并且不能說明導(dǎo)致所觀測到的患者免疫缺陷的可能生物效應(yīng)細(xì)胞狀態(tài)。
的確，也可提到通過對患者細(xì)胞尤其是CD4+細(xì)胞表達(dá)的已知HIV共受體如CCR5共受體的氨基酸序列突變檢測，對特定HIV感染患者的AIDS進(jìn)展進(jìn)行預(yù)測，因?yàn)橐呀?jīng)觀察到，在編碼CCDR5共受體的兩個(gè)拷貝之一上攜帶有特異性突變的HIV感染人群比擁有該基因兩個(gè)正?？截惖娜巳壕哂休^慢的疾病過程。
然而，一旦考慮到AIDS疾病進(jìn)展?fàn)顟B(tài)，本領(lǐng)域仍需要另外的方法而允許本領(lǐng)域技術(shù)人員測定已感染HIV病毒患者的AIDS進(jìn)展?fàn)顟B(tài)，以便能夠更精確地預(yù)測疾病進(jìn)展，包括許多熟知的AIDS相關(guān)疾病的發(fā)生或進(jìn)展，并且也能夠更精確地監(jiān)視對于HIV感染患者更有益的治療性治療。例如，本領(lǐng)域需要能夠預(yù)示AIDS進(jìn)展優(yōu)選地與HIV感染的生物學(xué)有生物學(xué)關(guān)聯(lián)的新的生物學(xué)標(biāo)記，例如，與所檢測患者的免疫狀態(tài)相關(guān)聯(lián)的新的生物學(xué)標(biāo)記。
的確，這些新的生物學(xué)標(biāo)記可與上述一種或幾種已知的標(biāo)記聯(lián)合使用。
此外，為了預(yù)防HIV病毒感染個(gè)體發(fā)生AIDS，或更通常地來說，為了治療HIV病毒感染的患者，本領(lǐng)域仍需要新的在治療上有用的化合物。特別是確定新的抗HIV多聯(lián)治療或HAART(“高度有用的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療”)，需要包括特異性針對除了HIV蛋白酶和HIV逆轉(zhuǎn)錄酶以外的其它靶分子并將作用于疾病不同階段相關(guān)靶的新的藥學(xué)活性化合物。特別是，本領(lǐng)域需要在HIV已開始活躍復(fù)制的HIV感染患者中尤其是CD4+T細(xì)胞數(shù)量接近減少并且因此易感于免疫缺陷HIV感染患者中以及在其CD4+T細(xì)胞已開始缺失的HIV感染患者中具有生物學(xué)活性的新的目標(biāo)藥物化合物。
發(fā)明概述首先，本發(fā)明涉及體外評估個(gè)體HIV病毒感染的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)的方法，其中所述方法包括步驟(a)用特異性結(jié)合SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的配體化合物與所述生物樣本進(jìn)行孵育；和(b)測量結(jié)合于CD4+T細(xì)胞的所述配體化合物的數(shù)量，由此所測量的該結(jié)合配體化合物的數(shù)量預(yù)示著病毒感染的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)。
本發(fā)明也涉及專為實(shí)施上述方法而設(shè)計(jì)的試劑盒。
本發(fā)明也涉及HIV感染患者治療性活性化合物的體外篩選方法。
特別地，本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療與個(gè)體HIV病毒感染相關(guān)的疾病的化合物的體外篩選方法，其中所述方法包括步驟(a)在待檢測的候選治療性化合物存在下將由人活化NK細(xì)胞組成的第一種細(xì)胞群和由表達(dá)NKp44L蛋白的人CD4+T細(xì)胞組成的第二種細(xì)胞群相接觸；(b)測量通過活化的NK細(xì)胞引起的CD4+T細(xì)胞溶解；(c)比較步驟(b)的細(xì)胞溶解值和在步驟(a)缺乏候選化合物時(shí)的細(xì)胞溶解值；(d)選擇抑制或阻斷NK介導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞溶解的候選化合物。
本發(fā)明還涉及預(yù)防或治療與個(gè)體HIV病毒感染相關(guān)的疾病的藥物組合物，所述組合物包含有效量的配體化合物與至少一種生理可接受賦形劑的組合，其中所述配體化合物選自(i)特異性結(jié)合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的配體化合物和(ii)特異性結(jié)合于SEQID NO2的NKp44蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的配體化合物。
本發(fā)明也涉及到預(yù)防或治療與個(gè)體HIV病毒感染相關(guān)的疾病的藥物組合物，所述組合物包含與編碼SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的mRNA分子特異性雜交的有效量反義多核苷酸與至少一種生理可接受賦形劑的組合。
本發(fā)明也涉及利用治療性活性化合物和在本說明書中進(jìn)一步描述的藥物組合物治療HIV感染患者的方法。
另一方面，本發(fā)明涉及包含以下氨基酸序列的多肽X1X2X3X4X5X6SWSNKSX7X8X9X10X11(I)，其中X1、X2、X3、X5、X6、X7、X9、X10和X11是指相互獨(dú)立的任一氨基酸殘基，X4是指除了A和W以外的任一氨基酸殘基，并且其中X8是指除了E和S以外的任一氨基酸殘基。
本發(fā)明也涉及用于篩選預(yù)防或治療與個(gè)體HIV病毒感染相關(guān)的疾病的化合物的體外方法，其中所述方法包括步驟(i)將待測試候選化合物與上述多肽進(jìn)行孵育；(ii)分析待測試候選化合物與上述多肽的結(jié)合。
本發(fā)明也涉及預(yù)防或治療與個(gè)體HIV病毒感染相關(guān)的疾病的藥物組合物，所述組合物包含有效量的特異性結(jié)合于式(I)多肽的配體化合物與至少一種生理可接受賦形劑的組合。
附圖簡述

圖1.HIV感類個(gè)體CD4+T細(xì)胞中NKp44L的表達(dá)與疾病階段相關(guān)1A)HIV-1感染患者CD4+T細(xì)胞上NKp44L的特異性表達(dá)。比較未感染(對照，空心符號)組和HIV感染(實(shí)心符號)組。水平線標(biāo)志是指平均值。橫坐標(biāo)檢測的血細(xì)胞表型?？v坐標(biāo)檢測的NKp44L標(biāo)記陽性的細(xì)胞百分比。
1B)在HIV感染患者中CD4+T細(xì)胞NKp44L表達(dá)與外周血CD4細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)。使用Sperman非參數(shù)等級相關(guān)性檢驗(yàn)顯示相關(guān)性(r)和其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P)。橫坐標(biāo)患者全血樣本中每立方毫米CD4+T細(xì)胞的數(shù)量?？v坐標(biāo)檢測的NKp44L標(biāo)記陽性的CD4+細(xì)胞的百分比。
1C)CD4+T細(xì)胞中NKp44L表達(dá)和病毒載量的相關(guān)性。Sperman非參數(shù)等級相關(guān)性檢驗(yàn)顯示相關(guān)性(r)和其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P)。橫坐標(biāo)病毒載量值，以每毫升患者全血樣本中HIV基因組拷貝數(shù)表示?？v坐標(biāo)檢測的NKp44L標(biāo)記陽性的CD4+細(xì)胞百分比。
1D)PHA活化后HIV感染個(gè)體CD4+T細(xì)胞中NKp44L過量表達(dá)。5個(gè)未感染(對照，空心符號)和5個(gè)HIV感染(實(shí)心符號)患者比較。NA非活化細(xì)胞；PHAPHA活化細(xì)胞。橫坐標(biāo)分別在對照和HIV感染個(gè)體中非活化細(xì)胞和PHA活化的細(xì)胞?？v坐標(biāo)檢測的NKp44L標(biāo)記陽性的CD4+細(xì)胞百分比。
圖2.HIV感染患者CD3-CD56+NK細(xì)胞的NKp44表達(dá)在每立方毫米少于500個(gè)CD4+細(xì)胞的HIV感染個(gè)體中表達(dá)NKp44的NK細(xì)胞比例顯著地高于未感染細(xì)胞(對照)。
圖3.HIV感染患者表達(dá)NKP44L的CD4+T細(xì)胞具有較高的NK溶解敏感性3A)使用NK92 NK細(xì)胞系分析針對表達(dá)(圓形)或不表達(dá)(方形)NKp44L的兩種純化的CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。用抗NKp44L單克隆抗體(a44)處理后細(xì)胞毒活性受到部分阻斷。
3B)針對表達(dá)(圓形)或不表達(dá)(方形)NKp44L的純化CD4+T細(xì)胞的兩種IL-2激活的自體(auto)NK原代細(xì)胞和作為細(xì)胞毒活性陽性對照的K562(星形)的細(xì)胞毒活性。
3C)針對表達(dá)(圓形)或不表達(dá)(方形)NKp44L的兩種純化的CD4+T細(xì)胞的未激活自體(auto)NK原代細(xì)胞和作為細(xì)胞毒活性陽性對照的K562(星形)的細(xì)胞毒活性。
在圖3A、3B和3C中，左邊組和右邊組代表兩次獨(dú)立的分析并且顯示結(jié)果的可重復(fù)性。
圖4.用表達(dá)多種HIV蛋白的痘苗病毒處理純化的CD4+T細(xì)胞后NKp44L的過量表達(dá)用表達(dá)HIV蛋白的幾種重組痘苗病毒以20pfu/細(xì)胞感染純化的CD4+T細(xì)胞。兩天后，將細(xì)胞洗滌兩次并用抗NKp44L的單克隆抗體(灰色粗線)或用IgM同種型對照(黑細(xì)線)染色。通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞。UI未感染的細(xì)胞。WT用野生型痘苗病毒感染的細(xì)胞。Gag、Pol、gp160、gp120、gp41、Tat、Nef用分別表達(dá)Gag、Pol、gp160、gp120、gp41、Tat或Nef的痘苗病毒感染的細(xì)胞。每一小圖中對NKp44L表達(dá)的百分比加以注釋。橫坐標(biāo)NKp44L表達(dá)，縱坐標(biāo)細(xì)胞數(shù)。
圖5.用重組gp160 HIV蛋白處理純化的CD4+T細(xì)胞后NKp44L的過量表達(dá)在10μ/ml IL2存在條件下，在2天時(shí)間內(nèi)用5μg/ml對照蛋白質(zhì)(Ctl黑圓形)或重組gp160蛋白質(zhì)(gp160-A黑三角；gp160-B黑方形)或不用蛋白質(zhì)(UT未經(jīng)處理的細(xì)胞)孵育一百萬個(gè)細(xì)胞。
5A)洗滌細(xì)胞并以抗NKp44L的單克隆抗體和CD4單克隆抗體或同種型對照染色并通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。每一小圖中對CD4+T細(xì)胞內(nèi)NKp44L表達(dá)的百分比加以注釋。橫坐標(biāo)CD4表達(dá)，縱坐標(biāo)NKp44L表達(dá)。
5B)分析用重組gp160HIV蛋白孵育的CD4+T細(xì)胞的NK溶解敏感性以了解已激活的自體純化NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。在不同效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞(E/T)比率(橫坐標(biāo))下進(jìn)行NK溶解活性分析?？招牧庑渭犹摼€未處理的細(xì)胞；下方的實(shí)心蛋白質(zhì)處理的對照細(xì)胞；實(shí)心三角形gp160-A處理的細(xì)胞；實(shí)心方形gp160-B處理的細(xì)胞?？v坐標(biāo)特異性的NK溶解(％)。
圖6.誘導(dǎo)NK溶解高敏感性和NKP44L過量表達(dá)的來自HIVgp41蛋白質(zhì)的肽庫用5μg/ml源于HIVgp41蛋白質(zhì)(記為從A到J)或作為對照的來源于qp120蛋白質(zhì)(qp120)肽庫處理一百萬個(gè)純化的CD4+T細(xì)胞。如材料和方法部分所描述，每個(gè)肽庫包含10種肽。在10U/ml IL2存在條件下將細(xì)胞孵育兩天，然后洗滌兩次。
6A)分析用不同肽庫孵育的CD4+T細(xì)胞的NK溶解敏感性以了解激活的自體純化NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。在不同效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞(E/T)比率下進(jìn)行NK溶解活性分析。縱坐標(biāo)特異性NK溶解(％)。
6B)用抗NKp44L單克隆抗體和CD4單克隆抗體或同種型對照進(jìn)行細(xì)胞染色并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。在這組圖中，結(jié)果僅為未處理的細(xì)胞(無)或以源于gp120或p41肽庫(庫C和J)處理的細(xì)胞。對每組CD4+T細(xì)胞NKp44L表達(dá)的百分比進(jìn)行了注釋。觀察到對于其它庫NKp44L低表達(dá)，從0.2％到1.3％。橫坐標(biāo)NKp44L表達(dá)，縱坐標(biāo)CD4表達(dá)。
圖7.分析源自HIVgp41蛋白質(zhì)的C庫的每種肽用5μg/ml C庫的肽(見圖6)(記為C141-C150)或作為對照的肽gp41-E162或gp120-87處理一百萬純化的CD4+T細(xì)胞。在10U/ml IL2存在條件下將細(xì)胞孵育兩天，然后洗滌兩次。
7A)對用不同肽孵育的CD4+T細(xì)胞的殺傷模式進(jìn)行檢測以了解對NK的敏感性。數(shù)據(jù)顯示使用激活的自身純化NK效應(yīng)細(xì)胞的E/T比率為40/1。縱坐標(biāo)特異性NK溶解(％)。
7B)用抗-NKp44L單克隆抗體和CD4單克隆抗體或同種型對照進(jìn)行細(xì)胞染色并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。縱坐標(biāo)NKp44L表達(dá)。
圖8.gp41 HIV蛋白所表達(dá)的NH2-SWSNKS-COOH基序的強(qiáng)烈作用8A)肽gp41-C147(野生型WT)序列和兩種不同的恰在“SWSNKS”基序(對照1Ctl1)內(nèi)或在全部15mer序列(對照2Ctl2)內(nèi)具有某些修飾的對照肽序列。
用1μg/ml高度純化的WT肽或兩種對照肽(Ctl1和Ctl2)處理一百萬純化的CD4+T細(xì)胞。在10μ/ml IL2存在條件下將細(xì)胞孵育兩天，然后洗滌兩次。
8B)分析用不同肽孵育的CD4+T細(xì)胞的NK溶解敏感以了解激活的自身純化NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。在不同效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞(E/T)比率(橫坐標(biāo))下進(jìn)行NK溶解活性分析?？招牧庑渭犹摼€未處理的細(xì)胞；下方的實(shí)心WT肽處理的細(xì)胞；實(shí)心方形Ctl1肽處理的細(xì)胞；實(shí)心三角形Ctl2肽處理的細(xì)胞。縱坐標(biāo)特異性NK溶解(％)。
8C)用抗NKp44L單克隆抗體和CD4單克隆抗體或同種型對照進(jìn)行細(xì)胞染色并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。對每組CD4+T細(xì)胞NKp44L表達(dá)的百分比加以注釋。橫坐標(biāo)NKp44L表達(dá)，縱坐標(biāo)CD4表達(dá)。
圖9.加入“活性SWSNKS”肽后NK溶解活性和NKp44L表達(dá)的動力學(xué)研究在0-2880分鐘內(nèi)，用1μg/ml高度純化的野生型(WT)肽或兩種對照肽(Ctl1和Ctl2)處理一百萬個(gè)純化的CD4+T細(xì)胞數(shù)次。孵育后，將細(xì)胞洗滌兩次然后分析激活的自身純化NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。在不同效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞(E/T)比率下進(jìn)行NK溶解活性分析(A)。用10μg/ml抗NK44L單克隆抗體預(yù)處理細(xì)胞后進(jìn)行NK細(xì)胞毒活性分析(B)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示NKp44L的細(xì)胞表面表達(dá)(A)和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(B)?？招牧庑渭犹摼€未處理的細(xì)胞；下方實(shí)心WT肽處理的細(xì)胞；實(shí)心方形Ctl1肽處理的細(xì)胞；實(shí)心三角形Ctl2肽處理的細(xì)胞；下方空心加虛線用抗NKp44L單克隆抗體預(yù)處理后WT肽處理的細(xì)胞；空心方形加虛線用抗NKp44L單克隆抗體預(yù)處理后Ctl1肽處理的細(xì)胞。
圖10.不同人類細(xì)胞NKp44L的細(xì)胞表面表達(dá)K562、Jurkat和靜息PBMC的NKp44L細(xì)胞表面表達(dá)。用1μg/ml抗NKp44L單克隆抗體(灰色粗線)或IgM同種型對照(黑色細(xì)線)孵育細(xì)胞，并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。橫坐標(biāo)NKp44L表達(dá)，縱坐標(biāo)細(xì)胞數(shù)目。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HIV感染個(gè)體的CD4+T細(xì)胞表達(dá)稱為NKp44L的特異性蛋白質(zhì)，而非HIV感染個(gè)體的CD4+T細(xì)胞不表達(dá)該蛋白質(zhì)。在(i)不表達(dá)CD3抗原的HIV感染患者的外周血單核細(xì)胞(PBMC)中、(ii)表達(dá)CD3抗原但不表達(dá)CD4抗原的HIV感染患者的PBMC中，或者(iii)表達(dá)CD8抗原的HIV感染患者的PBMC中都不表達(dá)NKp44L蛋白。特別是，在來自HIV感染個(gè)體的經(jīng)活化CD4+T細(xì)胞如經(jīng)PHA活化的CD4+T細(xì)胞中NKp44L蛋白的表達(dá)水平進(jìn)一步增高。
