專利名稱：淀粉樣β(1－42)蛋白寡聚體、其衍生物及抗體、其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)調(diào)節(jié)的淀粉樣β(1-42)蛋白寡聚體、特定的生產(chǎn)方法(通過此方法能夠以可重復(fù)方式以高得率獲得該寡聚體)、該寡聚體作為診斷和治療劑在產(chǎn)生寡聚體特異性抗體及尋找可與該寡聚體和其構(gòu)成物相互作用的物質(zhì)中的用途。
本發(fā)明同樣也涉及所述寡聚體的衍生物(特別是交聯(lián)的寡聚體和以淀粉樣β(1-42)蛋白的截短形式為基礎(chǔ)的寡聚體)、其制備及其用途。
正如抗體本身和所述抗體或物質(zhì)作為診斷性或治療性試劑的用途，也描述了產(chǎn)生抗體和發(fā)現(xiàn)物質(zhì)的相應(yīng)方法。
淀粉樣β(1-42)蛋白，也簡稱為Aβ(1-42)，是阿爾茨海默和唐氏(Down’s)綜合征患者腦中的細胞外由蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物和鹽組成的不可溶性沉積物(老年或神經(jīng)炎斑)的主要成分(C.L.Masters等，PNAS 82，4245-4249，1985)。該蛋白質(zhì)在水環(huán)境中趨于多聚化，可能以非常不同的分子形式存在。
不可溶性蛋白質(zhì)的沉積與諸如阿爾茨海默氏病之類的癡呆病癥的出現(xiàn)或進展之間的簡單相關(guān)經(jīng)證明是不令人信服的(R.D.Terry等，Neurobiol.Aging 16，285-298(1995))。相反，突觸和認知的償失似乎與Aβ(1-42)的可溶形式更加相關(guān)(L.F.Lue等，Am.J.Pathol.155，853-862，(1999)，C.A.McLean等，Ann.Neurol.46，860-866(1999))。
對于Aβ(1-42)的可溶性形式，主要有兩種不同假說推測分子形式為阿爾茨海默氏病這類癡呆病癥的原因。
首先，假設(shè)了Aβ(1-42)原纖維的細胞毒性作用。后者依然是可溶的、纖維狀、相對高度聚集的Aβ(1-42)形式，具有150至250kDa范圍分子量(Arispe等，PNAS 90.567(1993)，Lashuel等，Nature 418，291(2002))，由于形成孔的特性，顯然引起通過神經(jīng)元細胞膜的不受控制的鈣流入。
第二，已描述了具有15-30kDa范圍內(nèi)的寡聚Aβ(1-42)衍生物(M.P.Lambert等，PNAS 95，6448-6453(1998))。在顯示抑制海馬部位神經(jīng)元長時程增強速率的制品中，可以發(fā)現(xiàn)這些非纖維狀寡聚體，也被稱為淀粉樣蛋白質(zhì)衍生的、可擴散及導(dǎo)致癡呆(dementing)的配體(ADDL′s forAmyloid Derived Dementing Ligands，見US-A 6,218,506及WO 01/10900，或for Amyloid Derived Diffusible Ligands，見Lambert等，前文)。
然而，對寡聚體的現(xiàn)有研究水平以對于實際相關(guān)種類的顯著不確定性為特征。文獻中的信息差異顯著。因此，US-A 6,218,506描述了具有3至12個亞基的ADDL，而在WO 01/10900中描述的ADDL可能具有高達24個亞基。
更具體地，至少討論了兩種形式，這兩種形式在非變性條件下的凝膠電泳分析中分別具有27至28kDa和23至24kDa(US-A 6,218,506)或26kDa至28kDa(WO 01/10900)和17kDa至27kDa(M.P.Lambert等，PNAS 95，6448-6453(1998))范圍內(nèi)的分子量，以及在變性條件下的SDS凝膠電泳分析中分別為17kDa和22kDa(M.P.Lambert等，PNAS95，6448-6453(1998))和約22kDa至約24kDa和約18kDa至約19kDa(WO 01/10900)的分子量?，F(xiàn)也通過蛋白質(zhì)印跡在阿爾茨海默患者的腦上檢測到具有8kDa至12kDa范圍分子量的SDS穩(wěn)定的Aβ(1-42)寡聚體(C.A.McLean等，Ann.Neuro1.46，860-866(1999))。
所述制備方法具有導(dǎo)致不均一寡聚體制品的缺點。
因此，現(xiàn)在還不可能以可重復(fù)的方式提供負責(zé)神經(jīng)調(diào)節(jié)的Aβ(1-42)的分子形式，更不用說明確鑒定。
然而，可以從例如對阿爾茨海默患者自動免疫接種的最初臨床研究過程衡量均一制品的重要性。由于形成的抗體也識別假定為細胞內(nèi)襯(celllining)所需的Aβ(1-42)形式，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，以Aβ(1-42)的聚集前形式接種，在一些患者當中引起相當?shù)母弊饔?mengioencephalitis、出血)(D.Schenk.；Nat.Rev.Neurosci.3，824-828(2002))。
因此，特別以中和實際損害性蛋白質(zhì)形式為目標的傳統(tǒng)治療，絕對需要后者的鑒定和明確的制品。
另外，已報道了與阿爾茨海默氏病有關(guān)的Aβ(1-42)蛋白質(zhì)的N末端截短形式的出現(xiàn)。除了Aβ(1-42)之外，早在1985年，在死亡的阿爾茨海默患者腦沉積物中也檢測到N末端截短形式(C.Masters等，PNAS 82，4245-4249(1985))。因此，也已知存在于腦中的特定蛋白酶(如中性溶酶(NEP 24.11)或IDE(胰島素降解酶的縮寫))可以降解Aβ(1-42)(D.J.Selkoe，Neuron 32，177-180，(2001))。
然而，N末端截短形式在阿爾茨海默氏病發(fā)病機理中的重要性尚不清楚(E.B.Lee等，JBS 278，4458-4466(2003))。有趣的是，一些罹患散發(fā)性或家族性阿爾茨海默氏病或唐氏綜合癥的患者優(yōu)先累積這些截短形式(J.Nslund等，PNAS 91，8378-8382，(1994)，C.Russo等，Nature 405，531-532，(2000)，T.C.Saido等，Neuron 14，457-466，(1995))。相對新近的研究(N.Sergeant等，J.of Neurochemistry 85，1581-1591(2003))顯示，在死亡的阿爾茨海默患者腦中，60％的不可溶性Aβ肽基于N末端截短形式。
抗Aβ(1-42)蛋白質(zhì)單體及其特定片段的抗體已有描述。
因此，WO 03/016466和WO 03/016467涉及單克隆抗體266及其缺乏CDR2中特定的糖基化位點的類似物。其人源化版本(Hu-266)也已知。這些文件也提及同抗體226一樣識別Aβ(1-42)氨基酸13-28區(qū)域中表位的其它單克隆抗體。這些包括抗體4G8(也在Lue等，(1999)中提及，前文)和1C2。另外，McLean等，(1999)(前文)中提及抗體1E8，該抗體顯然識別Aβ(1-42)氨基酸18-22區(qū)域中的表位。
此外，已知許多識別Aβ(1-42)N末端序列表位的其它抗體。這些包括可商業(yè)獲得的單克隆抗體6E10(也在WO01/10900；Nslund等，(1994)，前文；Sergeant等，(2003)，前文中提及)和單克隆抗體3D6及10D5(見WO03/016467)和Ban50及NAB228(Lee等，(2003)，如上)。
另外，必須提到單克隆抗體WO2、21F12和3D6以及多克隆血清ADA42(Sergeant等，(2003)，前文)。
關(guān)于目前經(jīng)歷臨床前試驗的抗Aβ(1-42)抗體的概述可見于Schenk等，(2002)，如上。
本發(fā)明基礎(chǔ)提供引起Aβ(1-42)的神經(jīng)調(diào)節(jié)作用，特別是神經(jīng)元損傷性作用的分子形式為目的，該分子形式在諸如阿爾茨海默氏病和唐氏綜合癥這類癡呆病癥中的有所增加存在；本發(fā)明使用特定方法，依靠可以從單體Aβ(1-42)蛋白質(zhì)以均質(zhì)制品形式獲得的特定Aβ(1-42)寡聚體，以及依靠所述寡聚體的衍生物，特別是交聯(lián)的寡聚體和基于截短Aβ(1-42)形式的寡聚體，來實現(xiàn)所述目的。制備方法使得在水性介質(zhì)中難溶的肽合成的Aβ(1-42)蛋白質(zhì)能夠以高得率轉(zhuǎn)變?yōu)槊鞔_可溶的寡聚體。
本發(fā)明因此涉及權(quán)利要求中詳細定義的主題。
本發(fā)明因此涉及淀粉樣β(1-42)蛋白的寡聚體，所述寡聚體在SDS凝膠電泳中具有約15kDa、20kDa、38kDa或48kDa的表觀分子量，或涉及該寡聚體的衍生物，其分子量依據(jù)衍生而可能會或可能不會發(fā)生改變。
淀粉樣β(1-42)蛋白是具有42個氨基酸的多肽，其通過蛋白質(zhì)水解加工而來自淀粉樣前體蛋白質(zhì)(APP)。除了人類變體，這也包括出現(xiàn)在除人類之外的生物，特別是其它哺乳動物，尤其是大鼠中的淀粉樣β(1-42)蛋白同種型。
根據(jù)具體的實施方案，本發(fā)明涉及人類淀粉樣β(1-42)蛋白的寡聚體。人類淀粉樣β(1-42)蛋白具體包括具有氨基酸序列SEQ ID NO1的蛋白質(zhì)，以及從所述序列衍生、特別是通過氨基酸交換而來的突變蛋白質(zhì)及其等位基因變體。就此而言，必須非常具體地提到下列氨基酸置換A21G、E22K、E22Q、E22G和D23N。因此，根據(jù)本發(fā)明，淀粉樣β(1-42)蛋白的突變蛋白質(zhì)或等位基因變體具體包括具有氨基酸序列SEQ ID NO1的蛋白質(zhì)，其中選自丙氨酸21、谷氨酸22和天門冬氨酸的一個或多個氨基酸被不同的氨基酸置換，這些氨基酸優(yōu)選自甘氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺和天門冬酰氨。根據(jù)本發(fā)明，特別重要的是在22位、特別是被谷氨酰胺或谷氨酸置換。
根據(jù)另一個具體的實施方案，本發(fā)明涉及大鼠淀粉樣β(1-42)蛋白的寡聚體。大鼠淀粉樣β(1-42)蛋白具體包括具有氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，以及從所述序列衍生、特別是通過氨基酸交換而來的突變蛋白質(zhì)及其等位基因變體。就此而言，必須非常具體地提到的是那些對應(yīng)于在人類序列中討論的氨基酸置換。
可以通過已知的肽合成方法或重組制備淀粉樣β(1-42)蛋白。另外，這些蛋白質(zhì)許多可商業(yè)獲得。以上同樣應(yīng)用于突變蛋白質(zhì)和等位基因變體。
本發(fā)明的寡聚體可以通過淀粉樣β(1-42)蛋白的寡聚化獲得。寡聚化包括單體淀粉樣蛋白質(zhì)的非共價聚集，所以可以假定本發(fā)明的寡聚體由多個淀粉樣β(1-42)蛋白單體組成。
依賴于寡聚化程度，本發(fā)明的寡聚體具有不同的分子量。因此可以通過變性凝膠電泳為該寡聚體指定表觀分子量。在標準變性條件下(Tris-甘氨酸凝膠，4-20％，參照Lmmli UK，Nature 227，680-685(1970))，使用下列標準蛋白質(zhì)進行凝膠電泳時，所述表觀分子量對于寡聚體A1約15kDa，對寡聚體A2約20kDa，對寡聚體B1約38kDa，對于寡聚體B2約48kDa，所述標準蛋白質(zhì)在同一條件下具有下列表觀分子量肌球蛋白250為kDa，牛血清白蛋白為98kDa，谷氨酰胺氫化酶為64kDa，碳酸酐酶為36kDa，肌紅蛋白為30kDa，溶菌酶為16kDa，抑肽酶為6kDa，胰島素B鏈為4kDa(參照藍色預(yù)染標準物)。根據(jù)另一方面，當在標準天然條件下(Tris-甘氨酸凝膠，4-20％)，使用下列標準蛋白質(zhì)進行凝膠電泳時，對于寡聚體B，分子量約為64至90kDa，標準蛋白質(zhì)在同一條件下具有下列表觀分子量肌球蛋白250kDa，牛血清白蛋白98kDa，谷氨酰胺氫化酶64kDa，碳酸酐酶36kDa，肌紅蛋白30kDa，溶菌酶16kDa，抑肽酶6kDa，胰島素B鏈4kDa(參照藍色預(yù)染標準物)。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明的寡聚體以神經(jīng)元細胞親和性為特征。可以假定該寡聚體結(jié)合特定的細胞表面蛋白質(zhì)，尤其是受體。
因此，本發(fā)明也涉及測定本發(fā)明的寡聚體與預(yù)先確定的細胞結(jié)構(gòu)結(jié)合的方法，該方法包括i)允許本發(fā)明的寡聚體作用于所述細胞結(jié)構(gòu)，以及
ii)測定本發(fā)明的寡聚體是否與該細胞結(jié)構(gòu)結(jié)合。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明的寡聚體以神經(jīng)調(diào)節(jié)作用為特征。當允許至少一種本發(fā)明的寡聚體作用于神經(jīng)元細胞(例如成神經(jīng)細胞)瘤細胞的培養(yǎng)物時，這種神經(jīng)調(diào)節(jié)作用特別能夠以該細胞降低的存活率降低(神經(jīng)毒性)而證明自身。這里，以本身已知的方式評價細胞存活率是可能的，例如，測定由本發(fā)明寡聚體的作用引起的凋亡程度。出于此目的，可以使用適宜的測定方法，例如基于3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基-四唑溴(MTT)的比色方法。這種神經(jīng)調(diào)節(jié)作用能夠以神經(jīng)元發(fā)放速率的調(diào)節(jié)而具體地在體內(nèi)表明其本身。
因此，本發(fā)明也涉及測定本發(fā)明的寡聚體的活性，尤其是神經(jīng)毒性的方法，該方法包括i)允許本發(fā)明的寡聚體作用于細胞并且ii)測定該細胞的狀態(tài)是否被改變。
可以以上文說明的方式為所述方法提供本發(fā)明的寡聚體，例如，以任何上述組合物的形式提供。細胞及細胞結(jié)構(gòu)能便利地以體外提供，特別是以細胞培養(yǎng)物或其他形式，就細胞結(jié)構(gòu)而言，以勻漿物提供。這里，神經(jīng)元細胞，特別是成神經(jīng)細胞瘤細胞起測定神經(jīng)毒性的作用。另外，體內(nèi)(特別是作為生物體例如實驗動物的部分)或離體提供細胞也是可能的。
通常在寡聚體作用之前和之后至少一次測定細胞狀態(tài)。如果作用前狀態(tài)和作用后狀態(tài)之間的比較產(chǎn)生差異，則測試的寡聚體具有活性。
將要測定的狀態(tài)類型取決于將要測定的活性類型。例如，可以通過測定存活率測定神經(jīng)毒性。出于此目的，可以測定基于寡聚體作用前后的細胞總數(shù)的活細胞比例，并彼此比較。
基于上文測定結(jié)合或活性的方法，根據(jù)具體的實施方案，可以測試物質(zhì)是否抑制本發(fā)明的寡聚體的結(jié)合和/或調(diào)節(jié)，即部分降低或基本完全抑制、或增強其活性。
出于此目的，原則上至少實施兩次本方法，一次存在測試物質(zhì)，還有一次沒有測試物質(zhì)。出于此目的，通常在提供寡聚體之后將所述測試物質(zhì)其加入寡聚體。
然而，如果旨在測定待測物質(zhì)是否影響寡聚體的形成，宜于在寡聚體已經(jīng)形成之前，即在提供寡聚體之前，將該物質(zhì)加至用于寡聚體形成的反應(yīng)物中。因此，可以在添加測試物質(zhì)的情況下實施本發(fā)明制備方法，然后測定寡聚體是否形成及形成程度。出于此目的，可以測定這種方式獲得的方法產(chǎn)物是否具有本發(fā)明寡聚體的特征，即，例如它們的分子量、結(jié)合能力和活性。
出于盡量突顯神經(jīng)調(diào)節(jié)作用的目的，必須優(yōu)選本發(fā)明的寡聚體B。就此而言，也優(yōu)選這些寡聚體的衍生物，尤其強調(diào)優(yōu)選基于N末端截短的Aβ(1-42)蛋白質(zhì)的寡聚體。
出于工藝流程的原因，可以以組合物的形式將寡聚體A和寡聚體B作為混合物生產(chǎn)，其中除了寡聚體，還含有小部分的其他多肽，特別是單體淀粉樣β(1-42)蛋白，以及適當時聚集的淀粉樣β(1-42)蛋白的更高分子量形式。這種組合物也是本發(fā)明的主題，特別以本發(fā)明的寡聚體的比例區(qū)別，基于從淀粉樣β(1-42)蛋白衍生的蛋白質(zhì)總量，至少為重量的70％、優(yōu)選至少為90％重量、尤其是至少為95％。在寡聚體A的制備中，寡聚體A2(SDS凝膠中20kDa條帶)的比例至少為重量的50％，優(yōu)選為至少70％，尤其是至少為85％。在寡聚體B的制備中，寡聚體B1和B2(SDS凝膠中38kDa和48kDa條帶)的比例至少為重量的60％，優(yōu)選為至少75％，尤其是至少為90％。
可以衍生本發(fā)明的寡聚體。這類衍生的目的可以是，例如，調(diào)節(jié)所述寡聚體的物理化學(xué)性質(zhì)(尤其是關(guān)于生物利用率)、提供具有檢測標記的寡聚體或固定所述寡聚體，例如，可以將其偶聯(lián)到支持物上。標記和固定對于診斷性應(yīng)用尤其重要。
技術(shù)人員熟知蛋白質(zhì)-生物化學(xué)領(lǐng)域常用的適當標記。這些包括熒光標記(例如特定的熒光蛋白和四甲基若丹明衍生物)、發(fā)光標記、顯色標記、放射標記和磁性標記以及具有互補結(jié)合配偶體親和力的標記，例如生物素和鏈霉親和素衍生物。
關(guān)于表觀分子量，必須考慮到，與未衍生、但是聚集數(shù)相同的寡聚體相比，寡聚體衍生物具有可能增加的表觀分子量。因此，例如，基于在SDS凝膠中具有38kDa分子量的Aβ(1-42)寡聚體B1的生物素衍生物，具有42dDa的分子量。
根據(jù)本發(fā)明的特定實施方案，寡聚體是交聯(lián)的。合適的交聯(lián)劑為技術(shù)人員所公知，并且通常為雙功能試劑，例如甲醛、戊二醛、辛二酸二琥珀酰亞胺酯、Dithiobis(玻珀酰亞胺丙酸酯)、二琥珀酰亞胺酒石酸酯、雙磺基琥珀酰亞烷酒石酸酯、二甲基、二甲基pimelidate、二甲基suberimidate、二甲基-3，3′-dithiobispropionimidate、N-γ-maleinimidobutyloxy琥珀酰亞胺酯、琥珀酰亞胺-4(N-maleinimido甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸酯、N-琥珀酰亞胺-(4-碘乙酰)aminobenzoat以及N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶)丙酰酯。
這類交聯(lián)的寡聚體具有的優(yōu)點是穩(wěn)定，而且其寡聚化通常不再可逆。它們因此特別適用于診斷性檢驗系統(tǒng)或作為生產(chǎn)寡聚體特異性抗體的免疫原。
本發(fā)明的寡聚體的衍生物也包括淀粉樣β(1-42)蛋白片段的寡聚體。優(yōu)選通過天然存在的蛋白酶作用獲得的那些片段。與淀粉樣β(1-42)蛋白相比，在生理緩沖液中非變性條件下通過蛋白質(zhì)水解獲得的片段特別地增加了蛋白質(zhì)水解穩(wěn)定性。優(yōu)選通過內(nèi)肽酶作用獲得的片段。根據(jù)本發(fā)明的特定實施方案，所述片段可以通過胰蛋白酶、糜蛋白酶、嗜熱茵蛋白酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶或蛋白內(nèi)切蛋白酶GluC的作用獲得。根據(jù)另一方面，優(yōu)選其本發(fā)明寡聚體通過神經(jīng)調(diào)節(jié)作用區(qū)分的片段。對于此方面的進一步說明，參考本發(fā)明淀粉樣β(1-42)蛋白寡聚體的神經(jīng)調(diào)節(jié)作用的相關(guān)注釋。
從結(jié)構(gòu)上，優(yōu)選片段特別在于它們是通過去除淀粉樣β(1-42)蛋白N末端序列而衍生的特征。根據(jù)一方面，該N末端序列可以是具有淀粉樣β(1-42)蛋白N末端序列的上至23個、優(yōu)選具有上至21個、特別是具有上至19個氨基酸的片段。因此，根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選序列包含相鄰氨基酸24至42、優(yōu)選22至42、特別是20至42個連續(xù)氨基酸的Aβ(1-42)蛋白質(zhì)片段。根據(jù)另一方面，將要去除的N末端序列可以是具有至少7個、優(yōu)選具有至少9個、特別是具有至少11個Aβ(1-42)蛋白質(zhì)N末端序列氨基酸的序列。因此，根據(jù)本發(fā)明，特別優(yōu)選N末端截短了7至23個、優(yōu)選9至21個、特別是11至19個氨基酸的淀粉樣β(1-42)蛋白的片段。這些片段對應(yīng)于式Aβ(x-42)，其中x為8至24，優(yōu)選10至22，特別是12至20。根據(jù)本發(fā)明，Aβ(x-42)片段因此優(yōu)選自下列片段Aβ(8-42)、Aβ(9-42)、Aβ(10-42)、Aβ(11-42)、Aβ(12-42)、Aβ(13-42)、Aβ(14-42)、Aβ(15-42)、Aβ(16-42)、Aβ(17-42)、Aβ(18-42)、Aβ(1-42)、Aβ(20-42)、Aβ(21-42)、Aβ(22-42)、Aβ(23-42)和Aβ(24-42)。特殊的片段是通過嗜熱菌蛋白酶作用獲得的淀粉樣蛋白質(zhì)β(20-42)片段和通過GluC內(nèi)切蛋白酶作用獲得的淀粉樣蛋白質(zhì)β(12-42)片段。
本發(fā)明的衍生物還有來自具有1個或2個額外C末端氨基酸的淀粉樣蛋白質(zhì)β(12-42)的那些形式。其實施例因此包括Aβ(1-43)蛋白質(zhì)的寡聚體、或其對應(yīng)于上述內(nèi)容的衍生物。
制備寡聚體的發(fā)明方法可以基本包括三個步驟。其第一步是任選但是有利的，第二步是寡聚體A和B的制備絕對需要的，第三步起到制備本發(fā)明的寡聚體B的作用。
步驟1涉及蛋白質(zhì)的解折疊。出于此目的，可以允許例如六氟異丙醇(HFIP)這類氫鍵斷裂試劑作用于蛋白質(zhì)。當作用溫度為約20至50℃、特別是約35至40℃時，數(shù)分鐘的作用時間(例如約10至60分鐘)足以。隨后，于易于與水性緩沖液混合的適宜有機溶劑(例如二甲亞砜(DMSO))中溶解蒸發(fā)干燥的殘余物(優(yōu)選以濃縮形式)，產(chǎn)生至少部分解折疊的蛋白質(zhì)懸浮液。如果需要，儲備的懸浮液可以于低溫(例如在約-20℃)臨時貯存。
上述步驟1的備選方案是，可以在弱酸性、優(yōu)選水溶液中溶解蛋白質(zhì)，例如約10mM的HCl水溶液。通常孵育數(shù)分鐘后，經(jīng)離心去除不溶性組分。于10000g數(shù)分鐘為宜。優(yōu)選于室溫(即在20至30℃范圍內(nèi)的溫度)實施這些方法步驟。離心后獲得的上清液含有淀粉樣β(1-42)蛋白，并可以于低溫(例如在約-20℃)臨時貯存。
步驟2涉及產(chǎn)生寡聚體A的蛋白質(zhì)寡聚化。出于此目的，任選地允許去垢劑作用于至少部分解折疊的蛋白質(zhì)，直至產(chǎn)生足夠的寡聚體A。
優(yōu)選使用離子去垢劑，特別是陰離子去垢劑。
根據(jù)具體的實施方案，使用式(I)R-X的去垢劑，其中R基為具有6至20個、優(yōu)選10至14個碳原子的未分支或分支烷基，或具有6至20個、優(yōu)選10至14個碳原子的未分支或分支鏈烯基，X基為酸性基團或其鹽，X優(yōu)選自-COO-M+、-SO3-M+，特別是-OSO3-M+，M+是氫陽離子、或者無機或有機陽離子，優(yōu)選自堿性金屬和堿土金屬陽離子以及銨陽離子。
具有式(I)的去垢劑是有利的，其中R是未分支烷基，必須特別提及的是1-烷基。優(yōu)選十二烷基磺酸鈉(SDS)。也可以有利地使用月桂酸和油酸。去垢劑十二烷酰肌氨酸的鈉鹽(也稱為肌氨酰NL-30或Gardol)也格外有利。
去垢劑作用時間尤其依賴于進行寡聚化的蛋白質(zhì)是否解折疊，如果是，還有解折疊的程度。根據(jù)步驟1，如果預(yù)先以氫鍵斷裂試劑(即，特別是以六氟異丙醇)處理蛋白質(zhì)，當作用溫度約為20至50℃、特別是約為35至40℃時，數(shù)小時范圍內(nèi)的作用時間是足夠的，有利地為約1至20、特別是約2至10小時的作用時間。如果以較少解折疊或基本沒有解折疊的蛋白質(zhì)開始，以相應(yīng)較長的作用時間為宜。如果淀粉樣β(1-42)蛋白經(jīng)過預(yù)處理，例如，根據(jù)上文指出的步驟1的備選方案，或者將所述蛋白質(zhì)直接引入步驟2，當作用溫度約為20至50℃、特別是約為35至40℃時，約5至30小時、特別是約10至20小時范圍內(nèi)的作用時間足以。孵育后，宜通過離心去除不溶性組分。于10000g數(shù)分鐘為宜。
所選擇的去垢劑濃度取決于所使用的去垢劑。如果使用SDS，濃度0.01至1％、優(yōu)選0.05至0.5％比重的范圍，例如約質(zhì)量0.2％的比重，經(jīng)證明是有利的。如果使用月桂酸或油酸，略高的濃度是有利的，例如，在0.05至2％、優(yōu)選0.1至0.5％比重的范圍，例如約0.5％的比重。
去垢劑作用應(yīng)在接近于生理范圍的鹽濃度下發(fā)生。因此，尤其以50至500mM、優(yōu)選100至200mM范圍內(nèi)、特別是140mM的NaCl濃度為宜。
產(chǎn)生的含有寡聚體A的溶液，即特別是含有寡聚體A1和/或A2的溶液，可以于低溫(例如在約-20℃)臨時貯存。該溶液可以用于例如本發(fā)明的用途或進一步的反應(yīng)以產(chǎn)生寡聚體B、或在第一步之后的進一步處理或純化步驟，所述步驟具體實現(xiàn)了至少一種本發(fā)明的寡聚體A的進一步濃縮。具體地，通過色譜方法，可以從存在于溶液中的其他蛋白質(zhì)組分(尤其是來自淀粉樣β(1-42)蛋白的那些組合)取出寡聚體。特別適用于此目的的是親和色譜方法，該方法可以使用例如特異性抗體，即也特別為本發(fā)明的寡聚體特異性抗體。
步驟3涉及產(chǎn)生寡聚體B的寡聚化。優(yōu)選地，選擇含有寡聚體A的組合物作為這個步驟的反應(yīng)物。在此方面，根據(jù)本發(fā)明，寡聚體A是制備寡聚體B的重要中間物。如果該組合物來自步驟2，其通常含有去垢劑以及生理范圍的鹽濃度。宜降低去垢劑的作用和鹽濃度。這可以通過降低去垢劑和鹽的濃度而解決，例如通過稀釋，宜使用水或低鹽濃度緩沖液，例如Tris-HCl，pH7.3。在約2至10范圍內(nèi)、有利地在3至8范圍內(nèi)、特別是約為4的稀釋因子經(jīng)證明為適宜的。也可以添加中和所述去垢劑作用的物質(zhì)實現(xiàn)去垢劑作用的降低。這些物質(zhì)的實例包括能夠絡(luò)合去垢劑的物質(zhì)，如能夠在純化和提取措施過程中穩(wěn)定細胞的物質(zhì)，例如特定的EO/PO阻斷共聚物，特別是以商品名PluronicF 68的阻斷共聚物。烷氧基化、特別是乙氧基化烷基酚，例如TritonX系列的乙氧基化t-辛基酚(特別是TritonX100)、3-(3-(膽酰胺基丙基二甲氨基)-1-丙磺酸鹽(CHAPS)或烷氧基化、特別是乙氧基化山梨聚糖脂肪酯，例如Tween系列的那些，特別是Tween20，在特定的臨界微囊濃度附近或之上的濃度范圍內(nèi)。
隨后，孵育該溶液直至產(chǎn)生足夠的寡聚體B。當作用溫度約為20至50℃、特別是約為35至40℃時，數(shù)小時范圍內(nèi)、優(yōu)選約10至30小時范圍內(nèi)、特別是約15至25小時范圍內(nèi)的作用時間足以。然后可以濃縮溶液，并且可能的殘余物可以通過離心去除。這里也證明以10000g數(shù)分鐘為宜。離心后獲得的上清液含有寡聚體B。
產(chǎn)生的含有寡聚體B(即，特別是寡聚體B1和B2)的溶液，可于低溫(例如在約-80℃)臨時貯存。該溶液可以用于例如本發(fā)明的用途、或進一步處理或純化步驟可以跟隨第一步。對此，參考與寡聚體A有關(guān)的相應(yīng)測量的注釋。