此外，根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)顯示NKp44L蛋白表達(dá)水平的增加與HIV感染患者CD4+T細(xì)胞數(shù)減少和因此而發(fā)生的AIDS進(jìn)展有關(guān)。因而，NKp44L蛋白的表達(dá)水平預(yù)示著HIV感染患者的免疫狀態(tài)。
另外，根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NKp44L蛋白表達(dá)的增加與所檢測患者的HIV病毒載量的增加有關(guān)。因此，NKp44L蛋白表達(dá)水平也預(yù)示著感染患者的HIV病毒的復(fù)制活性狀態(tài)。
另一方面，根據(jù)本發(fā)明還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HIV感染患者的CD4+T細(xì)胞尤其是表達(dá)NKp44L蛋白的CD4+T細(xì)胞是由受自然殺傷(NK)細(xì)胞特別是激活的NK細(xì)胞和特別是源于同一患者的自身NK細(xì)胞作用而導(dǎo)致細(xì)胞溶解的特異性靶細(xì)胞組成。
重要的是，本發(fā)明人已經(jīng)顯示HIV感染個(gè)體的NK細(xì)胞是通過非MHC依賴的觸發(fā)機(jī)制由表達(dá)NKp44L蛋白的自身CD4+T細(xì)胞特異性激活的。
因而，根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)明確HIV感染患者CD4+T細(xì)胞NKp44L表達(dá)與AIDS疾病進(jìn)展，尤其是與多種AIDS相關(guān)疾病發(fā)生相關(guān)的免疫缺陷的進(jìn)展具有較高的生物相關(guān)性。
換言之，根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在HIV感染個(gè)體CD4+T細(xì)胞膜表面的NKp44L蛋白表達(dá)水平與感染疾病的進(jìn)展或發(fā)展?fàn)顟B(tài)，尤其是CD4+T細(xì)胞進(jìn)行性缺失引起的患者免疫缺陷的進(jìn)展之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的相關(guān)性。
從本發(fā)明人上面簡述的PBMC的NKp44L蛋白表達(dá)水平，更加特別地是PBMC細(xì)胞群中CD4+T細(xì)胞的NKp44L蛋白表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，顯示出它本身是由個(gè)體感染HIV病毒的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)的準(zhǔn)確的生物學(xué)標(biāo)記組成。此外，NKp44L蛋白表達(dá)水平由賦予很高生物學(xué)意義的HIV感染進(jìn)展?fàn)顟B(tài)的新的生物學(xué)標(biāo)記組成，因?yàn)榘l(fā)明者已經(jīng)顯示，通過激活的NK細(xì)胞進(jìn)行的非MHC依賴的CD4+T細(xì)胞識別，CD4+T細(xì)胞的NKp44L表達(dá)觸發(fā)自身NK細(xì)胞并激活這些用于特異性CD4+T細(xì)胞溶解的NK細(xì)胞。在這個(gè)特定的上下關(guān)系中，通過NKp44L蛋白特異性地與其特異性表達(dá)于NK細(xì)胞膜表面的受體對應(yīng)物，即已由Cantoni等人(1999)和Vitale等人(1998)描述的NKp44受體蛋白質(zhì)結(jié)合，HIV感染患者CD4+T細(xì)胞NKp44L蛋白的表達(dá)激活NK細(xì)胞。
此外，NKp44L蛋白質(zhì)以前已由另一發(fā)明實(shí)體分離而且已經(jīng)顯示多種腫瘤細(xì)胞系表達(dá)這種蛋白質(zhì)，此外，已經(jīng)表明某些腫瘤細(xì)胞表達(dá)的NKp44L是一種能特異性結(jié)合于上述NKp44受體蛋白質(zhì)的配體，其中受體蛋白質(zhì)由包括激活的NK細(xì)胞在內(nèi)的NK細(xì)胞表達(dá)。該發(fā)明實(shí)體以前表明由激活的NK細(xì)胞所表達(dá)的NKp44受體蛋白質(zhì)至少是由受激活的NK細(xì)胞導(dǎo)致部分腫瘤細(xì)胞溶解的部分原因(未發(fā)表的信息)。
總之，本發(fā)明人得到的結(jié)果已經(jīng)使得他們可利用NKp44L蛋白作為已診斷為HIV感染個(gè)體的疾病進(jìn)展的新的生物學(xué)相關(guān)標(biāo)記實(shí)施多種方法。
此外，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)源于HIV的gp41蛋白質(zhì)的特異性多肽顯著增強(qiáng)了CD4+T細(xì)胞膜上NKp44L蛋白的表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明也已確定HIV感染患者CD4+T細(xì)胞的NK細(xì)胞溶解依賴于特異性的HIV多肽。
HIV-1 gp41包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域，胞外域(外功能域)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(內(nèi)功能域)。gp41外功能域含有3個(gè)主要功能區(qū)，即定位于gp41的N端的融合肽，隨后有2個(gè)緊鄰gp41外功能域N和C末端部分的4-3七次重復(fù)，分別命名為NHR(N末端七次重復(fù))和CHR(C末端七次重復(fù))。N和C末端重復(fù)也稱為“HR1”和“HR2”。
在HIV和CD4+T細(xì)胞之間的膜融合期間，作為必需結(jié)構(gòu)而起作用的NHR和CHR區(qū)要求構(gòu)象的改變。
令人驚訝地是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種源于gp41蛋白質(zhì)的短肽，它定位于已知的HR1和HR2區(qū)之間，誘導(dǎo)NKp44L在CD4+T細(xì)胞的表面表達(dá)。
換言之，本發(fā)明人已鑒定了一種源于HIV gp41蛋白質(zhì)的短肽，它是造成NKp44L表面表達(dá)并因此造成由內(nèi)源性NK細(xì)胞引起的CD4+T細(xì)胞溶解的原因。
本發(fā)明人獲得的這些結(jié)果使得他們可利用源于gp41的不同于已知HR1和HR2區(qū)的特異性肽作為治療劑新的靶實(shí)施篩選方法。
重要地是，本發(fā)明人也顯示腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)蛋白質(zhì)NKp44L并且所述的源于gp41的短肽誘導(dǎo)或增強(qiáng)NKp44L的表達(dá)。
因此根據(jù)本發(fā)明，所述源于gp41的短肽可用于腫瘤細(xì)胞表面NKp44L的表達(dá)然后誘導(dǎo)NK細(xì)胞對它們的特異性溶解。
因此，本發(fā)明涉及治療方法和包含以上簡述的多肽的用于制造抗癌藥物組合物的藥物組合物。
在題為“本發(fā)明的其它方法和組合物”部分將詳細(xì)描述上述篩選方法和相關(guān)的組合物。
本發(fā)明的體外診斷方法本發(fā)明的第一個(gè)目的在于HIV病毒個(gè)體感染進(jìn)展?fàn)顟B(tài)的體外評估方法，其中所述方法包括步驟(a)用特異性結(jié)合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的配體化合物與所述生物樣本進(jìn)行孵育；和(b)測量結(jié)合于CD4+T細(xì)胞的所述配體化合物的數(shù)量，由此測量的所述結(jié)合配體化合物的數(shù)量預(yù)示著病毒感染的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)。
此處所用的“HIV”病毒由HIV-1或HIV2病毒并且特別是HIV-1或HIV-2病毒的任何病毒株或分離株組成。
如此處所使用的感染“進(jìn)展?fàn)顟B(tài)的評估”由預(yù)示著所檢測HIV感染患者免疫狀態(tài)的原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)組成，因?yàn)槿缟纤?A)CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞膜表面NKp44L蛋白的表達(dá)與(B)(i)所述患者CD4+T細(xì)胞的比率或(ii)針對該患者CD4+T細(xì)胞的NK細(xì)胞溶解活性水平之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。因此，根據(jù)本發(fā)明，CD4+T細(xì)胞表達(dá)NKp44L蛋白越多，該患者HIV疾病進(jìn)展越快。的確，對于所檢測患者疾病進(jìn)展?fàn)顟B(tài)的總體正確的臨床診斷或預(yù)測來說，僅測量NKp44L蛋白表達(dá)水平也許是不夠充分的。因此測量NKp44L表達(dá)水平可通過或結(jié)合疾病的其它診斷或預(yù)測標(biāo)記來完成，例如先前在本說明書中引用的現(xiàn)有技術(shù)標(biāo)記之一。
如此處所使用的SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的“胞外域部分”由包含氨基酸序列SEQ ID NO1中928位氨基酸至1168位氨基酸的多肽組成。
如此處所使用的“配體化合物”由任何分子組成，或者為(i)已從其生物學(xué)環(huán)境中純化的天然存在或天然產(chǎn)生的分子，或者為(ii)經(jīng)部分生物或化學(xué)合成(半合成)制造的分子，或者為(iii)經(jīng)全部生物或化學(xué)合成制備的分子。所述配體化合物必須特異性地(選擇性地)結(jié)合于NKp44L蛋白，這在本發(fā)明上下文中是指當(dāng)用含有人類細(xì)胞的生物樣本孵育時(shí)，該配體化合物唯一地結(jié)合于至少一部分這些人類細(xì)胞所表達(dá)的NKp44L，并且因此反過來不以可檢測的方式與這些細(xì)胞表達(dá)的、不同于NKp44L或不同于CD4+T細(xì)胞的膜表面所暴露的NKp44L蛋白部分的蛋白質(zhì)結(jié)合。最優(yōu)選地是，生物樣本選自(i)全血樣本、(ii)自全血樣本純化出來的外周單核細(xì)胞和多形核白細(xì)胞懸浮液、(iii)自全血樣本純化出來的外周血單核細(xì)胞(PBMC)懸浮液、(iv)自全血樣本純化出來的T細(xì)胞懸浮液、以及(v)自全血樣本純化出來的CD4+T細(xì)胞懸浮液。
如此處所用的結(jié)合于CD4+T細(xì)胞的配體化合物的“數(shù)量”主要是指在分析生物樣本中能夠與所述配體化合物結(jié)合的CD4+T細(xì)胞的比率或百分比，換言之，是在分析生物樣本中表達(dá)NKp44L蛋白的CD4+T細(xì)胞的比率。在另一個(gè)實(shí)施方案中，為了測定結(jié)合于CD4+T細(xì)胞的所述配體化合物的“數(shù)量”，也考慮配體化合物的數(shù)量，例如結(jié)合于表達(dá)NKp44L蛋白的每個(gè)細(xì)胞的配體化合物分子的數(shù)量。直觀地說，結(jié)合于CD4+T細(xì)胞的所述配體化合物的“數(shù)量”可以分析樣本中CD4+T細(xì)胞的比率，優(yōu)選的是以百分比表示，其中所述CD4+T細(xì)胞膜表面表達(dá)的NKp44L蛋白可以通過所述配體化合物與所表達(dá)的KNp44L蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合而檢測到。
因?yàn)楸景l(fā)明人已經(jīng)顯示HIV感染患者CD4+T細(xì)胞的NKp44L蛋白表達(dá)水平與該患者的CD4+T細(xì)胞數(shù)量有關(guān)，所以本發(fā)明的另一個(gè)目的在于在包含HIV病毒感染患者的血細(xì)胞的生物樣本中存在的CD4+T細(xì)胞比率的體外測定方法，其中該方法包含步驟(a)用特異性結(jié)合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的配體化合物與所述生物樣本進(jìn)行孵育；和(b)測量結(jié)合于CD4+T細(xì)胞的所述配體化合物的數(shù)量，由此所測量的該結(jié)合配體化合物的數(shù)量預(yù)示著該生物樣本中包含的CD4+T細(xì)胞比率。
如在此處所用的分析生物樣本中包含的CD4+T細(xì)胞的“比率”由制備分析生物樣本的初始體積全血細(xì)胞中的CD4+T細(xì)胞的數(shù)量組成。例如，CD4+T細(xì)胞的比率可以表示為用于制備該生物樣本的每立方毫米初始全血樣本中CD4+T細(xì)胞的數(shù)量。
根據(jù)上述方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定所檢測患者的CD4+T細(xì)胞的比率，例如像文中實(shí)例所顯示的那樣，通過參照此前或同時(shí)測定所得到的、每個(gè)CD4+T細(xì)胞比率值對NKp44L表達(dá)水平值所繪出的標(biāo)準(zhǔn)對照曲線得到CD4+T細(xì)胞比率。在本實(shí)施方案中，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)上述方法首先測定NKp44L表達(dá)水平，然后從標(biāo)準(zhǔn)對照曲線中確定相應(yīng)的CD4+T細(xì)胞比率。例如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用圖1B中顯示的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
因?yàn)槿缟纤_成人和青少年AIDS病例的定義目前擴(kuò)大為包括每立方毫米CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)少于200個(gè)的HIV感染個(gè)體，并且HIV感染個(gè)體CD4+T細(xì)胞比率和所述CD4+T細(xì)胞的NKp44L蛋白表達(dá)水平有嚴(yán)格的相關(guān)性，因而通過測量所述NKp44L表達(dá)水平恰當(dāng)?shù)卦u價(jià)HIV感染個(gè)體疾病的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)，其中所述的NKp44L表達(dá)水平是通過使用上述第一種方法測量上述定義的結(jié)合于該個(gè)體CD4+T細(xì)胞的配體化合物數(shù)量而測定的。例如，像配體化合物特異性地結(jié)合于表達(dá)的NKp44L蛋白所揭示的那樣，如果NKp44L蛋白的表達(dá)水平值超過表達(dá)NKp44L蛋白的分析生物樣本的CD4+T細(xì)胞20％，所指定患者將包含于AIDS病例中，因?yàn)槿鐖D1B所示20％的數(shù)量值對應(yīng)每立方毫米少于200個(gè)CD4+T細(xì)胞。
因?yàn)橐呀?jīng)顯示，HIV感染患者的CD4+T細(xì)胞的NKp44L蛋白表達(dá)水平與該患者的HIV病毒載量相關(guān)，本發(fā)明的進(jìn)一步的目的在于感染HIV病毒患者的血細(xì)胞生物樣本中HIV病毒載量的體外測定方法，其中該方法包括步驟(a)用特異性結(jié)合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域的配體化合物與所述生物樣本進(jìn)行孵育；和(b)測量結(jié)合于CD4+T細(xì)胞的所述配體化合物的數(shù)量，由此所測量的所述結(jié)合配體化合物的數(shù)量預(yù)示著該生物樣本的HIV病毒載量。
根據(jù)上述方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定所檢測患者的HIV病毒載量，例如，像文中實(shí)例所示那樣，通過參照此前或同時(shí)測定所得到的、每個(gè)HIV病毒載量值對NKp44L表達(dá)水平值所繪出的標(biāo)準(zhǔn)對照曲線得到HIV病毒載量。在該實(shí)施方案中，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)上述方法首先測定NKp44L表達(dá)水平，然后參考標(biāo)準(zhǔn)曲線中確定相應(yīng)的HIV病毒載量。例如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用圖1C中顯示的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
在上述任何一種方法的優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物樣本選自(i)全血樣本、(ii)自全血樣本純化出來的外周單核細(xì)胞和多形核白細(xì)胞懸浮液、(iii)自全血樣本純化出來的外周血單核細(xì)胞(PBMC)懸浮液、(iv)自全血樣本純化出來的T細(xì)胞懸浮液、以及(v)自全血樣本純化出來的CD4+T細(xì)胞懸浮液，例如根據(jù)文中實(shí)例所教導(dǎo)的方法。