出于基本完全去除用于制備寡聚體的去垢劑的目的，可以實施進一步處理或純化步驟。例如，可以首先從含有去垢劑的溶液沉淀寡聚體B、分離并重新溶解于不含去垢劑的介質(zhì)中。沉淀蛋白質(zhì)的措施為技術(shù)人員所熟知。根據(jù)本發(fā)明，添加水-甲醇中的乙酸經(jīng)證明是有利的。償未結(jié)合具體的機制，去垢劑或去垢劑的變種以及鹽濃度看似將蛋白質(zhì)置于確定的溶解形式，正如可以通過例如變性或天然凝膠電泳或凝膠滲透層析所檢測的，該形式與溶解于水性生理緩沖液中的蛋白質(zhì)起始形式明顯不同。這是令人驚訝的，由于去垢劑通常能夠去聚集，即，使亞基、蛋白質(zhì)聚集體去組裝，根據(jù)本發(fā)明，從傾向于聚集的單體開始獲得了確定的寡聚體。
通過實施本發(fā)明的上述方法，在已經(jīng)經(jīng)過適當衍化的淀粉樣β(1-42)蛋白上有利地制備了本發(fā)明的寡聚體衍生物。另外，衍生寡聚體也是可能的，但是這不應(yīng)改變所述寡聚體的結(jié)構(gòu)。合適的蛋白質(zhì)化學(xué)手段為技術(shù)人員所公知。
可以用本身已知的方式實施本發(fā)明的寡聚體或其衍生物的交聯(lián)。例如，如果使用戊二醛作為交聯(lián)劑，可以使用戊二醛溶液處理從本發(fā)明方法步驟2或3產(chǎn)生的溶液。于室溫數(shù)小時后，寡聚體已與戊二醛反應(yīng)。該反應(yīng)然后可以用本身已知的方式，通過將過量的戊二醛與試劑反應(yīng)而被終止，所述試劑普遍已知用于此目的，例如氨基乙醇。取決于本發(fā)明的寡聚體A或B是否交聯(lián)，獲得分別稱為A-CL和B-CL的本發(fā)明交聯(lián)寡聚體溶液。
特別是對于任選交聯(lián)的寡聚體B或其衍生物，在其合成之后，再次增加鹽濃度而不損害所述寡聚體的穩(wěn)定性是可能的。這對于該寡聚體的應(yīng)用是重要的，例如，在生理條件對應(yīng)用有利的情況下(細胞應(yīng)用、體內(nèi)應(yīng)用)。
原則上，通過寡聚化從相應(yīng)的單體開始，或者通過蛋白質(zhì)水解從所述淀粉樣β(1-42)蛋白的寡聚體開始，都可以制備淀粉樣β(1-42)蛋白片段的寡聚體。因此，根據(jù)第二個方法的變體，可以使用蛋白酶處理由本發(fā)明的方法步驟2或3產(chǎn)生的溶液。當達到需要的蛋白質(zhì)水解程度時，以公知的方式失活蛋白酶。然后可以按照此處已經(jīng)說明的程序分離產(chǎn)生的寡聚體，如果需要，通過另外的處理和純化步驟進一步處理。
通過其均一性和穩(wěn)定性區(qū)分本發(fā)明的寡聚體以及包含它們的組合物。它們在生理介質(zhì)(例如生理鹽溶液)中是可溶的，并通過其稍微的球狀外觀而不同于纖維狀形式。它們具有的優(yōu)點是具有的空間結(jié)構(gòu)顯然不同于其他Aβ(1-42)形式，特別是單體、非毒性寡聚體、包含Aβ(1-42)的前體分子APP、原纖維和纖維。它們因此特別適于在體內(nèi)和體外產(chǎn)生特異性抗體，使例如特異性的自動免疫成為可能。就此而言，關(guān)鍵是僅僅將那些導(dǎo)致疾病的寡聚體用于免疫。其他形式的Aβ(1-42)例如單體分子或較小的寡聚體，在生物體中對于重要的信號功能可能是必需的。同樣，去除推定為對細胞襯里重要的纖維狀堆積物，可能損傷生物體。
以同樣的方法，使用本發(fā)明的同源性寡聚體或含有該寡聚體的組合物，可以實施可能的治療，例如被動免疫、寡聚體形式的去穩(wěn)定劑的使用以及受體(部分)激動劑和拮抗劑的使用。因此，同源性寡聚體制備也使用于被動免疫的多克隆或單克隆抗體的特異性生產(chǎn)成為可能。使用本發(fā)明的寡聚體及含有這些寡聚體的組合物，也可能發(fā)現(xiàn)與疾病有關(guān)并受該寡聚形式影響的受體分子或信號分子。
由于其涉及淀粉樣β蛋白質(zhì)相關(guān)的生理過程，本發(fā)明的寡聚體具有診斷性和治療性價值。因此，本發(fā)明涉及本發(fā)明的寡聚體及其衍生物(任選以相應(yīng)組合物的形式)在診斷性體外和體內(nèi)檢測方法中的用途。
淀粉樣β蛋白質(zhì)相關(guān)的生理過程包括與淀粉樣蛋白質(zhì)沉積(淀粉樣蛋白病)有關(guān)的那些。這些包括那些導(dǎo)致神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)改變，并且對例如阿爾茨海默病和唐氏綜合征而言重要的那些過程，以及影響其他組織、諸如淀粉樣微血管病變(例如嗜剛果紅淀粉樣蛋白血管病(CAA))的那些過程。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的寡聚體及其衍生物(任選以相應(yīng)組合物的形式)在產(chǎn)生寡聚體特異性抗體中的用途。
這里，以Aβ(1-42)蛋白質(zhì)的截短形式為基礎(chǔ)的發(fā)明性寡聚體具有特別的重要性由于缺失N末端，它們可以產(chǎn)生顯然比Aβ(1-42)蛋白質(zhì)更具選擇性的免疫反應(yīng)。盡管經(jīng)典Aβ(1-42)蛋白質(zhì)中的高免疫原性N末端顯著地產(chǎn)生對該分子此區(qū)域的特異性抗體，例如根據(jù)制造商信息針對N末端(6E10Aβ(1-17)以及BAM-10 Aβ(1-12))的抗體6E10(F.Signet)和BAM-10(Sigma，St.Louis)，可以使用本發(fā)明以截短的Aβ(1-42)形式為基礎(chǔ)的寡聚體獲得的抗體識別寡聚體特異性區(qū)域，從而達到與其他Aβ(1-42)形式相當?shù)倪x擇性。由于接種后產(chǎn)生的更強選擇性的免疫應(yīng)答(與APP、單體形式、原纖維、纖維、斑點(plaque)相比)也必然伴有更少的副反應(yīng)(例如腦出血、原位單體形式的生理神經(jīng)營養(yǎng)活性的損傷)，這個優(yōu)點尤其可以利用到主動接種當中。特別地，用于被動免疫(即基因治療)的單克隆抗體的更高的生產(chǎn)和選擇性也是可能的。
此用途的一個方面是產(chǎn)生治療框架內(nèi)寡聚體特異性抗體。
本發(fā)明因此還涉及本發(fā)明的寡聚體及其衍生物在治療領(lǐng)域中、特別是作為疫苗的用途。
這樣的疫苗通常為藥物組合物，包括至少一種本發(fā)明的寡聚體和/或至少一種本發(fā)明的寡聚體的衍生物。為此目的，特別可以使用本發(fā)明的任何組合物，其包括兩個或多個寡聚體，或使用不同組合物的組合。因此，特別可以使用寡聚體B，即B1和B2，或其衍生物進行接種。該組合物可以進一步包括生理上適宜的載體，以及任選地還含有賦形劑，例如免疫刺激物。
盡管原則上可以選擇任何適宜的載體，載體的類型通常取決于給藥途徑。因此本發(fā)明的疫苗可以特別地以適用于腸胃外(例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)和皮下)給藥途徑的形式進行配制。在這些情況下，載體優(yōu)選包括水、鹽、醇、脂肪、臘和/或緩沖液。
本發(fā)明的疫苗可以使用多種免疫刺激物中的任一種。例如可以包含佐劑。大多數(shù)佐劑含有保護抗原免于迅速代謝的物質(zhì)，例如氫氧化鋁或礦物油、以及來源于脂質(zhì)A、百日咳球桿菌(Bordadella pertussis)或結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的蛋白質(zhì)。適宜的佐劑通?？梢陨虡I(yè)獲得，例如完全或不完全弗氏佐劑、AS-2、鋁鹽，例如氫氧化鋁(適當時以凝膠形式)或磷酸鋁、鈣鹽、鐵鹽或鋅鹽、酰化酪氨酸的不溶性懸浮液、?；?、陽離子或陰離子衍生的多聚糖、聚磷腈、可生物降解的微球體、單磷酰脂質(zhì)A。細胞因子例如GM-CSF或白介素2、7或12同樣可以用作佐劑。
本發(fā)明進一步涉及生產(chǎn)抗體的方法，該方法包括i)以至少一種本發(fā)明的寡聚體、其衍生物或組合物免疫宿主；并ii)獲得應(yīng)答該免疫產(chǎn)生的含有抗體的宿主血清。
根據(jù)生產(chǎn)抗體方法的特定實施方案，給以免疫混合物進行免疫，免疫混合物包括本發(fā)明的多種寡聚體或寡聚體的衍生物的混合物。具體地，在該方法過程中，給以寡聚體組分不同的多個免疫混合物尤其有利。
如果將要使用的寡聚體或寡聚體衍生物沒有或僅有弱的免疫原性，可以將其偶聯(lián)至載體而增加其免疫原性，優(yōu)選偶聯(lián)至載體蛋白質(zhì)，例如鑰孔槭血藍蛋白(KLH)、鱟蛛血藍蛋白(LPH)、牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)。許多公知用于此目的的可能的偶聯(lián)可供技術(shù)人員利用?？赡苡欣膶嵗桥c戊二醛反應(yīng)，例如，將寡聚體或寡聚體衍生物與適當?shù)碾幕螂幕旌衔镌谒蛩芤褐蟹跤?。該反?yīng)可以在環(huán)境溫度(即通常在室溫)下方便地進行。然而，降低或略升高溫度也可能有利。該反應(yīng)通常在幾小時內(nèi)產(chǎn)生所需的結(jié)果，例如，2小時的反應(yīng)時間在常用范圍內(nèi)。戊二醛濃度常在ppm至％范圍內(nèi)，宜從10ppm高至1％、優(yōu)選從10ppm至0.5％。反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化在技術(shù)人員技能內(nèi)，并應(yīng)考慮到寡聚體A和B或寡聚體衍生物在所選的反應(yīng)條件下穩(wěn)定。
優(yōu)選組合將要使用的成分而制備免疫混合物。孵育最初產(chǎn)生的組分混和物是有利的。這通常在環(huán)境溫度(即室溫)下方便地進行。然而，冷卻或略加熱該混和物可能有利。孵育期常從幾分鐘至數(shù)小時，1小時的孵育時間經(jīng)證明是有利的。
除了抗原，免疫混合物常含有額外的賦形劑，特別是常用于免疫的佐劑，例如弗氏佐劑。更特別地，將完全弗氏佐劑用于初次免疫，而以不完全弗氏佐劑進行任何額外的免疫。將抗原(免疫原)(優(yōu)選以上述組分混和物的形式)添加至賦形劑中制備免疫混合物，抗原通常被乳化。
適宜的宿主特別為嚙齒動物或兔。以免疫混合物注射這些或其他適宜的宿主，優(yōu)選皮下注射?？梢允褂妹庖邷y定測量抗體效價，例如競爭性使用羊抗宿主IgG綿羊抗血清和經(jīng)標記的寡聚體。因此可以在免疫末期確定特定的宿主是否適于產(chǎn)生抗體。例如，如果進行4次免疫，可以在第三次免疫后測定抗體效價，然后從具有足夠抗體效價的動物獲得抗體。
優(yōu)選在數(shù)周或數(shù)月的時期后從宿主采集血清而獲得產(chǎn)生的抗體。最后，將動物放血?？梢詮挠帽旧硪阎姆绞将@得的血液中獲得含有所需抗體的血清。如果需要，這樣獲得的全部血清可以由技術(shù)人員進一步純化，將存在于其中的抗體成分、特別是識別寡聚體的抗體濃縮。
根據(jù)本發(fā)明方法的特定實施方案，選擇至少一種血清抗體，該抗體特異性識別用作免疫原的寡聚體或其衍生物，或者在用作免疫原的組合物中存在的至少一種寡聚體或其衍生物。在本文中，特異性指抗體對免疫原比對其他物質(zhì)(特別是與相關(guān)蛋白質(zhì)、尤其是與單體淀粉樣β(1-42)蛋白、以及比本發(fā)明的寡聚體具有更高分子量的寡聚或多體淀粉樣β(1-42)蛋白聚集物相比)具有更高的結(jié)合親和力。也可以用此方式獲得寡聚體特異的單克隆抗體。然而，出于此目的，優(yōu)選從宿主脾組織摘除、并從由此獲得的脾淋巴細胞開始，以常用方式建立產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。
抗體生產(chǎn)詳述B淋巴細胞共含有由幾十億種不同抗體特異性組成的抗體所有組成成分，是哺乳動物免疫系統(tǒng)的一部分。對特定抗原的正常免疫應(yīng)答指從所述所有組成成分選擇一種或多種的該抗原特異性結(jié)合抗體。免疫應(yīng)答的成功至少部分建立在抗體特異性識別(以及最終消除)刺激性抗原并忽視所述抗體的環(huán)境中其他分子的能力。
特異性識別一個特定靶抗原的抗體的有效性導(dǎo)致單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展。目前標準化雜交瘤技術(shù)允許對目的抗原具有單獨特異性的抗體的產(chǎn)生。更近來，重組抗體技術(shù)，例如抗體文庫的體外篩選得到發(fā)展，這些技術(shù)也允許具有對目的抗原的單獨特異性的抗體的產(chǎn)生。
在本發(fā)明的方法中，允許目的抗原體內(nèi)或體外作用于抗體所有組成成分。
根據(jù)一個實施方案，以抗原體內(nèi)免疫動物而使抗原作用于所有組成成分。體內(nèi)途徑可以進一步包括從動物淋巴細胞建立大量雜交瘤，并選擇分泌與該抗體特異性結(jié)合的抗體的雜交瘤。將要免疫的動物可以是，例如小鼠、大鼠、兔、雞、Camelid或綿羊，或任何上述動物的轉(zhuǎn)基因版本；例如，具有人類免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因鼠，其在抗原刺激后產(chǎn)生人類抗體。其他可以被免疫的動物類型包括重度聯(lián)合免疫缺損(SCID)小鼠，其已用人類外周單核血細胞(嵌合hu-PBMC SCID小鼠)或用淋巴結(jié)細胞或其前體細胞重構(gòu)，以及以致死全身輻射處理，然后使用重度聯(lián)合免疫缺損(SCID)小鼠的骨髓瘤細胞抵抗輻射，并隨后移植人類功能淋巴細胞的小鼠(“Tremera”系統(tǒng))?？擅庖叩牧硪环N動物類型，是基因組中編碼目的抗原的內(nèi)源性基因經(jīng)例如同源重組而關(guān)閉(敲除)的動物(例如小鼠)，以致以抗原免疫后，所述動物將此抗原識別為外來物。對技術(shù)人員而言，此方法產(chǎn)生的多克隆或單克隆抗體，顯然以使用已知的篩選方法為特征并進行選擇，篩選方法包括(但是不限于)ELISA技術(shù)。
根據(jù)另一實施方案，以抗原篩選重組抗體文庫，使抗原體外作用于抗體所有組成成分?？梢栽诶缡梢痼w表面或在酵母細胞表面或在細菌表面表達重組抗體文庫。在不同的實施方案中，重組抗體文庫是例如scFv文庫或Fab文庫。根據(jù)另一實施方案，以RNA-蛋白質(zhì)融合物表達抗體文庫。