在用于上述任何一種方法的配體化合物的第一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述配體化合物由針對SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的抗體或針對其胞外結(jié)構(gòu)域的抗體組成。根據(jù)該第一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，如先前所定義該配體化合物由通過部分或全部生物合成而產(chǎn)生的配體化合物組成。
所述抗NKp44L抗體可由以下過程獲得的多克隆抗體組成(i)給予動物免疫有效量的純化NKp44L蛋白，優(yōu)選的是與免疫佐劑如弗氏完全佐劑結(jié)合，(ii)然后收集已免疫動物的全血，和(iii)純化抗NKp44L的多克隆抗體，例如使用事先固定有純化NKp44L蛋白的免疫親和層析基質(zhì)。這些用于獲得純化多克隆抗體的技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的。
所述抗NKp44L抗體可由多克隆抗體組成，在該種情況下根據(jù)已知的Kohler和Milstein于1975年描述的技術(shù)，該抗NKp44L抗體可從由純化NKp44L蛋白免疫的動物B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合之后而得到的雜交瘤中制備。
所述抗NKp44L抗體也可由通過Kozbor等人于1983年描述的三源雜交瘤技術(shù)(trioma technique)或人類B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)所產(chǎn)生的抗體組成。
所述抗NKp44L抗體也可由噬菌體展示文庫(Ridder等人，1995)獲得的抗體片段的單鏈Fv抗體片段(美國專利US4,946，778；Martineau等人，1998)或人源化抗體(Reinmann等人，1997；Leger等人，1997)組成。
最優(yōu)選地是，抗NKp44L抗體由以下步驟獲得的單克隆抗體組成(i)制備SEQ ID NO1的一批純化的重組NKp44L蛋白；(ii)用步驟(ii)提供的有效量的純化NKp44L蛋白免疫小鼠如BALB/c小鼠，例如以一個(gè)月的時(shí)間段為間隔，連續(xù)3次注射該純化蛋白質(zhì)；(iii)例如使用Clona Cell-HY雜交瘤克隆試劑盒根據(jù)制造商的技術(shù)說明書(StemCell Technologies Inc.，Vancouver，BC，Canada)，通過將步驟(ii)中免疫小鼠的純化B細(xì)胞進(jìn)行融合制備雜交瘤細(xì)胞系；(iv)培養(yǎng)步驟(iii)制備的雜交瘤細(xì)胞系并選擇能夠分泌針對NKp44L的單克隆抗體的克?。缓?v)純化步驟(iv)中所選擇雜交瘤細(xì)胞克隆產(chǎn)生的單克隆抗體。
產(chǎn)生抗NKp44L單克隆抗體的最優(yōu)選的雜交瘤細(xì)胞克隆由雜交瘤細(xì)胞系NKp44L#7.1組成。像實(shí)例中所教導(dǎo)的那樣，優(yōu)選地制備抗NKp44和抗NKp44L單克隆抗體。
為了在上述方法的步驟(i)中制備SEQ ID NO1的一批純化的重組NKp44L蛋白，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用包括以下步驟的方法(i)用已插入編碼SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的核酸優(yōu)選地是SEQ IDNO3的核酸的表達(dá)載體，或已插入編碼包含其胞外結(jié)構(gòu)域的多肽的核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染受體宿主細(xì)胞，優(yōu)選地是哺乳動物細(xì)胞系如COS-7細(xì)胞，并且所述表達(dá)載體中該核酸有效地與至少包含在該受體宿主細(xì)胞中有功能的啟動子的表達(dá)信號相連接，從而當(dāng)置于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下時(shí)所得到的轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞實(shí)際上產(chǎn)生了NKp44L蛋白；(ii)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞宿主，以便產(chǎn)生NKp44L蛋白或其胞外部分；(iii)從培養(yǎng)細(xì)胞的上清液或培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的細(xì)胞裂解物中收集NKp44L蛋白或其胞外部分；(iv)純化步驟(iii)中收集的NKp44L蛋白或其胞外部分，例如通過先前已固定于免疫親和層析基質(zhì)上的抗NKp44L抗體或備選地純化的NKp44蛋白。
文中實(shí)例顯示了制備純化NKp44L的優(yōu)選方法。
在用于上述任何一種方法的配體化合物的第二個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該配體化合物由SEQ ID NO2的純化NKp44蛋白或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多肽組成。這第二個(gè)實(shí)施方案進(jìn)一步闡明了其中通過完全生物合成產(chǎn)生配體化合物的實(shí)施方案。
如此處所使用，NKp44蛋白的胞外域部分定位于SEQ ID NO2的NKp44蛋白N末端而且由SEQ ID NO2的第22位氨基酸殘基始至第169位氨基酸殘基為止的氨基酸序列組成。
為了產(chǎn)生純化形式的NKp44蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分，本領(lǐng)域技術(shù)人員可有利地參考Cantoni等人(1999)公開的方法。例如，可通過以下步驟制備純化形式的NKp44重組蛋白質(zhì)(i)用插入編碼SEQ ID NO2的NKp44的核酸優(yōu)選地是SEQ ID NO4的核酸的表達(dá)載體，或插入編碼其胞外結(jié)構(gòu)域的多肽的核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞宿主，優(yōu)選地是哺乳動物細(xì)胞系如COS-7細(xì)胞，所述表達(dá)載體中該核酸有效地與至少包含在所述受體宿主細(xì)胞中有功能的啟動子的表達(dá)信號相連接，從而當(dāng)置于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中時(shí)所得到的轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞實(shí)際上產(chǎn)生了NKp44蛋白；(ii)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)所轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，以致于產(chǎn)生了NKp44蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域；(iii)從細(xì)胞培養(yǎng)的上清液或所培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的細(xì)胞裂解產(chǎn)物中收集NKp44蛋白或其胞外部分；(iv)純化步驟(iii)中收集的NKp44蛋白或其胞外部分，例如通過先前已固定于免疫親和層析基質(zhì)上的抗NKp44抗體或備選地純化的NKp44L蛋白。
為了測定結(jié)合于CD4+T細(xì)胞的所述配體化合物的數(shù)量，在上述任何一種方法中的步驟(b)中，最優(yōu)選的是用可檢測的分子標(biāo)記該配體化合物，所以測定由檢測所述可檢測分子產(chǎn)生的物理信號組成，其中所獲得的該物理信號值反映結(jié)合于由最初從HIV感染患者收集的生物樣本中的CD4+T細(xì)胞所表達(dá)的NKp44L蛋白的配體化合物數(shù)量。
根據(jù)第一個(gè)優(yōu)選方面，所述可檢測的分子由放射性分子組成，例如當(dāng)通過常規(guī)技術(shù)用放射性標(biāo)記配體化合物本身或當(dāng)配體化合物也結(jié)合于放射性標(biāo)記的可檢測分子時(shí)。
根據(jù)該第一個(gè)優(yōu)選方面，用選自[32p]、[3H]和[35S]的放射性同位素標(biāo)記所述放射性分子。
根據(jù)第二個(gè)優(yōu)選方面，所述可檢測的分子由熒光分子組成。
根據(jù)該第二個(gè)優(yōu)選方面，所述熒光分子最優(yōu)選地選自本領(lǐng)域技術(shù)人員都已知的綠色熒光蛋白(GFP)和黃色熒光蛋白(YFP)。作為例證的所述熒光分子由熒光報(bào)告子FITC蛋白質(zhì)組成并且標(biāo)記可以使用MolecularProbes Inc(美國)投放市場的FITC標(biāo)記試劑盒。
根據(jù)第三個(gè)優(yōu)選方面，所述可檢測分子由發(fā)光分子組成。
根據(jù)該第三個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述發(fā)光分子最優(yōu)選地選自螢光素酶。
根據(jù)第四個(gè)優(yōu)選方面，所述可檢測分子由配體分子選擇性識別的受體組成。
根據(jù)該第四個(gè)優(yōu)選方面，所述可檢測分子由生物素組成，最優(yōu)選的是在生物素化的配體化合物形式時(shí)，此時(shí)配體分子由含有抗生物素蛋白或鏈親和素(streptavidin)分子組成，該配體分子可為(i)放射性標(biāo)記的、(ii)發(fā)熒光的或(iii)發(fā)光的，以便產(chǎn)生能夠被檢測用于測量CD4+T細(xì)胞的NKp44L蛋白表達(dá)水平的物理信號。
根據(jù)本發(fā)明任何一種方法的步驟(b)，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員掌握的任何一種允許測量化合物并且尤其是可檢測的化合物結(jié)合到細(xì)胞膜表面的技術(shù)，對能夠結(jié)合分析樣本中CD4+T細(xì)胞所表達(dá)的NKp44L蛋白的配體化合物的數(shù)量進(jìn)行測量。
最優(yōu)選地是，采用多種可檢測的標(biāo)記，最優(yōu)選地是多種熒光標(biāo)記，包括可檢測的特異性結(jié)合于NKp44L蛋白的配體化合物，通過對生物樣本進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，實(shí)施上述任何一種方法的步驟(b)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，分別用至少兩個(gè)可檢測的標(biāo)記，最優(yōu)選地是兩個(gè)熒光標(biāo)記(i)特異性結(jié)合于NKp44L蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的可檢測的配體化合物；(ii)特異性結(jié)合于CD4抗原的可檢測標(biāo)記最優(yōu)選的是針對CD4抗原的抗體標(biāo)記進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。最優(yōu)選地是，(i)可檢測配體化合物是熒光標(biāo)記的，以便在適當(dāng)光激發(fā)下發(fā)射出第一個(gè)特定波長的熒光信號和(ii)結(jié)合到CD4抗原的可檢測標(biāo)記是熒光標(biāo)記的，以便在適當(dāng)光激發(fā)下發(fā)射出不同于第一個(gè)特定波長的第二個(gè)特定波長的熒光信號。
當(dāng)聯(lián)合使用上述兩個(gè)可檢測的標(biāo)記時(shí)，(i)采用雙色流式細(xì)胞術(shù)分析，經(jīng)過計(jì)數(shù)確定分析生物樣本中CD4+T細(xì)胞的數(shù)量，能夠發(fā)射第二個(gè)特定波長的光的細(xì)胞數(shù)量對應(yīng)著能夠結(jié)合CD4抗原的熒光標(biāo)記的標(biāo)記物，和(ii)采用雙色流式細(xì)胞術(shù)術(shù)，經(jīng)過計(jì)數(shù)確定分析生物樣本中表達(dá)NKp44L蛋白的細(xì)胞數(shù)量，能夠發(fā)射第1個(gè)特定波長的細(xì)胞的數(shù)量對應(yīng)著能夠特異結(jié)合NKp44L蛋白的熒光標(biāo)記的配體化合物，從而計(jì)算出樣本中表達(dá)NKp44L蛋白的CD4+T細(xì)胞的比率。
在上述雙色流式細(xì)胞術(shù)分析測量方法的第一個(gè)特定實(shí)施方案中，在(i)對應(yīng)于熒光標(biāo)記的能夠結(jié)合CD4抗原的標(biāo)記物的第二個(gè)特定波長下和(ii)對應(yīng)于能夠結(jié)合NKp44L蛋白的熒光標(biāo)記化合物的第一個(gè)特定波長下同時(shí)檢測發(fā)射光來確定表達(dá)NKp44L蛋白的CD4+T細(xì)胞的比率，從而直接計(jì)算出樣本中表達(dá)NKp44L蛋白的CD4+T細(xì)胞的比率。
在本發(fā)明的任何一種方法的第二個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，測量結(jié)合于CD4+T細(xì)胞的所述配體化合物數(shù)量的步驟(b)由通過顯微鏡包括共焦顯微鏡測量的結(jié)合于該配體化合物的生物樣本的細(xì)胞計(jì)數(shù)組成。根據(jù)該第二個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，進(jìn)行測量的試劑優(yōu)選與上述的用于流式細(xì)胞術(shù)分析的試劑相同。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于HIV病毒個(gè)體感染進(jìn)展?fàn)顟B(tài)的體外評估試劑盒，其中該試劑盒包含(i)特異性結(jié)合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的配體化合物；(ii)特異性結(jié)合于CD4抗原的標(biāo)記物分子。
上述定義的試劑盒也分別用于(i)體外測定存在于包含HIV病毒感染患者血細(xì)胞的生物樣本的CD4+T細(xì)胞比率；和(ii)體外測定從HIV病毒感染患者收集的包含血細(xì)胞的生物樣本的HIV病毒載量。
在上述本發(fā)明的試劑盒中，配體化合物包含先前已在本說明書中描述過的多種優(yōu)選的實(shí)施方案中的配體化合物。
在上述本發(fā)明的試劑盒中，特異性結(jié)合于CD4抗原的標(biāo)記物分子包含先前已在本說明書中描述過的多種優(yōu)選的實(shí)施方案中的標(biāo)記物分子。
最優(yōu)選地是，如上所述(i)配體化合物和(ii)標(biāo)記物分子是不同熒光標(biāo)記的。
最優(yōu)選地是，標(biāo)記的配體化合物由特異性結(jié)合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的標(biāo)記的單克隆抗體組成。
最優(yōu)選地是，標(biāo)記的標(biāo)記物分子由抗CD4的單克隆抗體組成，如美國典型培養(yǎng)物保藏中心可提供該抗體，保藏號為ATTC-CRL-8002。
正如下文將詳述的，根據(jù)本發(fā)明所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果擴(kuò)展到HIV病毒感染治療的治療領(lǐng)域，并且本發(fā)明因此也涉及治療性活性化合物的篩選方法、藥物組合物以及治療HIV感染患者的方法。
篩選方法、藥物組合物和本發(fā)明的治療方法根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)顯示，當(dāng)CD4+T細(xì)胞表達(dá)的NKp44L蛋白和激活的NK細(xì)胞表達(dá)的NKp44受體蛋白質(zhì)之間的結(jié)合受到阻礙時(shí)，針對表達(dá)NKp44L蛋白的CD4+T細(xì)胞的非MHC依賴的NK細(xì)胞溶解受到阻斷。
更加具體而言，在實(shí)例中顯示，當(dāng)將針對NKp44L蛋白的單克隆抗體加入到從HIV感染患者收集的全血細(xì)胞懸浮液中時(shí)，針對表達(dá)NKp44L蛋白的CD4+T細(xì)胞的非MHC依賴的NK細(xì)胞溶解受到阻斷。本發(fā)明人獲得的這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果意味著，上述單克隆抗體與表達(dá)于CD4+T細(xì)胞膜表面的NKp44L蛋白的結(jié)合阻止了HIV感染患者的CD4+T細(xì)胞被NK細(xì)胞通過NKp44L受體蛋白質(zhì)與NKp44L蛋白特異結(jié)合而發(fā)生的識別，從而有效地阻止了CD4+T細(xì)胞被NK細(xì)胞的細(xì)胞溶解作用，否則會發(fā)生該種細(xì)胞溶解，由此HIV感染患者的免疫缺陷得以進(jìn)展。
因此，根據(jù)本發(fā)明顯示任何一種通過阻止NK細(xì)胞的NKp44受體蛋白質(zhì)與CD4+T細(xì)胞的NKp44L蛋白特異性結(jié)合而起生物學(xué)作用的化合物都可用于抑制或阻斷HIV病毒感染個(gè)體CD4+T細(xì)胞被NK細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞溶解的治療劑。更加具體而言，任何(i)通過特異性結(jié)合于HIV感染患者NK細(xì)胞表達(dá)的NKp44受體蛋白質(zhì)，或(ii)通過特異性結(jié)合于HIV感染患者CD4+T細(xì)胞表達(dá)的NKp44L蛋白阻止NK細(xì)胞NKp44受體蛋白質(zhì)與CD4+T細(xì)胞NKp44L蛋白特異性結(jié)合的化合物都可用于抑制或阻斷HIV感染個(gè)體CD4+T細(xì)胞被NK細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞溶解的治療劑。
因此，根據(jù)本發(fā)明，通過檢測NKp44受體蛋白質(zhì)和NKp44L蛋白之間存在結(jié)合或不存在結(jié)合的任何方法，可有效地篩選任何一種此類有用的治療劑或化合物。
本發(fā)明的篩選方法因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的在于預(yù)防或治療與個(gè)體HIV病毒感染相關(guān)的疾病的化合物體外篩選方法，其中該方法包括步驟(a)將待檢測候選化合物與液體溶劑中的篩選系統(tǒng)孵育，其中所述篩選系統(tǒng)包含(i)暴露于溶劑中的第一配偶體(partner)，為多個(gè)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子；(ii)暴露于溶劑中的第二配偶體，為多個(gè)SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子；其中(iii)一方面，多個(gè)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子，(iv)另一方面，多個(gè)SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子，能夠彼此結(jié)合；(b)對(iii)多個(gè)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子與(iv)多個(gè)SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子的結(jié)合進(jìn)行定量；(c)對在步驟(b)中定量的結(jié)合與缺乏所述候選化合物而實(shí)施步驟(a)時(shí)所定量的結(jié)合進(jìn)行比較；(d)當(dāng)所述候選化合物抑制或阻斷(iii)多個(gè)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子與(iv)多個(gè)SEQ IDNO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子結(jié)合時(shí)，選擇出呈現(xiàn)陽性的候選化合物作為治療劑。
在上述篩選系統(tǒng)中，液體溶液(其中所述液體溶液也可稱為“溶劑”)優(yōu)選水溶液，包括鹽水溶液，其中該鹽水溶液包括用于培養(yǎng)細(xì)胞優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞最優(yōu)選地是人類細(xì)胞的任何合適的培養(yǎng)基。
在上述篩選方法所用篩選系統(tǒng)中，第一和第二“配偶體”獨(dú)立地選自(i)多個(gè)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子，或備選地是多個(gè)SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子，或(ii)其上結(jié)合有多個(gè)SEQ IDNO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子的基質(zhì)物質(zhì)，或備選地其上結(jié)合有多個(gè)SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子的基質(zhì)物質(zhì)，其中該基質(zhì)物質(zhì)包含以暴露于溶劑的方式在其膜表面表達(dá)多個(gè)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子或備選地多個(gè)SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子的細(xì)胞。
根據(jù)上述篩選方法篩選的候選化合物可以屬于任一種類，包括但不限于天然存在或合成的化合物或生物分子如多肽。
在篩選方法的一個(gè)特定實(shí)施方案中，候選化合物由如Parmley和Smith(1988)所描述的包含于噬菌體載體內(nèi)的DNA插入片段的產(chǎn)物組成。具體而言是使用了隨機(jī)肽文庫。隨機(jī)DNA插入片段編碼8到20個(gè)氨基酸長度的肽(Oldenburg等，1992；Valadon等，1996；Lucas，1994；Westerink，1995；Felici等，1991)。根據(jù)該特定實(shí)施方案，表達(dá)特異性結(jié)合(i)SEQID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分，或(ii)SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多肽的重組噬菌體上保留有用于上述篩選方法的候選化合物。
在上述篩選方法中使用的候選化合物也可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)，通過任何免疫親和層析技術(shù)篩選出來，其中免疫親和層析技術(shù)采用其上已事先固定有(i)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多肽分子，或(ii)SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多肽分子的色譜基質(zhì)。
在上述篩選方法的第一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(a)中使用的篩選系統(tǒng)包括使用如Edwards和Leatherbarrow(1997)或Szabo等(1995)描述的光學(xué)生物傳感器。這個(gè)技術(shù)允許實(shí)時(shí)檢測分子之間的相互作用，而不需要經(jīng)過標(biāo)記的分子。這個(gè)技術(shù)基于表面胞質(zhì)共振(SPR)現(xiàn)象。簡單地說，第一蛋白質(zhì)配偶體(partner)分子(i)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多肽或者(ii)SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多肽分子連接到表面(如羧甲基葡聚糖基質(zhì))。然后，將第二蛋白質(zhì)配偶體分子(iii)SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多肽分子或者(iv)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分在待測試候選化合物存在或缺乏的條件下與所述基質(zhì)進(jìn)行孵育，并且檢測第一配偶體和第二配偶體之間的結(jié)合，包括結(jié)合水平，或者不存在結(jié)合。為了該目的，將光束照向不含待檢測樣本的基質(zhì)的表面積那側(cè)并且光束由該基質(zhì)表面反射。因角度和波長的特定組合，SPR現(xiàn)象引起反射光強(qiáng)度下降。第一和第二蛋白質(zhì)配偶體分子結(jié)合引起基質(zhì)表面折射指數(shù)的改變，該種改變作為SRP信號變化而檢測到。
根據(jù)上述篩選方法的第一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，篩選系統(tǒng)的“第一配偶體”由固定有第一蛋白質(zhì)配偶體分子的基質(zhì)組成，篩選系統(tǒng)的“第二配偶體”由第二配偶體蛋白質(zhì)分子本身組成。
在上述篩選方法的第二個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，篩選系統(tǒng)的“第一配偶體”由在它們的膜表面表達(dá)多個(gè)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子的細(xì)胞，有利地是哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選地是人類細(xì)胞并且最優(yōu)選地是NK細(xì)胞組成，篩選系統(tǒng)的“第二配偶體”由在它們的膜表面表達(dá)多個(gè)SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子的細(xì)胞，有利地是哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選地是人類細(xì)胞并且最優(yōu)選地是CD4+T細(xì)胞組成。
本發(fā)明也涉及預(yù)防或治療與個(gè)體HIV病毒感染相關(guān)的疾病的化合物的體外篩選試劑盒，其中該試劑盒包含篩選系統(tǒng)，該篩選系統(tǒng)包含(i)暴露于溶劑的多個(gè)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子的第一個(gè)配偶體；(ii)暴露于溶劑的多個(gè)SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子的第二配偶體；
其中(iii)一方面，多個(gè)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子，和(iv)第二方面，多個(gè)SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子，能夠彼此結(jié)合。
在上述篩選試劑盒中，像先前定義的那樣，第一和第二配偶體用于上述第一種篩選方法。
本發(fā)明還針對預(yù)防和治療與個(gè)體HIV病毒感染相關(guān)的疾病化合物的體外篩選方法，其中該方法包括步驟(a)在待檢測候選治療化合物存在的情況下，將由人活化NK細(xì)胞組成的第一細(xì)胞群和由表達(dá)NKp44L蛋白的人CD4+T細(xì)胞組成的第二細(xì)胞群相接觸；(b)測量經(jīng)活化NK細(xì)胞所導(dǎo)致的CD4+T細(xì)胞溶解；(c)將步驟(b)中獲得的細(xì)胞溶解值與步驟(a)中缺乏候選化合物時(shí)所得到的細(xì)胞溶解值相比較；(d)選擇能夠抑制或阻斷NK介導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞溶解的候選化合物。
盡管上述的第二種方法由體外方法組成，但就預(yù)防活化的NK細(xì)胞溶解CD4+T細(xì)胞來說，上述第二種篩選方法通過直接證明所述候選化合物的生物學(xué)活性而對于直接反映候選化合物治療的潛力有技術(shù)上的優(yōu)勢。
活化的NK細(xì)胞可由來源于NK細(xì)胞系的細(xì)胞組成，如Gong等(1994)描述的NK92細(xì)胞系或可由原代培養(yǎng)的正常人類純化的NK細(xì)胞組成。
表達(dá)NKp44L蛋白的CD4+T細(xì)胞可由用載體轉(zhuǎn)染的以允許所述細(xì)胞表達(dá)NKp44L蛋白的最終以細(xì)胞系形式的CD4+T細(xì)胞組成，或可由最初從HIV感染患者血液樣本純化的CD4+T細(xì)胞組成。
在上述第二種篩選方法的特定實(shí)施方案中，活化的NK細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞是自體的因?yàn)樗鼈兌紒碓从谕籋IV感染患者。
優(yōu)選地是，細(xì)胞溶解的測量由常規(guī)技術(shù)組成，其中作為靶細(xì)胞的CD4+T細(xì)胞最初賦予了放射性51Cr，其中細(xì)胞溶解值是由通過細(xì)胞培養(yǎng)基中溶解的CD4+T細(xì)胞釋放的51Cr數(shù)量測量的細(xì)胞溶解百分比組成。
最優(yōu)選地，細(xì)胞溶解值可以通過分析增加的效應(yīng)細(xì)胞(NK細(xì)胞)與靶細(xì)胞(CD4+T細(xì)胞)的比率例如效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞比率從1∶1到50∶1時(shí)NK細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性得到。
根據(jù)上述第二種篩選方法檢測的候選化合物與根據(jù)本說明書中先前描述的第一種篩選方法檢測的候選化合物相同。
本發(fā)明的藥物組合物和治療方法本發(fā)明進(jìn)一步的目的在于預(yù)防或治療HIV家族病毒個(gè)體感染相關(guān)疾病的藥物組合物，它包含與至少一種生理可接受賦形劑組合的有效量的配體化合物，所述的配體化合物選自(i)特異性結(jié)合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的配體化合物和(ii)特異性結(jié)合于SEQID NO2的NKp44蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的配體化合物。
在上述藥物組合物的第一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述配體化合物由針對SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的抗體或針對其胞外結(jié)構(gòu)域部分的抗體組成。
在上述藥物組合物的第二個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述配體化合物由SEQ ID NO2的NKp44蛋白或包括其胞外結(jié)構(gòu)域的多肽組成。
在上述藥物組合物的第三個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述配體化合物由針對SEQ ID NO2的NKp44蛋白的抗體或針對其胞外結(jié)構(gòu)域部分的抗體組成。
“生理可接受賦形劑或載體”是指可安全地全身或局部使用的固體或液體填充劑、稀釋劑或物質(zhì)。取決于特定的給藥途徑，許多種本領(lǐng)域已知的可藥用載體包括固體或液體填充劑、稀釋劑、助水溶物、表面活性劑和包封物質(zhì)。與F(ab)2片段結(jié)合的載體的量提供了每單位組合物劑量材料的實(shí)際量。
可摻入本發(fā)明組合物中的用于全身施用的可藥用載體包括糖、淀粉、纖維素、植物油、緩沖液、多元醇和藻酸。以下文件描述了特定的可藥用載體(此處全部引用作為參考)美國專利號4,401,663，Buckwalter等1983年8月30日出版；歐洲專利申請?zhí)?89710，LaHann等1983年9月28日發(fā)表；和歐洲專利申請?zhí)?068592，Buckwalter等1983年1月5日發(fā)表。用于腸胃外施用的優(yōu)選載體包括丙二醇、吡咯烷酮、油酸乙酯、含水乙醇及其組合。
代表性的載體包括金合歡膠、瓊脂、藻酸鹽、羥烷基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、角叉藻聚糖、粉末狀纖維素、瓜爾膠、膽固醇、明膠、樹膠瓊脂、阿拉伯樹膠、梧桐膠、印度樹膠、豆角膠、辛苯聚醇-9、油醇、果膠、聚(丙烯酸)和其同系物、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、月桂基硫酸鈉、多聚(環(huán)氧乙烷)、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇單硬脂酸酯、1，2-丙二醇單硬脂酸酯、黃單胞菌膠、西黃蓍膠、脫水山梨糖醇酯、硬脂醇、淀粉和其變體。適宜的變化范圍在約0.5％到約1％。
為了配制本發(fā)明的藥物組合物，本領(lǐng)域技術(shù)人員將方便地參考最新版本的歐洲藥典或美國藥典。
優(yōu)選地，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參考第四版“2002”歐洲藥典或還可以參考USP 25-NF20版美國藥典。
包含于本發(fā)明每一劑量藥物組合物中的治療活性化合物的重量將取決于該治療活性化合物的分子量以及能夠阻斷感染患者CD4+T細(xì)胞被NK細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞溶解的有效重量。
為了測定本發(fā)明劑量的藥物組合物中治療活性化合物的合適量，本領(lǐng)域技術(shù)人員首先測定多種重量或濃度的所述治療活性化合物的體外CD4+T細(xì)胞溶解抑制能力，例如通過進(jìn)行與先前在此描述的本發(fā)明的第二種篩選方法一樣的步驟(a)和(b)，然后保留或選擇能夠阻斷細(xì)胞溶解的特定數(shù)量或濃度的所述治療活性化合物。然后，本領(lǐng)域技術(shù)人員再將該保留或選擇的數(shù)量或濃度轉(zhuǎn)換成人類體內(nèi)情況，以便使施以本發(fā)明的藥物組合物的患者血液中該治療活性化合物的濃度與體外阻斷細(xì)胞溶解的濃度相同。
本發(fā)明也針對選自(i)特異性結(jié)合于SEO ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的配體化合物和(ii)特異性結(jié)合于SEQ ID NO2的NKp44蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的配體化合物在制造用來預(yù)防或治療HIV家族病毒個(gè)體感染相關(guān)疾病的藥物組合物的用途。
本發(fā)明也涉及預(yù)防或治療HIV家族病毒個(gè)體感染相關(guān)疾病的方法，其中該方法包括給需要此種治療的患者施以有效劑量選自(i)特異性結(jié)合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的配體化合物和(ii)特異性結(jié)合于SEQ ID NO2的NKp44蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的配體化合物的步驟。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于預(yù)防或治療HIV家族病毒個(gè)體感染相關(guān)疾病的藥物組合物，其包含與至少一種生理可接受賦形劑組合的能夠與編碼SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的mRNA分子特異性雜交的有效量反義多核苷酸。