生產(chǎn)本發(fā)明抗體的另一途徑，包括組合體內(nèi)和體外途徑。例如，以抗原體內(nèi)免疫動物使所述抗原作用于抗體所有組成成分，然后以該抗原體外篩選從該動物淋巴細胞制備的重組抗體文庫或單結(jié)構(gòu)域抗原文庫(例如含有重和/或輕鏈)。根據(jù)另一條途徑，用抗原體內(nèi)免疫動物，使所述抗原作用于抗體所有組成成分，然后把該動物淋巴細胞產(chǎn)生的重組抗體文庫或單結(jié)構(gòu)域文庫進行親和力成熟。根據(jù)另一條途徑，用抗原體內(nèi)免疫動物，使所述抗原作用于抗體所有組成成分，然后選擇分泌目的抗體的單個抗體產(chǎn)生細胞，并從所選細胞cDNA獲得重鏈和輕鏈可變區(qū)(例如通過PCR)，在哺乳動物宿主細胞內(nèi)體外表達重鏈和輕鏈可變區(qū)(稱此為選擇淋巴細胞抗體方法或SLAM)，從而可進一步選擇并操縱所選的抗體基因序列。另外，可以通過在宿主細胞內(nèi)表達重鏈和輕鏈的抗體基因、并選擇那些分泌具有所需結(jié)合親和力的抗體的哺乳動物細胞，通過表達克隆選擇單克隆抗體。
因此，本發(fā)明一方面為篩選和反篩選提供明確的抗原。因此，根據(jù)本發(fā)明，可以選擇那些多克隆和單克隆抗體，所述抗體結(jié)合本發(fā)明的寡聚體或其衍生物，而非其他形式的Aβ(1-42)蛋白質(zhì)、APP、淀粉樣纖維或淀粉樣斑點以及大量其他無關(guān)抗原和組織。
技術(shù)人員充分了解，抗體選擇以充分確定的抗原為基礎(chǔ)。反之，不充分確定的抗原在使用時并不具有足夠的選擇性。簡言之，體外作用和選擇與親和層析相似，使用的所需抗原的“配體”已除去以不充分的親和力結(jié)合抗原的那些。因此，在具有其他抗體的巨大集合體中，所需抗體的富集程度與抗原質(zhì)量直接相關(guān)。令人驚訝的是，本發(fā)明的寡聚體及其衍生物是可用于濃縮合適的相關(guān)選擇性抗體，并將其從識別Aβ(1-42)蛋白質(zhì)相關(guān)的其他形式及其他無關(guān)抗原的抗體有效取出的抗原。
本發(fā)明的生產(chǎn)抗體的方法可用于生產(chǎn)多種類型的抗體。這些基本包括人類抗體、嵌合抗體、人源化抗體和CDR移植抗體及其抗原結(jié)合部分。
本發(fā)明生產(chǎn)抗體的方法說明如下。在此指出體內(nèi)途徑、體外途徑或二者的組合之間的區(qū)別。
體內(nèi)途徑從體內(nèi)產(chǎn)生的抗體生產(chǎn)細胞開始，可以通過標準技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體，例如最初由Kohler和Milstein(1975，Nature 256495-497)(也見Brown等(1981)J.Immunol 127539-46；Brown等(1980)J Biol Chem 2554980-83；Yeh等(1976)PNAS 762927-31；以及Yeh等(1982)Int.J.Cancer29269-75)描述的雜交瘤技術(shù)。生產(chǎn)單克隆抗體雜交瘤的技術(shù)廣為人知(一般見R.H.Kenneth，《Monoclonal AntibodiesA New Dimension InBiological Analyses》，Plenum Publishing Corp.，New York，New York(1980)；E.A.Lerner(1981)Yale J.Biol.Med.，54387-402；M.L.Gefter等，(1977)Somatic Cell Genet.，3231-36)。簡而言之，將不死細胞系(一般為骨髓瘤)與哺乳動物淋巴細胞(一般為脾細胞或淋巴結(jié)細胞或外周血淋巴細胞)融合，其中哺乳動物經(jīng)本發(fā)明的寡聚體或其衍生物免疫；篩選得到的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液，以鑒定產(chǎn)生對本發(fā)明的寡聚體或其衍生物具有特異性的單克隆抗體的雜交瘤。許多廣為人知的融合淋巴細胞和不死細胞系的方法中的任一種都可應(yīng)用于此目的(也見G.Galfre等，(1977)Nature 266550-52；Gefter等，Somatic Cell Genet.，引用如上；Lerner，Yale J.Biol.Med.，引用如上；Kenneth，《(Monoclonal Antibodies》，引用如上)。此外，技術(shù)人員將理解，這類方法有許多改變，這些改變同樣有用。一般，不死細胞系(例如骨髓瘤細胞系)來自與淋巴細胞相同的哺乳動物物種。例如，可以將以本發(fā)明的免疫原制品免疫的小鼠淋巴細胞與小鼠不死細胞系融合，建立小鼠雜交瘤。優(yōu)選的不死細胞系是小鼠骨髓瘤細胞系，該細胞系對含有次黃嘌來呤、氨基喋呤和胸苷的培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)敏感。大量骨髓瘤細胞系中的任何一種可以標準(standardwise)地用作融合配偶體，例如P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤系。這些骨髓瘤細胞系可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD獲得。通常，使用聚乙二醇(PEG)將HAT敏感的小鼠骨髓瘤細胞系與小鼠脾細胞融合，然后使用HAT培養(yǎng)基選擇融合產(chǎn)生的雜交瘤細胞，從而殺死非融合的、以及非生產(chǎn)性融合的骨髓瘤細胞(非融合的脾細胞因其未經(jīng)轉(zhuǎn)化而在數(shù)天后死亡)。通過篩選雜交瘤培養(yǎng)物上清液中特異性識別本發(fā)明的寡聚體及其衍生物的單克隆抗體，鑒定產(chǎn)生這類抗體的雜交瘤細胞，例如，使用標準ELISA測定法選擇那些可以特異性結(jié)合本發(fā)明的寡聚體或其衍生物的抗體。
根據(jù)需要的抗體類型，多種宿主動物可以用于體內(nèi)免疫，可以使用自身表達目的抗原的內(nèi)源性版本的宿主。另外，可以使用造成目的抗原的內(nèi)源性版本缺陷的宿主。例如，通過相應(yīng)內(nèi)源性基因的同源重組在特定內(nèi)源性蛋白質(zhì)造成缺陷的小鼠(即敲除小鼠)已證實產(chǎn)生針對用來免疫的蛋白質(zhì)的體液應(yīng)答，從而能夠用于對該蛋白質(zhì)的高親和力單克隆抗體的生產(chǎn)(見，例如Roes，J.等，(1995)J.Immunol.Methods183231-237；Lunn，M.P.等，(2000)J.Neurochem．75404-412)。
對于生產(chǎn)抗本發(fā)明的寡聚體或其衍生物的非人類抗體，許多非人類哺乳動物細胞是抗體生產(chǎn)的適宜宿主。盡管對于雜交瘤的生產(chǎn)優(yōu)選小鼠，適且的宿主包括小鼠、大鼠、小雞、Camelid、兔和山羊(及其敲除版本)。另外，表達人類抗體所有組成成分的非人類宿主動物可用于基本上生產(chǎn)對人類抗原具有雙特異性的人類抗體。這種非人類動物包括含有人類免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)(嵌合hu-PBMC SCID小鼠)以及在下文中更詳細說明的人/小鼠輻射嵌合體。
根據(jù)一個實施方案，經(jīng)本發(fā)明的寡聚體及其衍生物免疫的動物是非人的哺乳動物(優(yōu)選小鼠)，所述動物為人類免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)基因動物，以致該非人類哺乳動物在抗原刺激后產(chǎn)生人類抗體。一般，將具有人類生殖細胞系構(gòu)型的重鏈和輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因引入內(nèi)源性重鏈和輕鏈基因座被失活的動物。如果以抗原(例如以人類抗原)刺激這類動物，產(chǎn)生來自人類免疫球蛋白序列的抗體?？梢酝ㄟ^標準雜交瘤技術(shù)從這類動物的淋巴細胞制造人類單克隆抗體。關(guān)于具有人類免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠及其在人類抗體生產(chǎn)中的用途的進一步描述，見例如US 5,939,598、WO 96/33735、WO 96/34096、WO 98/24893和WO 99/53049(Abgenix Inc.)，以及US5,545,806、US 5,569,825、US 5,625,126、US 5,633,425、US 5,661,016、US5,770,429、US 5,814,318、US 5,877,397以及WO 99/45962(Genpharm Inc.)；也見MacQuitty，J.J.和Kay，R.M.(1992)Science2571188；Taylor，L.D.等，(1992)Nucleic Acids Res.206287-6295；Lonberg，N.等，(1994)Nature368856-859；Lonberg；N.和Huszar，D.(1995)Int Rev.Immunol.1365-93；Harding，F(xiàn).A.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764536-546；Fishwild，D.M.等，(1996)Nature Biotechnology14845-851；Mendez，M.J.等，(1997)Nature Genetics15146-156；Green，L.L.和Jakobovits，A.(1998)J.Exp.Med.188483-495；Green，L.L.(1999)J.Immunol.Methods23111-23；Yang，X.D.等，(1999)J.Leukoc.Biol.66401-410；Gallo，M.L.等，(2000)Eur.J.Immunol.30534-540。
根據(jù)另一實施方案，經(jīng)本發(fā)明的寡聚體及其衍生物免疫的動物可以是重度聯(lián)合免疫缺損小鼠，該小鼠以人類外周單個核血細胞或淋巴結(jié)細胞或其前體重建。已證實，這類被稱為嵌合hu-PBMC SCID小鼠的小鼠在抗原刺激下產(chǎn)生人類免疫球蛋白應(yīng)答。關(guān)于這些小鼠及其在生產(chǎn)抗體中的用途的進一步描述，見例如Leader，K.A.等，(1992)Immunology76229-234Bombil，F(xiàn).等，(1996)Immunobiol.195360-375；Murphy，W.J.等，(1996)Semin.Immunol.8233-241；Herz，U.等，(1997)Int.Arch.Allergy Immunol.113150-152；Albert，S.E.等，(1997)J.Immunol.1591393-1403；Nguyen，H.等，(1997)Microbiol.Immunol.41901-907；Arai，K.等，(1998)J.Immunol.Methods21779-85；Yoshinari，K.和Arai，K.(1998)Hybridoma1741-45；Hutchins，W.A.等，(1999)Hybridoma18121-129；Murphy，W.J.等，(1999)Clin.Immunol.9022-27；Smithson，S.L.等，(1999)Mol.Immunol.36113-124；Chamat，S.等，(1999)J.Infect.Diseases180268-277；以及Heard，C.等，(1999)Molec.Med.535-45。
根據(jù)另一實施方案，以本發(fā)明的寡聚體及其衍生物免疫的動物是以致死全身輻射處理，然后以重度聯(lián)合免疫缺損小鼠(SCID)小鼠骨髓細胞抵抗輻射，繼之移植人類功能性淋巴細胞的小鼠。經(jīng)目的抗原免疫所述小鼠，使用這類被稱為Trimera系統(tǒng)的嵌合體通過標準雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)人類單克隆抗體。關(guān)于這些小鼠及其在生產(chǎn)抗體中的用途的進一步描述，見例如Eren，R.等，(1998)Immunology93154-161；Reisner，Y和Dagan，S.(1998)Trends Biotechnol.16242-246；Ilan，E.等，(1999)Hepatology29553-562；以及Bocher，W.O.等，(1999)Immunology96634-641。
體外途徑作為經(jīng)免疫和選擇而產(chǎn)生本發(fā)明抗體的備選方案，可以用本發(fā)明的寡聚體及其衍生物篩選重組免疫球蛋白文庫，從而分離與寡聚體及其衍生物特異性結(jié)合的免疫球蛋白文庫成員由此鑒定和分離本發(fā)明抗體。生產(chǎn)和篩選展示文庫的試劑盒可商業(yè)獲得(例如Pharmacia Recombinant PhageAntibody System，目錄號24-9400-01；以及Stratagene SurfZAPPhageDisplay Kit，目錄號240612)。在許多實施方案中，展示文庫是scFv文庫或Fab文庫。篩選重組抗體文庫的噬菌體展示技術(shù)已被充分描述。用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫的方法和化合物的特別有利的實例，可見于例如McCafferty等，WO 92/01047、US 5，和EP 589 877(具體描述了scFv展示)；Ladner等，US 5,223,409、US 5,403,484、US 5,571,698、US 5,837,500和EP 436 597(例如，描述pIII融合)；Dower等，WO 91/17271、US 5,427,908、US 5,580,717和EP 589 877(具體描述Fab展示)；Winter等，International Publication WO 92/20791和EP 368,684(具體描述免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域序列的克隆)；Griffiths等，US 5,885,793和EP 589 887(具體描述使用重組文庫分離針對人類抗原的人抗體)；Garrard等，WO92/09690(具體描述噬菌體表達技術(shù))；Knappik等，WO 97/08320(描述人類重組抗體文庫HuCal)；Salfeld等，WO 97/29131(描述針對人類抗原(人腫瘤壞死因子)的重組人抗體的產(chǎn)生，以及重組抗體的體外親和力成熟)以及Salfeld等，U.S.Provisional Application No.60/126,603和以此為基礎(chǔ)的專利申請(也描述了針對人類抗原(人白介素12)重組人類抗體的產(chǎn)生，以及重組抗體的體外親和力成熟)。