優(yōu)選地，通過克隆反義方向的SEQ ID NO3的NKp44L片段(起始于SEQ ID NO3的位置1并終止于位置902)獲得所述反義多核苷酸。
因此，優(yōu)選的反義多聚核苷酸由與核苷酸序列SEQ ID NO3中起始于核苷酸1并終止于核苷酸902的核酸互補(bǔ)的核酸組成。
本發(fā)明也針對能夠與編碼SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的mRNA特異性雜交的反義多核苷酸在制造用于預(yù)防或治療HIV家族病毒個(gè)體感染相關(guān)疾病的藥物組合物中的用途。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的在于預(yù)防或治療HIV家族病毒個(gè)體感染相關(guān)疾病的方法，其中該方法包括對需要此種治療的患者施以有效量的能夠與編碼SEQ ID NO1的NKp441蛋白質(zhì)的mRNA分子特異性雜交的反義多核苷酸的步驟。
本發(fā)明的其它組合物和篩選方法本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)源于HIV gp41蛋白質(zhì)的特異性多肽顯著地增強(qiáng)CD4+T表面Nkp44L蛋白質(zhì)的表達(dá)(下文的實(shí)施例6-8)。
根據(jù)本發(fā)明，也確定了HIV感染患者CD4+T細(xì)胞被NK細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞溶解與細(xì)胞表面NKp44L表達(dá)增加的同時(shí)CD4+T細(xì)胞上所述特異性多肽的結(jié)合直接相關(guān)。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是包含以下氨基酸序列的多肽X1X2X3X4X5X6SWSNKSX7X8X9X10X11(I)，其中X1、X2、X3、X5、X6、X7、X9、X10和X11是指相互獨(dú)立的任一氨基酸殘基，X4是指除了A和W外的任一氨基酸殘基，并且其中X8是指除了E和S外的任一氨基酸殘基。
本發(fā)明進(jìn)一步包含含有以下氨基酸序列的多肽PWASNASWSNKSLDDIW(II)。
如上述定義，多肽優(yōu)選地源于gp41蛋白質(zhì)并具有至少39、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150個(gè)連續(xù)的HIV-1 gp41蛋白質(zhì)氨基酸，而且包含上述式(I)的氨基酸序列。
式(I)中的多肽可通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生，例如基于HIV gp41蛋白質(zhì)的DNA序列，或通過使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)的化學(xué)合成產(chǎn)生。
優(yōu)選地，式(I)的多肽由以下氨基酸序列組成PWASNASWSNKSLDDIW(II)。
下文實(shí)施例6-8說明了氨基酸序列(II)的多肽所誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞表面NKp44L表達(dá)的誘導(dǎo)作用。
細(xì)胞表面NKp44L表達(dá)的誘導(dǎo)作用的高度動力學(xué)與預(yù)先合成的NKp44L細(xì)胞內(nèi)蛋白從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞表面的易位的誘導(dǎo)作用一致。
本發(fā)明也涉及預(yù)防或治療與個(gè)體HIV病毒感染相關(guān)的疾病的化合物的第一種體外篩選方法，其包括步驟(i)用式(I)的多肽與待檢測的候選化合物進(jìn)行孵育；(ii)分析式(I)的多肽與待檢測候選化合物的結(jié)合。
候選化合物與式(I)多肽的結(jié)合可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員例如通過采用雙雜交系統(tǒng)來進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法可用于結(jié)合分析，如生物傳感器技術(shù)(Edwards和Leatherbarrow(1997)或Szabo等(1995))、親和層析或高通量篩選(HTS)(Leblanc等2002)。
根據(jù)上述篩選方法篩選的候選化合物可以是任何種類，包括但不限于天然存在或合成的化合物或生物分子如多肽。
優(yōu)選地，步驟(ii)由對步驟(i)最后獲得的混合物進(jìn)行凝膠遷移分析和檢測候選化合物和式(I)多肽之間形成的復(fù)合體組成。
凝膠遷移分析可以像本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那樣進(jìn)行。
通過測定對應(yīng)于所分析蛋白質(zhì)的染色位置(蛋白質(zhì)帶)，很容易觀察到候選化合物和本發(fā)明多肽之間形成的復(fù)合體，因?yàn)槿绻治龅牡鞍踪|(zhì)為其與另一個(gè)蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體的一部分時(shí)，蛋白質(zhì)的表觀分子量發(fā)生了改變。
一方面，通過特異的抗體或特異針對式(I)多肽的抗體可以檢測凝膠遷移分析的相應(yīng)蛋白質(zhì)的染色(蛋白質(zhì)帶)。另一方面，為了更容易地檢測凝膠上的蛋白質(zhì)/候選化合物，可以對式(I)的多肽進(jìn)行標(biāo)記。例如，為了便于識別凝膠上的不同蛋白質(zhì)，本發(fā)明多肽可以與GST、HA、多聚組氨酸鏈或其它可檢測的分子融合。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及預(yù)防或治療與個(gè)體HIV病毒感染相關(guān)的疾病的化合物的第二種體外篩選方法，其包括步驟a)(i)將第一種CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)物與候選化合物和HIV病毒相接觸；(ii)在缺乏所述候選化合物時(shí)，將第二種CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)物與HIV病毒相接觸；b)檢測源自培養(yǎng)(i)和(ii)的CD4+T細(xì)胞表面NKp44L的存在。
像本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那樣，例如通過對應(yīng)于實(shí)施例6中的材料和方法部分描述的細(xì)胞熒光測定分析，可以對CD4+T細(xì)胞表面NKp44L的存在進(jìn)行檢測。
優(yōu)選地，當(dāng)源自培養(yǎng)物(ii)的CD4+T細(xì)胞表面NKp44L表達(dá)水平比源自培養(yǎng)物(i)的CD4+T細(xì)胞表面NKp44L表達(dá)水平高時(shí)，上述方法包含由陽性選擇作為治療劑的候選化合物組成的附加步驟(c)。
如相應(yīng)的材料方法部分所描述的那樣，通過采用熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)計(jì)數(shù)細(xì)胞表面表達(dá)NKp44L的CD4+T細(xì)胞的數(shù)量，來評估CD4+T細(xì)胞表面NKp44L表達(dá)水平的比較。
備選地，如對應(yīng)于實(shí)施例7中的材料和方法部分描述的那樣，通過測量CD4+T細(xì)胞的NK溶解活性，可直接進(jìn)行CD4+T細(xì)胞表面NKp44L存在的檢測。
雖然上述篩選方法的步驟(b)的具體實(shí)施方案是由體外方法組成的，但就預(yù)防CD4+T細(xì)胞被活化的NK細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞裂解而言，該實(shí)施方案可以通過直接提供所述候選化合物具有生物活性的證據(jù)而直接反映候選化合物的治療效果具有技術(shù)上的優(yōu)勢。
活化的NK細(xì)胞可以由NK細(xì)胞系的細(xì)胞組成，如Gong等(1994)描述的NK92細(xì)胞系或由原代培養(yǎng)的正常人類純化的NK細(xì)胞組成。
表達(dá)NKp44L蛋白的CD4+T細(xì)胞可以由用載體轉(zhuǎn)染的以允許所述細(xì)胞表達(dá)NKp44L蛋白的最終以細(xì)胞系形式的CD4+T細(xì)胞組成，或由最初從HIV感染患者血液樣本中純化的CD4+T細(xì)胞組成。
在上述篩選方法的特定實(shí)施方案中，活化的NK細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞是自體的，因?yàn)槎叨紒碓从谕粋€(gè)HIV感染的患者。
優(yōu)選地，細(xì)胞溶解的測量由常規(guī)技術(shù)組成，其中作為靶細(xì)胞的CD4+T細(xì)胞最初賦予了放射性51Cr，其中細(xì)胞溶解的值是由通過細(xì)胞培養(yǎng)基中溶解的CD4+T細(xì)胞釋放的51Cr數(shù)量測量的細(xì)胞溶解的百分比組成。
最優(yōu)選地，細(xì)胞溶解值可以通過分析增加的效應(yīng)細(xì)胞(NK細(xì)胞)與靶細(xì)胞(CD4+T細(xì)胞)之間比率例如效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞比率為從1∶1到50∶1時(shí)，NK細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性而得到。
在結(jié)合一種或幾種式(I)多肽的候選化合物中，可以選擇剛剛上述的用于篩選方法的候選化合物。
因此，本發(fā)明也涉及預(yù)防或治療與個(gè)體HIV病毒感染相關(guān)的疾病的化合物體外篩選方法，其包括步驟(i)將候選化合物用于上述第一種篩選方法；和(ii)將步驟(i)中選擇為陽性的候選化合物用于剛剛上述的第二種篩選方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是預(yù)防或治療HIV家族病毒個(gè)體感染相關(guān)疾病的藥物組合物，它包含與至少一種生理可接受賦形劑組合的有效量的特異性結(jié)合式(I)多肽的配體化合物。
優(yōu)選地，用于上述藥物組合物的生理可接受賦形劑與本說明書第一部分描述的關(guān)于NKp44L配體的賦形劑相同。
為了按藥方配制本發(fā)明的藥物組合物本領(lǐng)域技術(shù)人員將方便地參考最新版歐洲藥典和美國藥典。
為了測定本發(fā)明劑量的藥物組合物中治療活性化合物的合適量本領(lǐng)域技術(shù)人員首先測定多種重量或濃度的該治療活性化合物的體外CD4+T細(xì)胞溶解抑制能力，例如通過實(shí)施先前在此描述的本發(fā)明的篩選方法，然后保留或選擇能夠阻斷細(xì)胞溶解的特定數(shù)量或濃度的該治療活性化合物。
然后，本領(lǐng)域技術(shù)人員再將該保留或選擇的數(shù)量或濃度轉(zhuǎn)換成人類體內(nèi)情況，以便使施以本發(fā)明的該藥物組合物的患者血液中治療活性化合物的濃度與體外阻斷細(xì)胞溶解的濃度相同。
優(yōu)選地，配體化合物由針對本發(fā)明多肽的抗體組成。
優(yōu)選地，配體化合物或包含其的藥物組合物可與能夠抑制HIV和CD4+T細(xì)胞膜融合的化合物組合。此類化合物如源于gp41蛋白質(zhì)HR1或HR2區(qū)域的肽和更確切地稱為T20、T21的肽或美國專利申請6,623,741中描述的那些肽。
本發(fā)明也涉及特異性結(jié)合于式(I)多肽的配體化合物在制造用于預(yù)防或治療HIV家族病毒個(gè)體感染相關(guān)疾病的藥物組合物中的用途。
另外，本發(fā)明人也顯示蛋白質(zhì)NK44L在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)，如Jurkat細(xì)胞和K562細(xì)胞。
他們也顯示式(I)的多肽誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行NKp44L細(xì)胞表面表達(dá)，然后使這些多肽處理的腫瘤細(xì)胞易感于NK細(xì)胞的特異溶解。
因此，本發(fā)明涉及治療癌癥的方法和包含式(I)多肽的藥物組合物。
本發(fā)明涉及治療癌癥的藥物組合物，其包括與至少一種生理可接受賦形劑組合的有效量式(I)多肽的藥物組合物。
優(yōu)選地，用于上述藥物組合物的生理可接受賦形劑與說明書的第一部分中關(guān)于配體NKp44L的所述賦形劑相同。
與此相似，為了配制本發(fā)明的藥物組合物，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參考關(guān)于NKp44L配體的說明書的第一部分。
本發(fā)明也涉及治療癌癥的藥物組合物，它包含與至少一種生理可接受賦形劑組合的、與靶癌細(xì)胞融合的有效量式(I)的多肽。
優(yōu)選地，以癌細(xì)胞為靶的所述化合物由針對癌特異性抗原的抗體組成，其中所述抗原如美國專利6,338,947描述的乳腺癌特異性的SCP-1、NY-ESO-1或SSX-2，黑素瘤特異性的SSX-2、NY-ESO-1或MAGE-3；或如美國專利6,440,663描述的腎癌特異性的抗原；美國專利6,238,668描述的結(jié)腸癌特異性的KH-1和N3。
通過下面的實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但這些實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例A.實(shí)施例1-5的材料和方法A.1HIV感染的供者在Hpital Pitié-Satpétrière，從同意的供者獲得25個(gè)HIV感染患者的血液樣本。生物-臨床檢查包括常規(guī)測定病毒載量、全血和CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。
通過血庫(Hpital Pitié-Salpétrière)的白細(xì)胞分離，從20個(gè)未感染的供者獲得血液樣本作為對照組。
A.2細(xì)胞熒光測定分析對新鮮收獲的PBMC進(jìn)行三色FACS分析。用同種型匹配的免疫球蛋白作為陰性對照(BD)。用適當(dāng)?shù)目贵w混合物于4℃孵育細(xì)胞1小時(shí)，即抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD56、抗NKp44、抗NKp46或抗NKp44L單克隆抗體。用FACS細(xì)胞溶解液(BD)溶解紅細(xì)胞。像先前描述的那樣，在FACScan上分析最小量20,000個(gè)白細(xì)胞。
為測定細(xì)胞表面活化標(biāo)記物的表達(dá)，用PE或FITC綴合的抗HLA-DR、抗CD69、抗CD25或抗CD71(都來自BD)對PBMC染色并通過FACS進(jìn)行分析。
A.3表達(dá)NKp44L的CD4+T細(xì)胞的純化用RosetteSep CD4+富集試劑盒(StemCell)進(jìn)行CD4+T細(xì)胞亞群分選。通過兩步磁性分離，選擇出表達(dá)NKp44L的陽性CD4+T細(xì)胞，用10g/ml抗NKp44L抗體于室溫孵育CD4+T細(xì)胞1小時(shí)，隨后按照10∶1的珠與細(xì)胞的比率，用山羊抗小鼠IgM包被的Dynabead(Dynal)于室溫處理30分鐘。通過FACS分析測定細(xì)胞級分的純度。
A.4原代NK細(xì)胞的分離和NK細(xì)胞毒性分析NK細(xì)胞系產(chǎn)生于PBMC，然后用StemSep細(xì)胞分離系統(tǒng)和富集NK細(xì)胞的抗體混合物(StemCell technologies)進(jìn)行純化。用添加100單位rhIL-2(Boheringer)的MyeloCult H5100培養(yǎng)基(StemCell technologies)培養(yǎng)純化的NK細(xì)胞。用抗CD3(BD)、抗CD56(BD)、抗NKp44、和抗NKp46單克隆抗體染色后，以流式細(xì)胞術(shù)分析法評價(jià)這些制品的純度。
如先前所描述，在4小時(shí)51Cr釋放分析中分析細(xì)胞溶解活性。簡單地說，用每106個(gè)細(xì)胞100μCi的Na51Cr(Amersham)于37℃標(biāo)記靶細(xì)胞2小時(shí)，并用培養(yǎng)基洗滌兩次。然后將靶細(xì)胞分布于在圓底96孔微量培養(yǎng)板(每孔4×103個(gè)細(xì)胞)，并且以幾種E/T比率添加效應(yīng)細(xì)胞。板子于37℃孵育4小時(shí)。然后收集懸浮液并以γ計(jì)數(shù)測量51Cr的釋放。在包括抗體的實(shí)驗(yàn)中，以終濃度20μg/ml加入。根據(jù)常規(guī)方法計(jì)算相對特異性51Cr釋放。計(jì)算中所扣除的自發(fā)51Cr釋放值是總摻入放射活性的10-20％。減去從對照靶得到的非特異性溶解后即為結(jié)果。每個(gè)點(diǎn)代表三次數(shù)值的平均數(shù)。三次數(shù)值的范圍總是在平均值5％內(nèi)。
A.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用Sperman′s非參數(shù)等級相關(guān)性分析法進(jìn)行相關(guān)性分析。用GraphPadPrism進(jìn)行所有的計(jì)算。
B.實(shí)施例6-10的材料和方法B.1 CD4+T細(xì)胞的純化用RosetteSep CD4+富集試劑盒(StemCell)進(jìn)行CD4+T細(xì)胞亞群分選。通過FACS分析測定細(xì)胞級分純度。