關(guān)于重組抗體文庫篩選的進一步描述，可見于科學(xué)出版物中，例如Fuchs等，(1991)Bio/Technology91370-1372；Hay等，(1992)Hum AntibodHybridomas381-85；Huse等，(1989)Science2461275-1281；Griffiths等，(1993)EMBO J12725-734；Hawkins等，(1992)J Mol Biol226889-896；Clarkson等，(1991)Nature352624-628；Gram等，(1992)PNAS893576-3580；Garrad等，(1991)Bio/Technology91373-1377；Hoogenboom等，(1991)Nuc Acid Res194133-4137；Barbas等，(1991)PNAS887978-7982；McCafferty等，Nature(1990)348552-554；以及Knappik等，(2000)J.Mol.Biol.29657-86。
作為使用噬菌體展示文庫系統(tǒng)的替代方案，可以在酵母細胞或細菌細胞表面表達重組抗體文庫。WO 99/36569描述了在酵母細胞表面表達的文庫的制備和篩選方法。WO 98/49286更詳細地描述了在細菌表面表達的文庫的制備和篩選方法。
一旦組合文庫的目標抗體得到鑒定，就使用標準分子生物學(xué)技術(shù)分離編碼該抗體輕鏈和重鏈的DNA，例如通過對展示包裝(例如噬菌體)的DNA PCR擴增，所述展示包裝已在文庫的篩選中被分離。可用于制備PCR引物的抗體輕鏈和重鏈基因的核苷酸序列為技術(shù)人員所公知。在例如Kabat，E.A.，等，(1991)《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication No.91-3242以及人類生殖細胞系VBASE序列數(shù)據(jù)庫中描述了許多這樣的序列。
可以通過在宿主細胞內(nèi)重組表達免疫球蛋白輕鏈和重鏈基因，產(chǎn)生本發(fā)明的抗體或抗體部分。為了重組表達抗體，以一個或多個重組攜帶編碼該抗體免疫球蛋白輕鏈和重鏈的DNA片段的表達載體轉(zhuǎn)染宿主細胞，從而在宿主細胞內(nèi)表達輕鏈和重鏈，并優(yōu)選將其分泌至培養(yǎng)宿主細胞的培養(yǎng)基中。可從此培養(yǎng)基中分離抗體。使用標準重組DNA方法以獲得重鏈和輕鏈抗體基因。在例如Sambrook、Fritsch及Maniatis(編)，《MolecularCloning ；A Laboratory Manual》，第二版，ColdSpring Harbor，N.Y.，(1989)；Ausubel，E.M.等(編)《Current Protocols in Molecular Biology》，Greene Publishing Associates，(1989)以及Boss等的US 4,816,397中描述了這類方法。
一旦獲得編碼目的抗體VH和VL片段的DNA片段，就可以使用標準重組DNA技術(shù)對該DNA片段進行進一步操作，例如為了將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)變?yōu)榭贵w鏈全長基因、Fab片段基因或scFv基因。這些操作包括將編碼VL或VH的DNA片段與編碼另一蛋白質(zhì)(例如抗體怛定區(qū)域柔性接頭)的另一DNA片段有效連接。術(shù)語“有效連接的”在此理解為指兩個DNA片段以某種方式彼此連接，在這種方式中，于框內(nèi)保持了兩個DNA片段編碼的氨基酸序列。
將編碼VH區(qū)的DNA與編碼重鏈恒定區(qū)(CH1、CH2及CH3)的另一個DNA分子有效連接，可以將分離的編碼VH區(qū)的DNA轉(zhuǎn)變?yōu)橹劓溔L基因。人類重鏈恒定區(qū)基因序列廣為人知(見例如Kabat，E.A.等，(1991)《Sequencesof Proteins of Immunological Interest》，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)，可以通過標準PCR擴增方法獲得跨越該區(qū)的DNA片段。重鏈恒定區(qū)可以是來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD的恒定區(qū)，優(yōu)選IgG1或IgG4恒定區(qū)。為了獲得重鏈Fab片段的基因，可以將編碼VH的DNA與僅編碼重鏈恒定區(qū)CH1的另一個DNA分子有效連接。
將編碼VL的DNA與編碼輕鏈恒定區(qū)CL的另一個DNA分子有效連接，可以將分離的編碼VL區(qū)的DNA轉(zhuǎn)變?yōu)檩p鏈全長基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恒定區(qū)基因序列廣為人知(見例如Kabat，E.A.等，(1991)《(Sequencesof Proteins of Immunological lnterest》，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)，可以通過標準PCR擴增方法獲得跨越該區(qū)的DNA片段。輕鏈恒定區(qū)可以是恒定κ或λ區(qū)，優(yōu)選恒定κ區(qū)。
為了產(chǎn)生scFv基因，可以將編碼VH和VL的DNA片段與編碼柔性接頭(例如氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一個片段有效連接，使VH和VL序列以連續(xù)的單鏈蛋白質(zhì)表達(見Bird等，(1988)Science242423-426；Huston等，(1988)Proc.Nail.Acad.Sci.USA855879-5883；McCafferty等，Nature(1990)348552-554)。
可以使用上述方法從單結(jié)構(gòu)域文庫分離對本發(fā)明的寡聚體或其衍生物具有特異性的單結(jié)構(gòu)域VH和VL。具有所需特異性的兩個VH單結(jié)構(gòu)域鏈(具有或不具有CH1)或兩個VL鏈、或一個VH和一個VL鏈的一對可用于從身體中去除本發(fā)明的寡聚體或其衍生物。
為了表達本發(fā)明的重組抗體或抗體部分，可以將編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA插入表達載體，以便將基因與轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列有效連接。本文中，術(shù)語“有效連接的”理解為指抗體基因以某種方式連接于載體內(nèi)，在這種方式中，載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列完成其調(diào)節(jié)該抗體基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的預(yù)期功能。
選擇表達載體和表達控制序列，以便與使用的宿主細胞兼容?？梢詫⒖贵w輕鏈基因與抗體重鏈基因插入到單獨的載體中，或?qū)蓚€基因插入到相同的表達載體中，這是通常的情況。使用標準方法將抗體基因插入表達載體中(例如抗體基因和載體上的互補限制性切割位點的連接，或者，若不存在限制性切割位點時的平末端連接)。輕鏈和重鏈序列插入前，表達載體可已經(jīng)攜帶抗體恒定區(qū)序列。例如，一條途徑是將VH和VL序列轉(zhuǎn)化為全長抗體基因，通過將其插入到已經(jīng)分別編碼重鏈和輕鏈恒定區(qū)的表達載體中，從而將VH片段和CH片段在載體內(nèi)有效連接，也將VL片段和CL片段在載體內(nèi)有效連接。另外，或作為備選，重組表達載體可以編碼便于抗體鏈從宿主細胞分泌的信號肽?？蓪⒃摽贵w鏈的基因克隆到載體中，從而將信號肽在框內(nèi)與抗體鏈基因N末端有效連接。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即非免疫球蛋白蛋白質(zhì)的信號肽)。除了抗體鏈基因，本發(fā)明的表達載體可以具有控制抗體鏈基因在宿主細胞內(nèi)表達的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”旨在包括控制抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的啟動子、增強子和其它表達控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。在例如Goeddel；《(Gene Expression TechnologyMethods In Enzymology 185》，AcademicPress，San Diego，CA(1990)中描述了這類調(diào)節(jié)序列。技術(shù)人員將理解，包括調(diào)節(jié)序列選擇在內(nèi)的表達載體的設(shè)計，依賴于諸如將轉(zhuǎn)化的宿主細胞的選擇、所需的蛋白質(zhì)表達強度等因素。哺乳動物宿主細胞中表達的優(yōu)選調(diào)節(jié)序列包括在哺乳動物細胞中導(dǎo)致強蛋白質(zhì)表達的病毒元件，例如來自自巨細胞病毒(CMV)(例如CMV啟動子/增強子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40啟動子/增強子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多瘤病毒的啟動子和/或增強子。關(guān)于病毒調(diào)節(jié)元件及其序列的進一步描述，見例如Stinski，US 5,168,062、Bell等，US 4,510,245及Schaffner等，US 4,968,615。
除了抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列，本發(fā)明的重組表達載體可以具有額外序列，例如那些調(diào)節(jié)載體在宿主細胞中復(fù)制的序列(如復(fù)制起點)和選擇性標記基因。選擇性標記基因便于選擇被引入載體的宿主細胞(見例如Axel等的US專利No 4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，常見的是選擇性標記基因賦予引入載體的宿主細胞藥物抗性，例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤抗性。優(yōu)選的選擇性標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于以甲氨蝶呤選擇/擴增的dhfr-宿主細胞中)和neo基因(用于G 418選擇)。
為了表達輕鏈和重鏈，以標準技術(shù)將編碼重鏈和輕鏈的表達載體轉(zhuǎn)染宿主細胞中。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”的不同形式旨在包括常用于將外源DNA引入原核或真核宿主細胞的多種技術(shù)，例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等。盡管理論上可以在原核或真核細胞內(nèi)表達本發(fā)明的抗體，優(yōu)選在真核細胞中、特別是哺乳動物細胞中表達抗體，因為在這類真核細胞、特別是哺乳動物細胞中，正確折疊以及組裝和分泌免疫活性抗體的概率高于原核細胞。對于活性抗體的高得率生產(chǎn)，抗體基因的原核表達經(jīng)報導(dǎo)是低效的(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today612-13)。
優(yōu)選以哺乳動物細胞表達本發(fā)明的重組抗體，這些細胞包括CHO細胞(包括在Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA774216-4220中描述的dhfr-CHO細胞，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159601-621中所描述，其與DHFR選擇標記一起使用)、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞和SP2細胞。把編碼抗體基因的重組表達載體引入哺乳動物細胞時，培養(yǎng)宿主細胞直至抗體在該宿主細胞中表達，或優(yōu)選將抗體分泌至宿主細胞生長的培養(yǎng)基中從而生產(chǎn)抗體?？梢允褂脴藴实鞍踪|(zhì)純化方法將抗體從培養(yǎng)基中分離。
也可以使用宿主細胞生產(chǎn)完整抗體的部分，例如Fab片段或scFv分子。上述方法的改變當然也包括在本發(fā)明內(nèi)。例如，可能需要以編碼本發(fā)明的抗體輕或重鏈的DNA(但是并非兩者)轉(zhuǎn)染宿主細胞。如果存在非結(jié)合目的抗原所需的輕或重鏈，則可通過重組DNA技術(shù)將本發(fā)明這類輕鏈或這類重鏈的DNA或兩者部分或全部去除。由這類截短的DNA分子表達的分子也包括在本發(fā)明的抗體內(nèi)。另外，也可以通過標準化學(xué)方法將本發(fā)明的抗體與第二個抗體交聯(lián)，生產(chǎn)雙功能抗體，該抗體的一條重鏈和一條輕鏈為本發(fā)明的抗體，另一條重鏈和一條輕鏈對不同于目的抗原的抗原具有特異性。