B.2細(xì)胞熒光測定分析對純化的CD4+T細(xì)胞進(jìn)行雙色FACS分析。同種型匹配的免疫球蛋白可用作陰性對照(BD)。用適當(dāng)?shù)目贵w混合物，抗CD4或抗NKp44L抗體，于4℃孵育細(xì)胞1小時(shí)。如先前所述，用FACScan分析最小量20,000個(gè)CD4+T細(xì)胞。如先前所述，了解細(xì)胞內(nèi)NKp44L的表達(dá)。簡單地說，細(xì)胞于4％PFA緩沖液中孵育20分鐘，然后洗滌并在4℃下于0.1％皂甙/PBS/1％BSA緩沖液中染色，然后用FACS分析細(xì)胞。
B.3原代NK細(xì)胞分離和NK細(xì)胞毒性分析NK細(xì)胞系產(chǎn)生于PBMC，然后用StemSep細(xì)胞分離系統(tǒng)和富集NK細(xì)胞的抗體混合物(StemCell technologies)純化。在添加100單位rhIL-2(Boheringer)的MyeloCult H5100培養(yǎng)基(StemCell technologies)中培養(yǎng)純化的NK細(xì)胞。用抗CD3(BD)、抗CD56(BD)、抗NKp44和抗NKp46單克隆抗體染色后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析法評價(jià)這些制品的純度。
如先前所描述，在4小時(shí)51Cr釋放分析中分析細(xì)胞溶解活性。簡單地說，用每106個(gè)細(xì)胞100μCi的Na51Cr(Amersham)于37℃標(biāo)記靶細(xì)胞2小時(shí)，并用培養(yǎng)基洗滌兩次。然后將靶細(xì)胞分布于圓底96孔微量培養(yǎng)板(每孔4×103個(gè)細(xì)胞)，并且以幾種E/T比率添加效應(yīng)細(xì)胞。板子于37℃孵育4小時(shí)。然后收集懸浮液并以γ計(jì)數(shù)測量51Cr的釋放。在包括抗體的實(shí)驗(yàn)中，以終濃度20μg/ml加入。如先前所述，計(jì)算相對特異性51Cr釋放。計(jì)算中所扣除的自發(fā)51Cr釋放值是總摻入放射活性的10-20％。減去從對照靶得到的非特異性溶解后即為結(jié)果。每個(gè)點(diǎn)代表三次數(shù)值的平均數(shù)。三次數(shù)值的范圍總是在平均值5％內(nèi)。
B.4表達(dá)HIV-1蛋白的重組痘苗病毒使用野生野痘苗病毒(WT)或多種重組痘苗病毒以20PFU/細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)感染純化的CD4+T細(xì)胞，將此種細(xì)胞用作靶細(xì)胞。由Transgène(Strasbourg，F(xiàn)rance)提供了HIV-1-LAI Gag、Pol、Env、Nef、Tat和Vif蛋白的重組痘苗病毒。
B.5肽和肽庫合成的15mer肽可從Epytop(Nmes，F(xiàn)rance)購買或由AgenceNationale de la Recherche sur le SIDA友好提供。HPLC譜顯示純度都超過80％。肽庫包括大約10種不同的肽并且每一肽與前面連續(xù)的肽重疊11個(gè)殘基。
C.結(jié)果實(shí)施例1全長和反義NKp44L載體和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子的產(chǎn)生通過在pEF6載體(invitrogen)中連續(xù)亞克隆先前已克隆入PCR-Zero-blunt載體(Lnvitrogen)中的NKp44L的3個(gè)重疊RT-PCR片段得到全長載體(pEF6-NKp44L)；三個(gè)片段為片段A從1(從ATG翻譯位點(diǎn)編號；核苷酸1-3)到902；片段B從813到2066；和片段C從1983到3507(包括TGA終止翻譯位點(diǎn))。根據(jù)操作說明書(STP3試劑盒，Novagen)，通過測序和體外轉(zhuǎn)錄/翻譯分析確認(rèn)全長序列的完整性。
通過將上述片段A以反義方向克隆進(jìn)入pEF6載體獲得RNA反義NKp44L載體(pEF6-NKp44L-AS5)。通過測序確認(rèn)序列的方向和完整性。用pEF6-NKp44L-AS5載體通過電穿孔(230V，250μF)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染1000萬個(gè)721.221細(xì)胞并用10μg/ml殺稻瘟素(lnvitrogen)在24孔板選擇。通過RT-PCR分析證實(shí)pEF6-NKp44L-AS5構(gòu)建體在721.221細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
實(shí)施例2.單克隆抗體的制備使用ClonaCell-HY雜交瘤克隆試劑盒，根據(jù)操作說明書(StemCellTechnologies Inc.)，分別以NKp44-Ig或NKp44L-(HIS)6標(biāo)簽重組蛋白質(zhì)免疫BALB/c小鼠3次，以產(chǎn)生抗NKp44受體(44/8，IgG1)和抗NKp44L的單克隆抗體(7.1，7.7和7.13)。通過基于重組蛋白質(zhì)反應(yīng)性的ELISA方法使用抗小鼠過氧化物酶雜交瘤篩選試劑(Roche)以及FACS分析對抗體進(jìn)行選擇。COS-7細(xì)胞產(chǎn)生NKp44L-(HIS)6標(biāo)簽重組蛋白質(zhì)。哺乳動物表達(dá)載體(pcDNA3/V5-HIS-tag；Invitrogen)編碼含有連續(xù)6個(gè)組氨酸殘基的通過酵母雙雜交得到的NKp44L 169個(gè)C-末端氨基酸的片段。在天然條件下，用鎳親和層析柱純化重組NKp44L蛋白(Xpress system proteinpurification，Invitrogen)。獲得幾種抗NKp44L單克隆抗體經(jīng)FACS分析有效的7.1(IgM)和能夠進(jìn)行免疫沉淀、免疫印跡和免疫染色的7.7(IgM)和7.13(IgM)。在硫酸銨沉淀(50％飽和溶液)后，如先前描所述(Malik和Strominger，1999)在高壓灌流層析裝置(High Pressure Perfusionchromatography Station)內(nèi)以Poros G20 AL蛋白質(zhì)G柱純化抗NKp44單克隆抗體(44/8)，并且以甘露聚糖結(jié)合蛋白質(zhì)(MBP)柱(Pierce)純化IgM抗NKp44L單克隆抗體。使用SDS PAGE證實(shí)純化的單克隆抗體的純度。
實(shí)施例3.HIV感染個(gè)體CD4+T細(xì)胞NKp44L的表達(dá)與疾病階段相關(guān)圖1A)顯示HIV感染患者CD4+T細(xì)胞NKp44L的特異性表達(dá)。比較未感染組(對照，空心標(biāo)志)和HIV感染組(實(shí)心標(biāo)志)。水平線標(biāo)記為平均值。
圖1B)顯示HIV感染患者CD4+T細(xì)胞NKp44L的表達(dá)和外周血CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)之間呈負(fù)相關(guān)。顯示了用Sperman′s非參數(shù)等級相關(guān)性檢驗(yàn)獲得的相關(guān)性(r)和其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P)。
圖1C)顯示CD4+T細(xì)胞NKp44L表達(dá)與病毒載量之間的相關(guān)性。顯示了用Sperman′s非參數(shù)等級相關(guān)性檢驗(yàn)獲得的相關(guān)性(r)和其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P)。
圖1D)顯示PHA活化后HIV感染個(gè)體CD4+T細(xì)胞NKp44L過量表達(dá)。比較5個(gè)未感染的(對照，空心標(biāo)志)和5個(gè)HIV感染(實(shí)心標(biāo)志)患者。NA未活化的細(xì)胞；PHAPHA活化的細(xì)胞。
實(shí)施例4.HIV感染患者CD3-CD56+NK細(xì)胞的NKp44表達(dá)表達(dá)NKp44的NK細(xì)胞的比例在每立方毫米低于500個(gè)CD4+細(xì)胞的HIV感染個(gè)體中明顯高于未感染細(xì)胞(對照)。
實(shí)施例5.HIV感染患者表達(dá)NKp44L的CD4+T細(xì)胞具有較高的NK細(xì)胞溶解敏感性使用NK92 NK細(xì)胞系分析了針對表達(dá)(圓形)或不表達(dá)(方形)NKp44L的二種純化CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性(圖3A)。用抗NKp44L單克隆抗體(a44)處理后，細(xì)胞毒活性受到部分阻斷。
使用2種IL-2活化的自體(auto)NK原代細(xì)胞分析了針對表達(dá)(圓形)或不表達(dá)(方形)NKp44L的純化CD4+T細(xì)胞和作為細(xì)胞毒活性陽性對照的K562(星形)的細(xì)胞毒活性(圖3B)。
使用未活化的自體(auto)NK原代細(xì)胞分析了針對表達(dá)(圓形)或不表達(dá)(方形)NKp44L的2種純化CD4+T細(xì)胞和作為細(xì)胞毒活性陽性對照的K562(星形)的細(xì)胞毒活性(圖3C)。
實(shí)施例6.幾種HIV病毒蛋白質(zhì)對NKp44L表達(dá)的影響使用表達(dá)HIV病毒蛋白質(zhì)的重組痘苗病毒進(jìn)行感染來檢查HIV病毒蛋白質(zhì)對NKp44L表達(dá)的影響。如圖4所示，感染表達(dá)gp160(33.9％)或gp41HIV Env蛋白質(zhì)(35.6％)的痘苗病毒的CD4+T細(xì)胞的NKp44L表達(dá)明顯增強(qiáng)。相反，其它所檢測的HIV蛋白，如Gag、Pol、Tat、nef、vif或gp120，都不影響NKp44L蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)。此外，在非病毒系統(tǒng)中證實(shí)了Env蛋白質(zhì)對于增強(qiáng)NKp44L表達(dá)的作用。用兩種不同來源的重組gp160蛋白質(zhì)處理純化的CD4+T細(xì)胞，并且如圖5A顯示這些gp160重組蛋白質(zhì)影響NKp44L的表達(dá)。的確，當(dāng)分別用gp160-A和gp160-B處理后，10.7％和9.6％的CD4+T細(xì)胞表達(dá)了NKp44L。另一方面，在未處理的細(xì)胞或用對照蛋白質(zhì)孵育的細(xì)胞都中沒有觀察到影響?？傊?，這些結(jié)果表明重組gp160蛋白質(zhì)明顯增強(qiáng)在CD4+T細(xì)胞表面的NKp44L細(xì)胞表面表達(dá)。
實(shí)施例7.gp160誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞的NK細(xì)胞溶解對未處理細(xì)胞、用對照蛋白質(zhì)處理的細(xì)胞或用兩種重組gp160蛋白質(zhì)處理的NK細(xì)胞溶解活性的比較(圖5B)，顯示出在有重組gp160蛋白質(zhì)培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞存在下，靶細(xì)胞溶解增加。使用兩種不同類型的重組gp160蛋白質(zhì)表明用于誘導(dǎo)NKp44L過量表達(dá)和NK細(xì)胞溶解活性增高的方法對實(shí)驗(yàn)的結(jié)果沒有影響。總之，這些結(jié)果表明，對于與NK細(xì)胞溶解活性顯著增高相關(guān)的NKp44L過量表達(dá)來說，gp41 HIV EnV蛋白質(zhì)是必需的。
實(shí)施例8.與NK細(xì)胞溶解活性增加有關(guān)的gp41 HIV Env蛋白質(zhì)的肽基序的鑒定如材料和方法部分描述的那樣，已經(jīng)檢測了所制備的包括所有g(shù)p41蛋白質(zhì)的重疊肽庫的影響。用5μg每一肽庫孵育CD4+T細(xì)胞并針對激活的NK細(xì)胞進(jìn)行檢測。如圖6A所示，用gp41 C肽庫孵育的細(xì)胞，其NK細(xì)胞溶解增加了，而用所有其它肽庫孵育的則無增加。檢測了用每種肽庫處理的純化CD4+T細(xì)胞的NKp44L表達(dá)。該受體僅在gp41C庫處理的細(xì)胞中可以檢測到，并且陽性細(xì)胞的百分比是13.3％。在任何情況下，都檢測不到用其它的檢測肽庫孵育的細(xì)胞上的NKp44L。這表明包含于庫gp41C的一種或幾種肽基序與通過NK44L過量表達(dá)而引起的NK細(xì)胞溶解直接相關(guān)。然后，對包含于庫gp41C的所有肽進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測。如圖7A所示，在肽gp41-C145、gp41-C146和gp41-C147存在下，NK細(xì)胞毒活性顯著增高。相反，用其它所檢測肽實(shí)驗(yàn)時(shí)NK細(xì)胞溶解活性仍很低，接近于背景值。同樣，用肽gp41-C145、gp41-C146和gp41-C147預(yù)處理CD4+T細(xì)胞后，NKp44L表達(dá)增高，陽性細(xì)胞的百分比在22％-16％之間變化，但用其它肽預(yù)處理后沒有變化(陽性細(xì)胞低于7％)(圖7B)。這些結(jié)果預(yù)示著gp41 Env HIV蛋白的特異性肽能增加NK細(xì)胞溶解活性。對該結(jié)論額外的支持來自于包括共有肽基序NH2-SWSNKS-COOH的稱為gp41-C145、gp41-C146和gp41-C147的連續(xù)肽。該gp41 HIV-1蛋白質(zhì)特異性基序高度保守。在已經(jīng)表明一些gp41連續(xù)的肽是NK細(xì)胞溶解的一些主要介導(dǎo)者后，評價(jià)肽基序NH2-SWSNKS-COOH是否與CD4+T細(xì)胞的NK細(xì)胞溶解直接相關(guān)是重要的。使用6mer肽進(jìn)行的初步實(shí)驗(yàn)顯示了細(xì)胞表面NKp44L表達(dá)或NK細(xì)胞毒活性略微增加，提示該序列太小或被一些肽酶攻擊太快。然而，為了證實(shí)這一假設(shè)，已經(jīng)構(gòu)建了源于gp41-C146(WT)的在NH2-SWSNKS-COOH基序(Ctl1)或所有15mer序列(Ctl2)內(nèi)有一些突變的兩個(gè)15mer肽(圖8A)。如圖8B所示，在WT肽存在下，NK細(xì)胞毒活性顯著增加。未處理的細(xì)胞(無處理)或用兩種對照肽處理的細(xì)胞則相反。關(guān)于細(xì)胞表面NKp44L的表達(dá)也觀察到類似情況，的確，用WT肽處理的細(xì)胞內(nèi)大約17.4％的CD4+T細(xì)胞表達(dá)此標(biāo)記物。相反，未處理的或以對照肽處理的細(xì)胞中NKp44L+細(xì)胞的百分比低于4％。這些結(jié)果顯示包含于gp41蛋白質(zhì)的NH2-SWSNKS-COOH基序與CD4+T細(xì)胞的NK細(xì)胞溶解非常相關(guān)。
gp41蛋白質(zhì)的作用是時(shí)間依賴性的(圖9)。用WT肽孵育30分鐘后，啟動NK細(xì)胞溶解活性，并在近4天時(shí)接近最大值。另一方面，用未處理的細(xì)胞或?qū)φ针奶幚淼募?xì)胞處理后，未觀察到明顯的影響。此外，在WT肽處理的細(xì)胞中，用抗NKp44L單克隆抗體預(yù)處理細(xì)胞后，NK細(xì)胞溶解活性增加受到強(qiáng)烈抑制，證實(shí)NK活性與細(xì)胞表面NKp44L表達(dá)的增加直接相關(guān)(圖9C)。然而，對細(xì)胞表面NKp44L表達(dá)的動力學(xué)研究顯示確實(shí)在WT肽處理10分鐘后該受體在細(xì)胞表面迅速表達(dá)，約10％CD4+T細(xì)胞表達(dá)該蛋白質(zhì)，并且于處理后4天達(dá)到表達(dá)的最大量(大約30％)。非常快速的NKp44L細(xì)胞表面表達(dá)提示缺乏新的NKp44L合成，并且提示該蛋白質(zhì)存在于IL2培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞內(nèi)。通過NKp44L的細(xì)胞內(nèi)染色證實(shí)了該假設(shè)。如圖9D所示，在細(xì)胞內(nèi)可檢測到NKp44L的高表達(dá)并且與肽的存在無關(guān)。
實(shí)施例9.不同人類細(xì)胞NKp44L的細(xì)胞表面表達(dá)如圖10所示，檢測K562、Jurkat和靜息PBMC的NKp44L細(xì)胞表面表達(dá)。用1μg/ml抗NKp44L單克隆抗體(灰色粗線)或IgM同種型對照(黑色細(xì)線)孵育細(xì)胞，并用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果清楚地顯示，與PBMC相反，腫瘤細(xì)胞如jurkat和K562細(xì)胞在其表面表達(dá)NKp44L。
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序列表<110>健康和醫(yī)學(xué)國家研究院巴黎醫(yī)療事業(yè)救助局<120>用于體外評估個(gè)體HIV病毒感染的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)的方法<130>P852-EP-INSERM<140>
<141>
<160>4<170>PatentIn版本2.1<210>1<211>1168<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Met Ser Ile Val Ile Pro Leu Gly Val Asp Thr Ala Glu Thr Ser Tyr1 5 10 15Leu Glu Met Ala Ala Gly Ser Glu Pro Glu Ser Val Glu Ala Ser Pro20 25 30Val Val Val Glu Lys Ser Asn Ser Tyr Pro His Gln Leu Tyr Thr Ser35 40 45Ser Ser His His Ser His Ser Tyr Ile Gly Leu Pro Tyr Ala Asp His50 55 60Asn Tyr Gly Ala Arg Pro Pro Pro Thr Pro Pro Ala Ser Pro Pro Pro65 70 75 80Ser Val Leu Ile Ser Lys Asn Glu Val Gly Ile Phe Thr Thr Pro Asn85 90 95Phe Asp Glu Thr Ser Ser Ala Thr Thr Ile Ser Thr Ser Glu Asp Gly100 105 110Ser Tyr Gly Thr Asp Val Thr Arg Cys Ile Cys Gly Phe Thr His Asp
115 120 125Asp Gly Tyr Met Ile Cys Cys Asp Lys Cys Ser Val Trp Gln His Ile130 135 140Asp Cys Met Gly Ile Asp Arg Gln His Ile Pro Asp Thr Tyr Leu Cys145 150 155 160Glu Arg Cys Gln Pro Arg Asn Leu Asp Lys Glu Arg Ala Val Leu Leu165 170 175Gln Arg Arg Lys Arg Glu Asn Met Ser Asp Gly Asp Thr Ser Ala Thr180 185 190Glu Ser Gly Asp Glu Val Pro Val Glu Leu Tyr Thr Ala Phe Gln His195 200 205Thr Pro Thr Ser Ile Thr Leu Thr Ala Ser Arg Val Ser Lys Val Asn210 215 220Asp Lys Arg Arg Lys Lys Ser Gly Glu Lys Glu Gln His Ile Ser Lys225 230 235 240Cys Lys Lys Ala Phe Arg Glu Gly Ser Arg Lys Ser Ser Arg Val Lys245 250 255Gly Ser Ala Pro Glu Ile Asp Pro Ser Ser Asp Gly Ser Asn Phe Gly260 265 270Trp Glu Thr Lys Ile Lys Ala Trp Met Asp Arg Tyr Glu Glu Ala Asn275 280 285Asn Asn Gln Tyr Ser Glu Gly Val Gln Arg Glu Ala Gln Arg Ile Ala290 295 300Leu Arg Leu Gly Asn Gly Asn Asp Lys Lys Glu Met Asn Lys Ser Asp305 310 315 320Leu Asn Thr Asn Asn Leu Leu Phe Lys Pro Pro Val Glu Ser His Ile325 330 335Gln Lys Asn Lys Lys Ile Leu Lys Ser Ala Lys Asp Leu Pro Pro Asp340 345 350
Ala Leu Ile Ile Glu Tyr Arg Gly Lys Phe Met Leu Arg Glu Gln Phe355 360 365Glu Ala Asn Gly Tyr Phe Phe Lys Arg Pro Tyr Pro Phe Val Leu Phe370 375 380Tyr Ser Lys Phe His Gly Leu Glu Met Cys Val Asp Ala Arg Thr Phe385 390 395 400Gly Asn Glu Ala Arg Phe Ile Arg Arg Ser Cys Thr Pro Asn Ala Glu405 410 415Val Arg His Glu Ile Gln Asp Gly Thr Ile His Leu Tyr Ile Tyr Ser420 425 430Ile His Ser Ile Pro Lys Gly Thr Glu Ile Thr Ile Ala Phe Asp Phe435 440 445Asp Tyr Gly Asn Cys Lys Tyr Lys Val Asp Cys Ala Cys Leu Lys Glu450 455 460Asn Pro Glu Cys Pro Val Leu Lys Arg Ser Ser Glu Ser Met Glu Asn465 470 475 480Ile Asn Ser Gly Tyr Glu Thr Arg Arg Lys Lys Gly Lys Lys Asp Glu485 490 495Asp Ile Ser Lys Glu Lys Asp Thr Gln Asn Gln Asn Ile Thr Leu Asp500 505 510Cys Glu Gly Ala Thr Asn Lys Met Lys Ser Pro Glu Thr Lys Gln Arg515 520 525Lys Leu Ser Pro Leu Arg Leu Ser Val Ser Asn Asn Gln Glu Pro Asp530 535 540Phe Ile Asp Asp Ile Glu Glu Lys Thr Pro Ile Ser Asn Glu Val Glu545 550 555 560Met Glu Ser Glu Glu Gln Ile Ala Glu Arg Lys Arg Lys Met Thr Arg565 570 575Glu Glu Arg Lys Met Glu Ala Ile Leu Gln Ala Phe Ala Arg Leu Glu580 585 590
Lys Arg Glu Lys Arg Arg Glu Gln Ala Leu Glu Arg Ile Ser Thr Ala595 600 605Lys Thr Glu Val Lys Thr Glu Cys Lys Asp Thr Gln Ile Val Ser Asp610 615 620Ala Glu Val Ile Gln Glu Gln Ala Lys Glu Glu Asn Ala Ser Lys Pro625 630 635 640Thr Pro Ala Lys Val Asn Arg Thr Lys Gln Arg Lys Ser Phe Ser Arg645 650 655Ser Arg Thr His Ile Gly GLn Gln Arg Arg Arg His Arg Thr Val Ser660 665 670Met Cys Ser Asp Ile Gln Pro Ser Ser Pro Asp Ile Glu Val Thr Ser675 680 685Gln Gln Asn Asp Ile Glu Asn Thr Val Leu Thr Ile Glu Pro Glu Thr690 695 700Glu Thr Ala Leu Ala Glu Ile Ile Thr Glu Thr Glu Val Pro Ala Leu705 710 715 720Asn Lys Cys Pro Thr Lys Tyr Pro Lys Thr Lys Lys His Leu Val Asn725 730 735Glu Trp Leu Ser Glu Lys Asn Glu Lys Thr Gly Lys Pro Ser Asp Gly740 745 750Leu Ser Glu Arg Pro Leu Arg Ile Thr Thr Asp Pro Glu Val Leu Ala755 760 765Thr Gln Leu Asn Ser Leu Pro Gly Leu Thr Tyr Ser Pro His Val Tyr770 775 780Ser Thr Pro Lys His Tyr Ile Arg Phe Thr Ser Pro Phe Leu Ser Glu785 790 795 800Lys Arg Arg Arg Lys Glu Pro Thr Glu Asn Ile Ser Gly Ser Cys Lys805 810 815Lys Arg Trp Leu Lys Gln Ala Leu Glu Glu Glu Asn Ser Ala Ile Leu
820 825 830His Arg Phe Asn Ser Pro Cys Gln Glu Arg Ser Arg Ser Pro Ala Val835 840 845Asn Gly Glu Asn Lys Ser Pro Leu Leu Leu Asn Asp Ser Cys Ser Leu850 855 860Pro Asp Leu Thr Thr Pro Leu Lys Lys Arg Arg Phe Tyr Gln Leu Leu865 870 875 880Asp Ser Val Tyr Ser Glu Thr Ser Thr Pro Thr Pro Ser Pro Tyr Ala885 890 895Thr Pro Thr His Thr Asp Ile Thr Pro Met Asp Pro Ser Phe Ala Thr900 905 910Pro Pro Arg Ile Lys Ser Asp Asp Glu Thr Cys Arg Asn Gly Tyr Lys915 920 925Pro Ile Tyr Ser Pro Val Thr Pro Val Thr Pro Gly Thr Pro Gly Asn930 935 940Thr Met His Phe Glu Asn Ile Ser Ser Pro Glu Ser Ser Pro Glu Ile945 950 955 960Lys Arg Arg Thr Tyr Ser Gln Glu Gly Tyr Asp Arg Ser Ser Thr Met965 970 975Leu Thr Leu Gly Pro Phe Arg Asn Ser Asn Leu Thr Glu Leu Gly Leu980 985 990Gln Glu Ile Lys Thr Ile Gly Tyr Thr Ser Pro Arg Ser Arg Thr Glu99510001005Val Asn Arg Gln Cys Pro Gly Glu Lys Glu Pro Val Ser Asp Leu Gln101010151020Leu Gly Leu Asp Ala Val Glu Pro Thr Ala Leu His Lys Thr Leu Glu1025 103010351040Thr Pro Ala His Asp Arg Ala Glu Pro Asn Ser Gln Leu Asp Ser Thr104510501055
His Ser Gly Arg Gly Thr Met Tyr Ser Ser Trp Val Lys Ser Pro Asp106010651070Arg Thr Gly Val Asn Phe Ser Val Asn Ser Asn Leu Arg Asp Leu Thr107510801085Pro Ser His Gln Leu Glu Val Gly Gly Gly Phe Arg Ile Ser Glu Ser109010951100Lys Cys Leu Met Gln Asp Asp Thr Arg Gly Met Phe Met Glu Thr Thr1105 111011151120Val Phe Cys Thr Ser Glu Asp Gly Leu Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr112511301135Val Asn Asp Asn Leu Ile Asp Gly Asn Cys Thr Pro Gln Asn Pro Pro114011451150Gln Lys Lys Lys Ser Pro Val Gly Asn Phe Val Gly Ser Asn Val Val115511601165<210>2<211>262<212>PRT<213>人<400>2Met Ala Trp Arg Ala Leu His His Trp Leu Leu Leu Leu Leu Phe Pro1 5 10 15Gly Ser Gln Ala Gln Ser Lys Ala Gln Val Leu Gln Ser Val Ala Gly20 25 30Gln Thr Leu Thr Val Arg Cys Gln Tyr Pro Pro Thr Gly Ser Leu Tyr35 40 45Glu Lys Lys Gly Trp Cys Lys Glu Ala Ser Ala Leu Val Cys Ile Arg50 55 60
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<213>人<400>3atgagcatag tgatcccatt gggggttgat acagcagaga cgtcatactt ggaaatggct 60gcaggttcag aaccagaatc cgtagaagct agccctgtgg tagttgagaa atccaacagt 120tatccccacc agttatatac cagcagctca catcattcac acagttacat tggtttgccc 180tatgcggacc ataattatgg tgctcgtcct cctccgacac ctccggcttc ccctcctcca 240tcagtcctta ttagcaaaaa tgaagtaggc atatttacca ctcctaattt tgatgaaact 300tccagtgcta ctacaatcag cacatctgag gatggaagtt atggtactga tgtaaccagg 360tgcatatgtg gttttacaca tgatgatgga tacatgatct gttgtgacaa atgcagcgtt 420tggcaacata ttgactgcat ggggattgat aggcagcata ttcctgatac atatctatgt 480gaacgttgtc agcctaggaa tttggataaa gagagggcag tgctactaca acgccggaaa 540agggaaaata tgtcagatgg tgataccagt gcaactgaga gtggtgatga ggttcctgtg 600gaattatata ctgcatttca gcatactcca acatcaatta ctttaactgc ttcaagagtt 660tccaaagtta atgataaaag aaggaaaaaa agcggggaga aagaacaaca catttcaaaa 720tgtaaaaagg catttcgtga aggatctagg aagtcatcaa gagttaaggg ttcagctcca 780gagattgatc cttcatctga tggttcaaat tttggatggg agacaaagat caaagcatgg 840atggatcgat atgaagaagc aaataacaac cagtatagtg agggtgttca gagggaggca 900caaagaatag ctctgagatt aggcaatgga aatgacaaaa aagagatgaa taaatccgat 960ttgaatacca acaatttgct cttcaaacct cctgtagaga gccatataca aaagaataag 1020aaaattctta aatctgcaaa agatttgcct cctgatgcac ttatcattga atacagaggg 1080aagtttatgc tgagagaaca gtttgaagca aatgggtatt tctttaaaag accataccct 1140tttgtgttat tctactctaa atttcatggg ctagaaatgt gtgttgatgc aaggactttt 1200gggaatgagg ctcgattcat caggcggtct tgtacaccca atgcagaggt gaggcatgaa 1260attcaagatg gaaccataca tctttatatt tattctatac acagtattcc aaagggaact 1320gaaattacta ttgcctttga ttttgactat ggaaattgta agtacaaggt ggactgtgca 1380tgcctcaaag aaaacccaga gtgccctgtt ctaaaacgta gttctgaatc catggaaaat 1440atcaatagtg gttatgagac cagacggaaa aaaggaaaaa aagacgaaga tatttcaaaa 1500gaaaaagata cacaaaatca gaatattact ttggattgtg aaggagcgac caacaaaatg 1560aagagcccag aaactaaaca aagaaagctt tctccactga gactatcagt atcaaataat 1620caggaaccag attttattga tgatatagaa gaaaaaactc ctattagtaa tgaagtagaa 1680atggaatcag aggagcagat tgcagaaagg aaaaggaaga tgacaagaga agaaagaaaa 1740atggaagcaa ttttgcaagc ttttgccaga cttgaaaaaa gagagaaaag aagagaacaa 1800gctttggaaa ggatcagcac agccaaaact gaagttaaaa ctgaatgtaa agatacacag 1860attgtcagtg atgctgaagt tattcaggaa caagcaaaag aagaaaatgc tagcaagcca 1920acccctgcca aagtaaatag aactaaacag agaaaaagtt tttctcggag taggactcac 1980attggacagc agcgtcggag acacagaact gtcagcatgt gttcagatat ccagccatct 2040tctcctgata tagaagttac ttcacaacaa aatgatattg aaaatactgt acttacaata 2100gaaccagaaa ctgaaactgc actagcagaa ataattactg aaactgaagt tccagcactt 2160aataaatgtc ctaccaagta ccccaaaaca aagaagcact tggttaatga atggttaagt 2220gagaagaatg agaagacagg aaaaccttca gatggccttt cagaaaggcc tctacgcata 2280actacagatc ctgaagtgtt agctacacaa ctcaattctt taccaggtct cacttacagc 2340ccccatgtat actccactcc taagcattat attagattta cttcaccatt cctttcagaa 2400aaaaggagaa gaaaagaacc tactgaaaac atttctggtt catgcaagaa gcgatggttg 2460