在優(yōu)選的重組表達本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分的系統(tǒng)中，通過磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法將編碼抗體重鏈和抗體輕鏈的重組表達載體引入dhfr-CHO細胞中。在重組表達載體內(nèi)，抗體重鏈和輕鏈基因在每種情況下與CMV增強子AdMLP-啟動子調(diào)節(jié)元件有效連接，以影響該基因的強轉(zhuǎn)錄。重組表達載體也攜帶DHFR基因，通過使用甲氨蝶呤選擇/擴增，該基因可用于選擇被載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞。培養(yǎng)選擇的轉(zhuǎn)化宿主細胞，以表達重鏈和輕鏈，并從培養(yǎng)基中分離完整抗體。使用標準分子生物學(xué)技術(shù)制備重組表達載體，轉(zhuǎn)染宿主細胞，選擇轉(zhuǎn)化體，培養(yǎng)所述宿主細胞，并從培養(yǎng)基中獲得抗體。因此本發(fā)明涉及合成本發(fā)明的重組抗體的方法，該方法通過在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞，直至合成本發(fā)明的重組抗體。該方法可進一步包括從所述培養(yǎng)基分離重組抗體。
作為通過噬茵體展示篩選重組抗體文庫的備選方案，技術(shù)人員公知的其它方法可用于篩選大的組合文庫，以鑒定本發(fā)明的抗體。在一種類型的備選表達系統(tǒng)中，以RNA-蛋白質(zhì)融合物的形式表達重組抗體文庫，如Szostak和Roberts，O 98/31700、以及Roberts，R.W.和Szostak，J.W.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9412297-12302中所描述。在這個系統(tǒng)中，體外翻譯合成的在3′末端攜帶嘌呤霉素(肽受體抗生素)的RNA產(chǎn)生mRNA與由其編碼的肽或蛋白質(zhì)的共價融合物——合成mRNA。因此，以編碼的肽或蛋白質(zhì)(例如抗體或其部分)的特性為基礎(chǔ)，例如，所述抗體或其部分對本發(fā)明的寡聚體或其衍生物的結(jié)合，可以濃縮mRNA的復(fù)雜混合物(例如重組文庫)中的特定mRNA?？梢砸陨鲜龇绞酵ㄟ^重組表達(例如在哺乳動物宿主細胞中)通過對這些庫篩選而獲得的編碼抗體或其部分的核酸序列，另外，還可以通過更多輪篩選mRNA-肽融合物，將突變引入初始的選擇序列，或以上述方法使用重組抗體的體外親和力成熟方法，進行親和力成熟。
體內(nèi)和體外途徑的組合也可以使用體內(nèi)和體外途徑的組合產(chǎn)生本發(fā)明的抗體，例如在一個方法中，首先讓本發(fā)明的寡聚體或其衍生物在宿主動物內(nèi)體內(nèi)作用于抗體所有組成成分，以刺激產(chǎn)生結(jié)合寡聚體或衍生物的抗體，然后在一種或多種體外技術(shù)的幫助下實現(xiàn)進一步的抗體選擇和/或抗體成熟(即優(yōu)化)。根據(jù)一個實施方案，這種組合方法可以包括首先以本發(fā)明的寡聚體或其衍生物免疫非人類動物(例如小鼠、大鼠、兔、小雞、Camelid、山羊或其轉(zhuǎn)基因版本或嵌合小鼠)，以刺激對所述抗原的抗體應(yīng)答，然后使用淋巴細胞的免疫球蛋白序列制備和篩選噬茵體展示文庫，其中淋巴細胞已經(jīng)寡聚體或衍生物的作用體內(nèi)刺激?？梢杂蒙鲜雠c體內(nèi)途徑有關(guān)的方式實施此組合方法的第一步，而用上述與體外途徑有關(guān)的方式實施此組合方法的第二步。以隨后體外篩選噬菌體展示文庫的超免疫非人類動物的優(yōu)選方法包括由BioSite Inc.描述的那些，見例如WO 98/47343、WO 91/17271、US 5,427,908和US 5,580,717，其中噬茵體展示文庫從所述經(jīng)過刺激的淋巴細胞制備。
根據(jù)另一實施方案，這種組合方法可以包括首先以本發(fā)明的寡聚體或其衍生物免疫非人類動物(例如小鼠、大鼠、兔、小雞、Camelid、山羊或其轉(zhuǎn)基因本或嵌合小鼠)，刺激對所述寡聚體或其衍生物的抗體應(yīng)答，然后通過篩選雜交瘤(從例如免疫動物制備)選擇產(chǎn)生具有所需特異性抗體的淋巴細胞。從選擇的克隆分離抗體或單結(jié)構(gòu)域抗體基因(通過標準克隆方法，例如反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng))，并將其進行體外親和力成熟，從而改進所選抗體(可能不只一種)的結(jié)合特性?？梢杂蒙鲜雠c體內(nèi)途徑有關(guān)的方式實施此組合方法的第一步，而用上述與體外途徑有關(guān)的方式實施此組合方法的第二步，特別是使用體外親和力成熟方法，例如在WO 97/29131和WO 00/56772中描述的那些。
在另一組合方法中，使用技術(shù)人員公知為選擇淋巴細胞抗體方法(SLAM)的程序從單個分離的淋巴細胞產(chǎn)生重組抗體，在US 5,627,052、WO 92/02551和Babcock，J.S.等，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA937843-7848中描述了該方法。在此方法中，首先以本發(fā)明的寡聚體或其衍生物體內(nèi)免疫非人類動物(例如小鼠、大鼠、兔、小雞、Camelid、山羊或其轉(zhuǎn)基因本、或嵌合小鼠)，以刺激對該寡聚體或衍生物的免疫反應(yīng)，然后使用抗原特異性溶血噬斑試驗選擇分泌目的抗體的單個細胞。為此目的，可以使用諸如生物素的接頭將寡聚體或衍生物或結(jié)構(gòu)相關(guān)的目的分子與綿羊紅細胞偶聯(lián)，從而可以使用溶血噬斑試驗鑒定分泌具有合適的特異性抗體的細胞。在鑒定分泌目的抗體的細胞之后，通過反轉(zhuǎn)錄酶PCR從細胞獲得輕鏈和重鏈可變區(qū)的cDNA，然后可以在哺乳動物細胞(例如COS或CHO細胞)中將該可變區(qū)與合適的免疫球蛋白恒定區(qū)(例如，人恒定區(qū))聯(lián)合表達。通過涂布轉(zhuǎn)染細胞，則可以使宿主細胞經(jīng)歷進一步體外分析和體外選擇，例如，為了分離表達具有所需特異性的抗體的細胞，其中宿主細胞由來自體內(nèi)選擇的淋巴細胞的擴增的免疫球蛋白序列轉(zhuǎn)染。擴增的免疫球蛋白序列可被進一步體外操作。
與上述程序類似，也可以制備對本發(fā)明的寡聚體或其衍生物及結(jié)構(gòu)相關(guān)的合成分子具有特異性的抗體。這包括i)提供抗原，該抗原具有與本發(fā)明的寡聚體或其衍生物及結(jié)構(gòu)相關(guān)的合成分子所共有的結(jié)構(gòu)特點；ii)將抗體所有組成成分暴露于該抗原；iii)從該抗體所有組成成分選擇與兩個結(jié)構(gòu)相關(guān)分子結(jié)合的抗體，從而獲得具有所需特異性的抗體。
本發(fā)明涉及可以通過上面方法獲得的寡聚體特異性抗體及其在制備治療淀粉樣β相關(guān)精神障礙的藥物或在制備診斷淀粉樣β相關(guān)精神障礙的組合物中的用途。
根據(jù)本發(fā)明獲得的抗體特別包括可以通過上面的方法獲得的抗血清?？寡蹇梢允侨?，即去除細胞和凝血成分后從宿主獲得的血液，或該血清的級份，在此級份中，特別含有濃縮的免疫球蛋白級份，優(yōu)選濃縮的、識別寡聚體的免疫球蛋白級份。可以使用上述方法結(jié)合抗體純化獲得這種級份。
本發(fā)明的抗血清是多克隆的，即它們含有具有不同特異性、通常不同類和亞類的抗體，通常具有所有L鏈同種型，識別多個蛋白質(zhì)表位。
使用本發(fā)明的多種寡聚體作為免疫原時，本發(fā)明的抗血清通常交叉反應(yīng)。
根據(jù)另一方面，根據(jù)本發(fā)明獲得的抗體也包括單克隆抗體，特別是嵌合和人源化抗體，及其寡聚體結(jié)合片段。
本發(fā)明涉及與本發(fā)明的寡聚體或其衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)和特別是抗體，即對本發(fā)明的寡聚體或其衍生物具有特異性的抗體。本發(fā)明也涉及所述蛋白質(zhì)或抗體的部分，特別是其抗原結(jié)合部分，即與本發(fā)明的寡聚體或其衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)或抗體部分。
優(yōu)選以致對本發(fā)明的寡聚體或其衍生物的特異性結(jié)合具有特定的結(jié)合動力學(xué)(即高親和力、低解離、低解離速率、強中和活性)的本發(fā)明抗體。
對于對本發(fā)明的寡聚體或其衍生物具有的親和力在KD＝10-6-10-12M范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)，特別是抗體。特別優(yōu)選高親和力蛋白質(zhì)、特別是高于Kd＝10-8M的親和力、高于Kd＝10-9M的親和力、高于Kd＝10-10M的親和力或高于Kd＝10-11M的親和力結(jié)合的抗體。
根據(jù)另一方面，優(yōu)選以相對較低的親和力、尤其是以低于Kd＝10-8M的親和力結(jié)合其它Aβ(1-42)蛋白質(zhì)形式(特別是單體Aβ(1-42)蛋白質(zhì)和/或Aβ(1-40)蛋白質(zhì))的那些蛋白質(zhì)，特別是抗體。
因此，根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選以高于單體Aβ(1-42)蛋白質(zhì)和/或Aβ(1-40)蛋白質(zhì)的親和力結(jié)合寡聚體或其衍生物的那些蛋白質(zhì)，特別是抗體。特別優(yōu)選10、100、或1000的親和力比值。
根據(jù)另一方面，可以選擇本發(fā)明的抗體，以致以0.1s-1或更低的Koff速率常數(shù)與寡聚體或其衍生物結(jié)合。對于1×10-2s-1或更低、1×10-3s-1或更低、1×10-4s-1或更低、1×10-5s-1或更低的速率常數(shù)Koff，按照指出的順序優(yōu)選性逐漸增加。
另外，可以選擇本發(fā)明的抗體，以致以1×10-6M或更低的IC50抑制本發(fā)明的寡聚體或其衍生物的活性，特別是神經(jīng)毒性活性。對于1×10-7M或更低、1×10-8M或更低、1×10-9M或更低、1×10-10M或更低、或1×10-11M或更低的抑制常數(shù)IC50，按照指出的順序優(yōu)選性逐漸增加。
抗體優(yōu)選為分離的抗體。根據(jù)另一方面，抗體為中和抗體。本發(fā)明的抗體包括單克隆和重組抗體。根據(jù)許多實施方案，抗體可以包括完全來自單一物種的氨基酸序列，例如人類抗體或小鼠抗體。根據(jù)其它實施方案，抗體可以是嵌合抗體或CDR移植物或人源化抗體的其他形式。
術(shù)語“抗體”意指由4個多肽鏈，即兩個重(H)鏈和兩個輕(L)鏈組成的免疫球蛋白分子。鏈通常通過二硫鍵與另一個連接。每條重鏈由該重鏈的可變區(qū)(此處縮寫為HCVR或VH)和該重鏈的恒定區(qū)組成，重鏈恒定區(qū)由CH1、CH2和CH3三個結(jié)構(gòu)域組成。每條輕鏈由該輕鏈的可變區(qū)(此處縮寫為LCVR或VL)和該輕鏈的恒定區(qū)組成，輕鏈恒定區(qū)由CL結(jié)構(gòu)域組成。VH和VL去可以進一步劃分為被稱為互補性決定區(qū)域(CDR)的高變區(qū)和散布的、被稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的保守區(qū)。每個VH和VL區(qū)由三個CDR和四個FR組成，它們按照下列順序從N端向C端排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡稱為“抗體部分”)指對本發(fā)明的寡聚體或其衍生物具有特異性的一個或多個抗體片段，所述片段仍然能夠特異地結(jié)合該寡聚體或其衍生物。完全抗體的片段經(jīng)顯示能夠執(zhí)行抗體的抗原結(jié)合功能。依照術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”，結(jié)合片段的實例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)F(ab′)2片段，即包括兩個Fab片段的二價片段，其中Fab片段通過二硫橋在鉸鏈區(qū)中彼此連接；(iii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的FL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(v)由VH結(jié)構(gòu)域或VH、CH1、CH2、DH3、或VH、CH2、CH3組成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature341544-546)；以及(vi)分離的互補性決定區(qū)域(CDR)。盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域(即VL和VH)由分離的基因編碼，可以使用合成接頭和重組方法進一步將其彼此連接，使它們可能以單個蛋白質(zhì)鏈制備，在該蛋白質(zhì)鏈中，VL和VH區(qū)組合以形成單價分子(公知為單鏈Fv(ScFv)；見例如Bird等，(1988)Science242423-426；以及Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883)。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”也旨在包括這類單鏈抗體。單鏈抗體的其它形式例如“雙抗體”也包括于此。雙抗體是二價雙特異性抗體，在雙抗體中，VH和VL結(jié)構(gòu)域表達在單個多肽鏈上，但是使用對于能夠組合在相同鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域而言太短的接頭，從而迫使該結(jié)構(gòu)域與不同鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，并形成兩個抗原結(jié)合位點(見例如Holliger，P.等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448；Poijak，R.J.等，(1994)Structure21121-1123)。