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1.用于體外評估個(gè)體HIV病毒感染的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)的方法，其中所述方法包括步驟(a)將所述生物樣本與特異結(jié)合SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的配體化合物進(jìn)行孵育；和(b)測量結(jié)合至CD4+T細(xì)胞的所述配體化合物的數(shù)量，由此所測量的所述結(jié)合的配體化合物數(shù)量預(yù)示病毒感染的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)。
2.體外測定收集自HIV病毒感染患者的含有血細(xì)胞的生物樣本中CD4+T細(xì)胞比率的方法，其中所述方法包括步驟(a)將所述生物樣本與特異結(jié)合SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的配體化合物進(jìn)行孵育；和(b)測量結(jié)合于CD4+T細(xì)胞的所述配體化合物的數(shù)量，由此所測量的所述結(jié)合的配體化合物數(shù)量預(yù)示所述生物樣本中含有的CD4+T細(xì)胞比率。
3.用于體外測定收集自HIV病毒感染患者的含有血細(xì)胞的生物樣本中HIV病毒載量的方法，其中該方法包括步驟(a)將所述生物樣本與特異結(jié)合SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的配體化合物進(jìn)行孵育；和(b)測量結(jié)合于CD4+T細(xì)胞的所述配體化合物的數(shù)量，由此所測量的所述結(jié)合的配體化合物數(shù)量預(yù)示所述生物樣本的HIV病毒載量。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物樣本選自(i)全血樣本、(ii)自全血樣本純化的外周單核細(xì)胞和多形核細(xì)胞的懸浮液、(iii)自全血樣本純化的外周血單核細(xì)胞(PBMC)懸浮液、(iv)自全血樣本純化的T細(xì)胞懸浮液、以及(v)自全血樣本純化的CD4+T細(xì)胞懸浮液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述配體化合物由針對SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的抗體或針對其胞外結(jié)構(gòu)域部分的抗體組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述配體化合物由SEQ ID NO2的NKp44蛋白或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多肽組成。
7.權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述配體化合物用可檢測的分子標(biāo)記。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述可檢測的分子選自(i)放射性分子、(ii)熒光分子、(iii)發(fā)光分子、以及(iv)配體分子選擇性識別的受體分子。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述放射性分子是用選自[32P]、[3H]和[35S]的放射性同位素標(biāo)記的。
10.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述熒光分子選自綠色熒光蛋白或黃色熒光蛋白。
11.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述發(fā)光分子由螢光素酶組成。
12.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述受體分子由含有抗生物素蛋白或鏈親和素的分子組成。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)所述的方法，其中測量結(jié)合于CD4+T細(xì)胞的所述配體化合物數(shù)量的步驟(b)由細(xì)胞熒光光度分析該方法步驟(a)中已與所述配體化合物孵育的所述生物樣本組成。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)所述的方法，其中測量結(jié)合于CD4+T細(xì)胞的所述配體化合物數(shù)量的步驟(b)由通過顯微鏡包括共焦顯微鏡計(jì)數(shù)所述生物樣本中含有的其上結(jié)合有所述配體化合物的細(xì)胞組成。
15.體外評估個(gè)體HIV病毒感染的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)的試劑盒，其中所述試劑盒包含(i)特異結(jié)合SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的配體化合物；(ii)特異結(jié)合CD4抗原的標(biāo)記物分子，上述試劑盒也可以分別用于(i)體外測定收集自HIV病毒感染患者的含有血細(xì)胞的生物樣本中的CD4+T細(xì)胞比率；和(ii)體外測定收集自HIV病毒感染患者的含有血細(xì)胞的生物樣本中的HIV病毒載量。
16.權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中(i)配體化合物和(ii)標(biāo)記物分子用不同的熒光標(biāo)記。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的試劑盒，其中配體化合物由特異結(jié)合SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的經(jīng)標(biāo)記單克隆抗體組成。
18.根據(jù)權(quán)利要求15-17中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其中經(jīng)標(biāo)記的標(biāo)記物分子由抗CD4單克隆抗體組成。
19.體外篩選化合物的方法，所述化合物用于預(yù)防或治療與個(gè)體HIV病毒感染相關(guān)的疾病，其中該方法包括步驟(a)將待檢測候選化合物與液體溶劑中的篩選系統(tǒng)孵育，其中所述篩選系統(tǒng)包含(i)暴露于溶劑中的第一配偶體，為多個(gè)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子；(ii)暴露于溶劑中的第二配偶體，為多個(gè)SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子；其中(iii)一方面，多個(gè)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子，和(iv)另一方面，多個(gè)SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子，能夠彼此結(jié)合；(b)對(iii)多個(gè)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子與(iv)多個(gè)SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子的結(jié)合進(jìn)行定量；(c)對在步驟(b)中定量的結(jié)合與缺乏所述候選化合物而實(shí)施步驟(a)時(shí)所定量的結(jié)合進(jìn)行比較；(d)當(dāng)所述候選化合物抑制或阻斷(iii)多個(gè)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子與(iv)多個(gè)SEQ IDNO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子結(jié)合時(shí)，選擇出呈現(xiàn)陽性的候選化合物作為治療劑。
20.體外篩選化合物的試劑盒，所述化合物用于預(yù)防或治療與個(gè)體HIV病毒感染相關(guān)的疾病，其中該試劑盒所包含的篩選系統(tǒng)含有(i)暴露于溶劑中的第一配偶體，為多個(gè)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子；(ii)暴露于溶劑中的第二配偶體，為多個(gè)SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子；其中(iii)一方面，多個(gè)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子，和(iv)另一方面，多個(gè)SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結(jié)構(gòu)域部分的多個(gè)多肽分子，能夠彼此結(jié)合。
21.體外篩選化合物的方法，所述化合物用于預(yù)防或治療與個(gè)體HIV病毒感染相關(guān)的疾病，其中該方法包括步驟(a)在待檢測的候選治療化合物存在的情況下，將由人活化NK細(xì)胞組成的第一細(xì)胞群和由表達(dá)NKp44L蛋白的人CD4+T細(xì)胞組成的第二細(xì)胞群相接觸；(b)測量活化的NK細(xì)胞所導(dǎo)致的CD4+T細(xì)胞溶解；(c)將步驟(b)中獲得的細(xì)胞溶解值與當(dāng)步驟(a)中缺乏候選化合物時(shí)所得到的細(xì)胞溶解值相比較；(d)選擇抑制或阻斷NK介導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞溶解的候選化合物。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中活化的NK細(xì)胞可由來自NK細(xì)胞系的細(xì)胞組成，或由正常人類的經(jīng)純化NK細(xì)胞的原代培養(yǎng)物組成。
23.權(quán)利要求21所述的方法，其中表達(dá)NKp44L蛋白的CD4+T細(xì)胞由用載體轉(zhuǎn)染以允許所述細(xì)胞表達(dá)NKp44L蛋白的最終處于細(xì)胞系形式的CD4+T細(xì)胞組成，或由最初從HIV感染患者的血液樣本純化的CD4+T細(xì)胞組成。
24.權(quán)利要求21所述的方法，其中活化的NK細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞是自體的并且均來源于同一HIV感染患者。
25.預(yù)防或治療與個(gè)體HIV病毒感染相關(guān)的疾病的藥物組合物，其包含與至少一種生理可接受賦形劑組合的有效量的選自(i)特異結(jié)合SEQ IDNO1的NKp44L蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的配體化合物和(ii)特異結(jié)合SEQ ID NO2的NKp44蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的配體化合物。
26.權(quán)利要求25所述的藥物組合物，其中所述配體化合物由針對SEQID NO1的NKp44L蛋白的抗體或針對其胞外結(jié)構(gòu)域部分的抗體組成。
27.權(quán)利要求25所述的藥物組合物，其中所述配體化合物由SEQ IDNO2的NKp44蛋白或包含其胞外結(jié)構(gòu)域的多肽組成。
28.權(quán)利要求25所述的藥物組合物，其中所述配體化合物由針對SEQID NO2的NKp44蛋白的抗體或針對其胞外結(jié)構(gòu)域的抗體組成。
29.選自(i)特異結(jié)合SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的配體化合物和(ii)特異結(jié)合SEQ ID NO2的NKp44蛋白或其胞外結(jié)構(gòu)域部分的配體化合物的用途，用于制備預(yù)防或治療與個(gè)體HIV病毒感染相關(guān)的疾病的藥物組合物。
30.用于預(yù)防或治療與個(gè)體HIV病毒感染相關(guān)的疾病的藥物組合物，其包含與至少一種生理可接受賦形劑組合的有效量的能夠與編碼SEQ IDNO1的NKp44L蛋白的mRNA分子特異性雜交的反義多核苷酸。
31.權(quán)利要求30所述的藥物組合物，其中所述反義多核苷酸由與核苷酸序列SEQ ID NO3的起始于第1位核苷酸并終止于第902位核苷酸的核酸互補(bǔ)的核酸組成。
32.與編碼SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的mRNA分子特異性雜交的反義多核苷酸的用途，用于制備預(yù)防或治療與個(gè)體HIV病毒感染相關(guān)的疾病的藥物組合物。
33.包含以下氨基酸序列的多肽X1X2X3X4X5X6SWSNKSX7X8X9X10X11(I)，其中X1、X2、X3、X5、X6、X7、X9、X10和X11是指相互獨(dú)立的任一氨基酸殘基，X4是指除了A和W外的任一氨基酸殘基，并且其中X8是指除了E和S外的任一氨基酸殘基。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的多肽，其包含以下氨基酸序列PWASNASWSNKSLDDIW(II)。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的多肽，其由以下氨基酸序列組成PWASNASWSNKSLDDIW(II)。
36.體外篩選化合物的方法，所述化合物用于預(yù)防或治療與個(gè)體HIV病毒感染相關(guān)的疾病，其中該方法包括步驟(i)將待檢測候選化合物與權(quán)利要求33-35中任意一項(xiàng)所述的多肽孵育；(ii)分析待檢測候選化合物與權(quán)利要求33-35中任意一項(xiàng)所述多肽的結(jié)合。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中步驟(ii)由對步驟(i)最后獲得的混合物進(jìn)行凝膠遷移分析并對候選化合物和權(quán)利要求33-35中任意一項(xiàng)所述多肽之間形成的復(fù)合體進(jìn)行檢測組成。
38.體外篩選化合物的方法，所述化合物用于預(yù)防或治療與個(gè)體HIV病毒感染相關(guān)的疾病，其中該方法包括步驟a)(i)將第一種CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)物與候選化合物和HIV病毒相接觸；(ii)在缺乏所述候選化合物的情況下，將第二種CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)物與HIV病毒接觸；和b)檢測源于培養(yǎng)物(i)和培養(yǎng)物(ii)的CD4+T細(xì)胞表面NKp44L的存在。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其包括額外的步驟(c)，該步驟由當(dāng)源自培養(yǎng)物(ii)的CD4+T細(xì)胞表面NKp44L的表達(dá)水平高于源自培養(yǎng)物(i)的CD4+T細(xì)胞表面NKp44L的表達(dá)水平時(shí)，選擇呈陽性的候選化合物作為治療劑組成。
40.體外篩選化合物的方法，所述化合物用于預(yù)防或治療與個(gè)體HIV病毒感染相關(guān)的疾病，其中該方法包括步驟(i)將候選化合物用于權(quán)利要求36或37所述的篩選方法；和(ii)將在步驟(i)中選擇的呈陽性候選化合物用于權(quán)利要求38或39的篩選方法。
41.用于預(yù)防或治療與個(gè)體HIV病毒感染相關(guān)的疾病的藥物組合物，其包含與至少一種生理可接受賦形劑組合的有效量的特異結(jié)合權(quán)利要求33-35中任意一項(xiàng)所述多肽的配體化合物。
42.權(quán)利要求41所述的藥物組合物，其中所述配體化合物由針對權(quán)利要求33-35中任意一項(xiàng)所述多肽的抗體組成。
43.特異結(jié)合權(quán)利要求33-35中任意一項(xiàng)所述多肽的配體化合物的用途，用于制備預(yù)防或治療與個(gè)體HIV病毒感染相關(guān)的疾病的藥物組合物。
44.用于治療癌癥的藥物組合物，其包含與至少一種生理可接受賦形劑組合的有效量的權(quán)利要求33-35中任意一項(xiàng)所述的多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及個(gè)體感染屬于人類免疫缺陷病毒(HIV)家族病毒的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)的體外診斷以及這種傳染病治療性治療的領(lǐng)域。
文檔編號G01N33/50GK1777810SQ200480009114
公開日2006年5月24日 申請日期2004年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月6日
發(fā)明者V·維埃拉德, P·德布雷 申請人:健康和醫(yī)學(xué)國家研究院, 巴黎醫(yī)療事業(yè)救助局