另外，抗體或抗原結(jié)合部分可以是較大的免疫黏附素球蛋白分子的部分，其中免疫黏附素分子由該抗體或抗體部分與一個或多個其它蛋白質(zhì)或肽的共價或非共價聯(lián)合而形成。與這類免疫黏附素分子相關(guān)的是鏈霉親和素核心區(qū)的使用，以制備四聚體scFv分子(Kipriyanov，S.M等，(1995)Human Antibodies und Hybridomas693-101)，以及半胱氨酸、標記肽和C末端多組氨酸標簽的使用，以產(chǎn)生二價和生物素化的scFv分子(Kipriyanov，S.M.等，(1994)Mol.Immunol.311047-1058)。使用常規(guī)技術(shù)例如以木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化，可以從完整抗體產(chǎn)生諸如Fab和F(ab′)2片段的抗體部分。另外，使用標準重組DNA技術(shù)可以獲得抗體、抗體部分和免疫黏附素分子。“對本發(fā)明的寡聚體或其衍生物具有特異性的分離的抗體”指對本發(fā)明的寡聚體或其衍生物具有特異性的抗體，其基本不含具有不同抗原特異性的其它抗體，即，尤其不含有與上述Aβ(1-42)的其它形式特異性結(jié)合的抗體的抗體。
術(shù)語“中和抗體”指與特定抗原的結(jié)合引起該抗原生物活性的抑制的抗體。使用適宜的體外或體內(nèi)測定法，測量抗原的一個或多個生物活性的指標，可以評價該抗原生物活性的抑制。
術(shù)語“單克隆抗體”指來自雜交瘤的抗體(例如由雜交瘤分泌的抗體，其中雜交瘤通過雜交瘤技術(shù)(例如根據(jù)Kohler和Milstein的標準雜交瘤方法)制備)。因此將來自雜交瘤產(chǎn)生并對本發(fā)明的寡聚體或其衍生物具有特異性的抗體稱為單克隆抗體。
術(shù)語“重組抗體”指通過重組方法生產(chǎn)、表達、產(chǎn)生或分離的抗體，例如使用轉(zhuǎn)染入宿主細胞的重組表達載體表達的抗體；從重組組合抗體文庫分離的抗體；從人類免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)分離的抗體(見例如Taylor，L.D.等，(1992)Nucl.Acids Res.206287-6295)；或者以其它方法生產(chǎn)、表達、產(chǎn)生或分離的抗體，在這些方法中將特定的免疫球蛋白基因序列(例如人類免疫球蛋白基因序列)與其它DNA序列組裝。重組抗體包括，例如嵌合的、CDR移植物和人源化抗體。
術(shù)語“人類抗體”指其可變和恒定區(qū)對應(yīng)于或來自人類生殖細胞系免疫球蛋白序列的抗體，例如Kabat等所描述(見Kabat等，(1991)《Sequencesof Proteins ofImmunological Interest》，第五版，U.S.Department of Healthund Human Services，NIH Publication No.91-3242)。然而，本發(fā)明的人類抗體可以在例如CDR、特別是CDR3中含有不是由人類生殖細胞系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機或定點誘變、或通過體內(nèi)體細胞突變引入的突變)。本發(fā)明的重組人類抗體具有可變區(qū)，也可以含有來自人類生殖細胞系免疫球蛋白序列的恒定區(qū)(見Kabat，E.A.等，(1991)《Sequences of Proteins of Immunological Interest》，第五版，U.S.Department of Health und Human Services，NIH Publication No 91-3242)。然而，根據(jù)具體的實施方案，將這類重組人類抗體進行體外誘變(或如果使用人類Ig序列轉(zhuǎn)基因動物，則為體內(nèi)體細胞誘變)，以致重組抗體VH和VL區(qū)的氨基酸序列成為非天然體內(nèi)存在于人類生殖細胞系抗體所有組成成分的序列，盡管其涉及或來自人類生殖細胞系VH和VL序列。根據(jù)具體的實施方案，這種重組抗體是選擇誘變或回復(fù)突變或兩者的結(jié)果。
術(shù)語“回復(fù)突變”指包括用對應(yīng)于同源生殖細胞系抗體序列的生殖細胞系殘基替換人類抗體的部分或全部體細胞突變氨基酸的方法。將本發(fā)明的人類抗體重鏈和輕鏈序列分別在VBASE數(shù)據(jù)庫中與生殖細胞系序列比較，以鑒定具有最高同源性的序列。突變編碼這些確定的異化氨基酸的核苷酸位點，將本發(fā)明的人類抗體的印記(imprint)回復(fù)為生殖細胞系序列。應(yīng)當研究以此方式鑒定為候選的回復(fù)突變的各個氨基酸對抗原結(jié)合的直接或間接重要性，不應(yīng)將突變后削弱該人類抗體所需性質(zhì)的氨基酸整合到最終的人類抗體中。為了保持回復(fù)突變的氨基酸數(shù)目盡可能少，盡管有異于最接近的生殖細胞系序列，與第二個生殖細胞系序列的相應(yīng)氨基酸序列相同的那些氨基酸位點應(yīng)當保持不變，條件是所述第二個生殖細胞系序列在相關(guān)氨基酸兩側(cè)以至少10個、優(yōu)選12個氨基酸與本發(fā)明的人類抗體序列相同并線性對應(yīng)。可以在抗體優(yōu)化的任何階段實施回復(fù)突變。
術(shù)語“嵌合抗體”指含有一個物種重鏈和輕鏈可變區(qū)序列，但是其中VH和/或VL的一個或多個CDR區(qū)序列被另一個物種的CDR序列置換的抗體，例如具有小鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)、其中一個或多個小鼠CDR(例如CDR3)被人類CDR序列置換的抗體。
術(shù)語“人源化抗體”指含有非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔、小雞、Camelid、山羊)重鏈和輕鏈可變區(qū)序列、但是其中至少部分VH和/或VL序列經(jīng)過改變從而更加“與人類似”，即與人類生殖細胞系可變區(qū)序列更加相似。一種類型的人源化抗體是CDR移植物抗體，其中將人類CDR序列插入非人類VH和VL序列中，以置換相應(yīng)的非人類CDR序列。
測量抗體結(jié)合動力學(xué)的一種方式是使用表面等離振子共振方法。術(shù)語“表面等離振子共振”指一種光學(xué)現(xiàn)象，通過這種現(xiàn)象，使用例如BIAcore系統(tǒng)(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden and Piscataway，NJ)，以生物傳感器矩陣檢測蛋白質(zhì)濃度的變化，可以分析生物特異性相互作用。進一步描述，見Jnsson，U.等，(1993)Ann.Biol.Clin.5119-26；Jnsson，U.等，(1991)Biotechniques11620-627；Johnsson，B.等，(1995)J.Mol.Recognit.8125-131；以及Johnnson，B.等，(1991)Anal.Biochem.198268-277。
術(shù)語“Koff”指抗體從抗體/抗原復(fù)合物解離的解離速率常數(shù)。
術(shù)語“Kd”指特定的抗體-抗原相互作用解離常數(shù)。
本發(fā)明的抗體的結(jié)合親和力可以使用標準體外免疫測定例如ELISA或BIAcore分析進行評價。
除了抗體，蛋白質(zhì)可以是T細胞受體衍生的分子或T細胞受體衍生的受體結(jié)構(gòu)域或該受體結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白Fc部分的融合蛋白質(zhì)。
本發(fā)明也涉及藥物制劑(組合物)，該制劑含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)，特別是本發(fā)明的抗體，以及任選的可藥用載體。本發(fā)明的藥物組合物可以進一步含有至少一種額外的治療劑，例如一種或多種治療可被本發(fā)明抗體減輕的疾病的治療劑。例如，如果本發(fā)明的抗體結(jié)合本發(fā)明的寡聚體，藥物組合物可以進一步含有一種或多種額外的治療紊亂的治療劑，其中所述寡聚體的活性對紊亂是重要的。
藥物適宜載體包括任何溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌和抗真菌劑、等滲和延遲吸收劑等，只要它們是生理學(xué)相容的。藥物接受載體包括例如水、鹽溶液、磷酸緩沖鹽溶液、右旋糖、甘油、乙醇等，及其組合。在許多情況下，優(yōu)選使用等滲劑，例如糖、多元醇(如甘露醇或山梨醇)，或還有氯化鈉。藥物適宜載體可以進一步含有相對少量的輔助物質(zhì)，例如潤濕劑或乳化、防腐劑或緩沖液，它們將增加抗體的半衰期或功效。
藥物組合物可適于例如胃腸外施用。在此，優(yōu)選將抗體制備為具0.1-250mg/ml的抗體含量的可注射溶液?？梢砸砸后w或凍干形式制備可注射溶液，藥劑形式為鉛玻璃(flint glass)或小瓶、安瓿或填充注射器。緩沖液可以含有L-組氨酸(1-50mM，優(yōu)選5-10mM)，具有5.0-7.0、優(yōu)選6.0的pH。其它適宜的緩沖液包括(但不限于)琥珀酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉或磷酸鉀緩沖液?？梢允褂寐然c以調(diào)節(jié)溶液張力至0-300mM(對于液體劑量形式優(yōu)選150mM)濃度。對于凍干劑量形式也可以包括抗凍劑，例如蔗糖(例如0-10％，優(yōu)選0.5-1.0％)。其它合適的防凍劑是海藻糖和乳糖。對于凍干劑量形式也可以包括填充物例如甘露糖(例如1-10％，優(yōu)選2-4％)。穩(wěn)定劑例如L-蛋氨酸(例如51-50mM，優(yōu)選5-10mM)可以用于液體和凍干劑量形式。其它合適的填充物為甘氨酸和精氨酸。也可以使用表面活性劑例如聚山梨醇酯80(例如0-0.05％，優(yōu)選0.005-0.01％)。其它表面活性劑為聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性劑。
本發(fā)明的組合物可以有多種形式。這包括液體、半固體和固體劑量形式，例如液體溶液(如可注射及可灌輸溶液)、分散劑或懸浮液、片劑、丸劑、粉末、脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選的形式取決于欲施用的類型和治療應(yīng)用。一般，優(yōu)選對可注射或可灌輸溶液形式的組合物，例如與人類被動免疫的其它抗體相似的組合物。優(yōu)選的給藥途徑是胃腸外(例如靜脈內(nèi)、皮下腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi))。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，通過靜脈灌輸或注射給予抗體。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案，通過肌肉內(nèi)或皮下注射給予抗體。
治療組合物一般必須是無菌并在制備和儲存條件下穩(wěn)定的?？梢詫⒔M合物配制為溶液、微乳液、分散劑、脂質(zhì)體或其它適于高活性物質(zhì)濃度的有序結(jié)構(gòu)。可以以要求的量將活性化合物(例如抗體)引入合適的溶劑(根據(jù)需要，適當時為上述成分的一種或組合)，然后無菌過濾該溶液，從而制備無菌的可注射溶液。分散劑通常是通過將活性物質(zhì)引入含有基本分散介質(zhì)(恰當時還有其它所需成分)的無菌賦形劑中而制備。在制備無菌可注射溶液的無茵凍干粉末的情況下，真空干燥和噴霧干燥是優(yōu)選的制備方法，該方法從前面無菌過濾溶液生產(chǎn)活性成分、合適時還有其它所需成分的粉末。通過使用例如卵磷脂這類包衣、在分散劑情況下保持要求的顆粒尺寸或使用表面活性劑，可以保持溶液合適的流動性。通過將延緩吸收的制劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)額外引入組合物，可以實現(xiàn)可注射組合物的延長吸收。
盡管對于許多治療應(yīng)用，優(yōu)選的給藥類型是皮下注射、靜脈注射或靜脈灌注，本發(fā)明的抗體可以通過許多技術(shù)人員公知的方法給藥。技術(shù)人員將理解，給藥途徑和/或類型取決于所需的結(jié)果。根據(jù)具體的實施方案，可以用保護化合物免于迅速釋放的載體制備活性化合物，例如具有受控釋放的制劑，包括植入物、經(jīng)皮膏藥以及微膠囊化的釋放系統(tǒng)?？梢允褂每缮锝到獾摹⑸锵嗳莸亩嗑垠w，例如乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、聚酸酐、聚乙二醇酸、膠原質(zhì)、聚原酸酯、聚乳酸。制備這類制劑的方法為技術(shù)人員所熟知，見例如《Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems》，J.R.Robinson，編，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
根據(jù)具體的實施方案，本發(fā)明的抗體可以在例如惰性稀釋劑或可同化的食用載體中經(jīng)口給藥。也可以將抗體(如果需要，還有其它成分)封閉在硬或軟明膠膠囊中、壓縮成片劑或直接加入食物中。對于經(jīng)口治療給藥，可以將抗體與賦形劑混和，以可吞吃片劑、含片劑、膠囊、酏劑、懸浮劑、糖漿劑等形式使用。如果旨在將本發(fā)明的抗體通過非胃腸外途徑給藥，有必要從防止其失活的材料中選擇包衣。
本發(fā)明的抗體優(yōu)選能夠體外或體內(nèi)中和其結(jié)合的本發(fā)明的寡聚體或其衍生物的活性。因此，在例如含有所述寡聚體或其衍生物的細胞培養(yǎng)物中，或在存在該寡聚體或其培養(yǎng)物的人類個體或哺乳動物中，該抗體可以用于抑制本發(fā)明的寡聚體或其衍生物的活性。根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明涉及抑制本發(fā)明的抗體或其衍生物的活性的方法，該方法包括允許本發(fā)明的抗體作用于寡聚體或其衍生物，以致抑制該寡聚體或其衍生物的活性。例如，可以在體外抑制該活性。例如，可以將本發(fā)明的抗體加入細胞培養(yǎng)物中，其中的細胞培養(yǎng)物含有或可疑含有本發(fā)明的寡聚體或其衍生物，從而抑制培養(yǎng)物中寡聚體或其衍生物的活性。另外，可以在個體體內(nèi)抑制寡聚體或其衍生物的活性。
本發(fā)明進一步涉及在個體內(nèi)抑制本發(fā)明的寡聚體或其衍生物的活性的方法，其中個體遭受紊亂，該紊亂涉及淀粉樣β蛋白質(zhì)，本發(fā)明的寡聚體或其衍生物的活性尤其重要。該方法包括將至少一種本發(fā)明的抗體施用于個體，以抑制抗體結(jié)合的寡聚體或其衍生物活性。所述個體優(yōu)選為人類。本發(fā)明的抗體可以出于治療性目的施用于人類個體。另外，本發(fā)明的抗體可以出于獸醫(yī)目的或在具體疾病的動物模型框架內(nèi)施用于非人類哺乳動物。這類動物模型對于評價本發(fā)明抗體的治療性功效(例如測試給藥的劑量和時程)可能有用。
本發(fā)明的寡聚體及其衍生物參與其中的紊亂，特別包括在其發(fā)展和/或過程中涉及本發(fā)明的寡聚體或其衍生物的紊亂。這尤其指那些紊亂本發(fā)明的寡聚體或其衍生物是該病癥明顯或推定的病理生理學(xué)原因，或是參與該紊亂的發(fā)展或過程的因素。因此，這里包括那些病癥，在這些病癥中，本發(fā)明的寡聚體或其衍生物的活性的抑制可以緩解病癥的癥狀和/或進展。通過例如在遭受具體病癥個體的生物學(xué)液體中本發(fā)明的寡聚體或其衍生物濃度的升高(例如在血清、血漿、CSF、尿等中濃度升高)可以證實這些紊亂。這可以使用例如本發(fā)明的抗體檢測。本發(fā)明的寡聚體及其衍生物在與許多病癥相關(guān)的病理學(xué)中起到重要作用，在這些病癥中，涉及神經(jīng)變性因素、認知缺陷、神經(jīng)毒性因素和炎性因素。
本發(fā)明的抗體可以與一種或多種對于上述病癥的治療備用的額外治療劑一起施用。
本發(fā)明的藥物組合物一般含有至少一種本發(fā)明的治療有效量或預(yù)防有效量的抗體。根據(jù)所需治療，例如是否需要治療性或預(yù)防性處理，可以選擇并調(diào)整劑量方案。例如，根據(jù)治療情況的需要，可以給以單次給藥、隨時間多次單獨給藥，或增加或降低的劑量。為了方便給藥并保證劑量統(tǒng)一，以單次劑量形式以配制胃腸外組合物尤其有利。
本發(fā)明的抗體的治療有效量或預(yù)防有效量可以在例如0.1-20mg/kg并優(yōu)選1-10mg/kg范圍內(nèi)，但是不限于此。根據(jù)欲緩解病癥的類型和嚴重性，這些量當然可以變化。
在抗體的診斷性使用框架內(nèi)，特異性寡聚體的定性或定量測定特別用于診斷疾病相關(guān)的淀粉樣β(1-42)形式。在本文中，特異性指能夠以足夠的靈敏度檢測特定寡聚體或寡聚體混合物的可能性。本發(fā)明的抗體有利地具有低于10ng/ml樣品、優(yōu)選低于1ng/ml樣品、并特別優(yōu)選低于100pg/ml樣品的靈敏度，意味著可以通過本發(fā)明的抗體檢測到至少在各例中表明的每毫升樣品中的寡聚體濃度，以及有利的更低濃度。
根據(jù)免疫學(xué)實施測定。在原則上可以使用任何使用到抗體的分析性或診斷性測定，包括凝集和沉淀技術(shù)、免疫測定、免疫組織化學(xué)方法和免疫印跡方法，例如蛋白質(zhì)印跡或斑點印跡方法。在此也包括體內(nèi)方法，例如成像方法(imaging method)。
在免疫測定中的用途是有利的。競爭性免疫測定和夾層免疫測定都是合適的，競爭性免疫測定即抗原和標記的抗原(示蹤物)競爭抗體結(jié)合，夾層免疫測定即通常使用標記的第二抗體檢測特異性抗體對抗原的結(jié)合。這些試驗可以是同相的，即沒有分離成固相和液相，或是多相的，即通過例如固相結(jié)合的抗體將結(jié)合的標記與未結(jié)合的標記分開。根據(jù)標記和測量方法，不同的多相和同向免疫測定形式可以分成具體的類別中，例如RIA(放射免疫測定)、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、FIA(熒光免疫測定)、LIA(發(fā)光免疫測定)、TRFIA(時間分辨的FIA)、IMAC(免疫活化)、EMIT(酶放大的免疫測試)、TIA(turbodimetric免疫測定)、I-PCR(免疫-PCR)。
關(guān)于本發(fā)明的寡聚體測定，優(yōu)選競爭性免疫測定法，其中標記的寡聚體(示蹤物)與樣品將要定量的寡聚體樣品競爭結(jié)合使用的抗體。借助于標準曲線，可以從置換的示蹤物的量測定樣品中抗原的量，即寡聚體的量。
可用于這些目的的標記中，經(jīng)證實酶是有利的。例如，可以使用基于過氧化物酶(特別是辣根過氧化物酶)、堿性磷酸酶和β-D-半乳糖酶的系統(tǒng)?？色@得這些酶的特異性底物，特異性底物的轉(zhuǎn)化可以通過例如光度法監(jiān)測。合適的底物系統(tǒng)以下列為基礎(chǔ)對于堿性磷酸酶，對硝基苯磷酸鹽(p-NPP)、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮藍四唑(BCIP/NBT)、Fast-Red/萘酚-AS-TS磷酸；對于過氧化物酶，2，2-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磷酸)(2，2-Azino-bis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsure))(ABTS)、鄰苯二胺(OPT)、3，3′，5，5′-四甲基對二氨基聯(lián)苯(3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine)(TMB)、鄰聯(lián)茴香胺、5-氨基水楊酸、3-二甲基氨基苯酸(DMAB)和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(3-methyl-2-benzothiazolinhydrazone)(MBTH)；對于β-D-半乳糖酶，鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷(o-NPG)、對硝基苯-β-D-半乳糖苷和4-Methylumbelliphenyl-β-D-半乳糖苷(MUG)。在許多情況下，這些底物系統(tǒng)可商業(yè)獲得即用形式，例如以片劑形式，其可以含有其它試劑，例如適宜的緩沖液等。
使用的示蹤物是標記的寡聚體。在這一方面，可以通過標記待測寡聚體并將其用作示蹤物而測定特定的寡聚體。
可以用本身已知的方式將標記與寡聚體偶聯(lián)，以制備示蹤物。通過類推提及上文關(guān)于衍生本發(fā)明寡聚體的注釋。另外，可以獲得許多為與蛋白質(zhì)綴合而經(jīng)過適當修飾的標記，例如生物素、抗生物素蛋白、extravidin或鏈霉親和素綴合的酶、馬來酰亞胺活化的酶等。這些標記可以與寡聚體或根據(jù)需要與經(jīng)適當衍生的寡聚體直接反應(yīng)而生成示蹤物。例如，如果使用鏈霉親和素過氧化物酶綴合物，則首先需要求生物素化寡聚體。這相應(yīng)地應(yīng)用于相反的順序。關(guān)于這個目的，合適的方法也為技術(shù)人員所公知。
如果選擇多相免疫測定形式，可以通過將抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合到支持物上而將其分離，例如，通過與支持物偶聯(lián)的抗獨特型抗體(如抗兔IgG抗體)來分離。支持物、特別是以適宜的抗體包被的微滴定板是已知的，并且部分可商業(yè)獲得。
本發(fā)明進一步涉及免疫測定套裝，該套裝具有至少一種上述抗體以及其它組分。該套裝通常為包裝單位形式，是實施本發(fā)明的寡聚體測定的組合物。為了操作盡可能簡單的目的，優(yōu)選以基本即用的形式提供上述手段。有利的安排是以試劑盒形式提供免疫測定。試劑盒通常包括用于分開排列組分的多個容器?？梢砸约从孟♂屢?、以用于稀釋的濃宿物，或者以用于溶解或懸浮的干物質(zhì)或凍干物提供所有組分；個別或所有成分可以冷凍或在室溫保存直至使用。血清優(yōu)選在例如-20℃迅速冷凍，以致在這種情況下，免疫測定在使用前不得不優(yōu)選保持在結(jié)冰溫度之下。
與免疫測定提供的其它組分取決于該免疫測定的類型。通常，與抗血清一起提供標準蛋白、示蹤物(可能需要，也可能不需要)以及對照血清。另外，也包括微滴定板(優(yōu)選抗體包被的)、用于例如測試、洗滌或底物轉(zhuǎn)變的緩沖液和酶底物本身。
免疫測定、作為實驗室和醫(yī)院中的輔助的抗體的生產(chǎn)和使用的通用原則可見于例如《Antibodies，A Laboratory Manual》(Harlow，E.和Lane，D.編，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1988)。
其它目標還有抑制本發(fā)明的寡聚體聚集或加速其解聚的物質(zhì)。這類物質(zhì)特別代表了治療上述淀粉樣β相關(guān)紊亂(例如阿爾茨海默病)的可能的治療劑。
本發(fā)明因此也涉及表征物質(zhì)或物質(zhì)混合物的方法，該方法包括i)以適當?shù)姆绞教峁┰撐镔|(zhì)或物質(zhì)混合物；ii)允許該物質(zhì)或物質(zhì)混合物作用于至少一種本發(fā)明的寡聚體、其衍生物或組合物；以及iii)測定該物質(zhì)或該物質(zhì)混合物的特定部分是否與所述寡聚體、其衍生物或存在于所述組合物中的至少一種寡聚體或其衍生物結(jié)合。
也可以在生物來源的混合物中實施該方法，例如細胞制品和細胞提取物，從而鑒定對本發(fā)明的寡聚體具有親和力的天然結(jié)合配偶體，例如細胞表面抗原，特別是受體和可溶性配體，例如特定的蛋白質(zhì)和中介體。
不僅是物質(zhì)的結(jié)合，其與本發(fā)明的寡聚體的相互作用及對寡聚體的影響也可以是該方法的主題。因此特別可以測定是否-該物質(zhì)能夠調(diào)節(jié)、特別是抑制淀粉樣β蛋白質(zhì)向本發(fā)明的寡聚體的聚集；-該物質(zhì)能夠調(diào)節(jié)、特別是增強本發(fā)明的寡聚體的解聚；-本發(fā)明的寡聚體引起結(jié)合配偶體的功能改變，例如對受體具有激動、部分激動、拮抗或逆激動作用。
所述方法通常為體外篩選方法，可以用于從多種不同物質(zhì)中選擇對進一步應(yīng)用最有前景的那些物質(zhì)。例如，可以通過組合化學(xué)方法建立包括大量潛在活性物質(zhì)的廣泛的物質(zhì)文庫?？梢宰詣踊Y選具有所需活性的物質(zhì)的組合文庫。篩選機器人用于有效地分析單個的測定，這些測定優(yōu)選排列在微滴定板上。本發(fā)明因此也涉及篩選方法，即一級和二級篩選方法，優(yōu)選其中至少應(yīng)用一種下述方法。如果應(yīng)用若干方法，它們可以隨時間變化或同時應(yīng)用于同一樣品，或應(yīng)用于待測物質(zhì)的不同樣品。
實施這類方法的特別有效的技術(shù)是閃爍親近測定法，簡稱為SPA，該技術(shù)為藥物篩選領(lǐng)域所公知。實施該測定的試劑盒和組分可以商業(yè)獲得，例如從Amersham Pharmacia Biotech。原則上，將溶解的或膜固定的受體固定在含有閃爍物質(zhì)的小的熒光微球體上。當例如放射性配體與結(jié)合受體結(jié)合時，由于閃爍物質(zhì)和放射性配體的空間親近，閃爍物質(zhì)得到刺激并發(fā)光。
實施這類方法的另一個特別有效的技術(shù)是藥物篩選領(lǐng)域公知的FlashPlateR技術(shù)。實施該測定的試劑盒和組分可以商業(yè)獲得，例如從NENR Life Science Products。該原則也基于閃爍物質(zhì)包被的微滴定板(96或384孔)的。
本發(fā)明涉及物質(zhì)或物質(zhì)混合物的一部分，及其在制備藥劑或制備組合物中的用途；作為與寡聚體、其衍生物或與存在于相應(yīng)組合物中的至少一種寡聚體或其衍生物結(jié)合的配體，其中物質(zhì)或物質(zhì)混合物的部分可以根據(jù)本方法確定，其中藥劑用于淀粉樣β相關(guān)的紊亂(特別是癡呆)的治療，其中組合物組合物用于診斷淀粉樣β相關(guān)的紊亂(特別是癡呆)。
下面的實施例旨在說明本發(fā)明，而非限制其范圍。


圖1顯示Aβ(1-42)寡聚體A制品(泳道A)、Aβ(1-42)寡聚體B制品(泳道B)、標準蛋白質(zhì)(分子量標志蛋白質(zhì)，泳道C)的SDS PAGE；圖2顯示Aβ(1-42)寡聚體A制品(泳道A)；Aβ(1-42)寡聚體A-CL制品(泳道A’)；Aβ(1-42)寡聚體B制品(泳道B)；Aβ(1-42)寡聚體B-CL制品(泳道B’)；標準蛋白質(zhì)(分子量標志蛋白質(zhì)，泳道C)的SDS PAGE；圖3顯示生物素Aβ(1-42)寡聚體B制品(泳道A)；標準蛋白質(zhì)(分子量標志蛋白質(zhì)，泳道B)的SDS PAGE；圖4顯示熒光素Aβ(1-42)寡聚體B制品(泳道A)；標準蛋白質(zhì)(分子量標志蛋白質(zhì)，泳道B)的SDS PAGE；圖5顯示與含有Aβ(1-42)寡聚體B的制品比較，含有Aβ(1-42)凍干物的溶液的凝膠滲透層析；圖6顯示Aβ(1-42)寡聚體B制品(泳道A)；標準蛋白質(zhì)(分子量標志蛋白質(zhì)，泳道B)的NATIVE PAGE；圖7顯示(a)單體Aβ(1-42)蛋白質(zhì)、(b)Aβ(1-42)寡聚體A以及(c)Aβ(1-42)寡聚體B對人類成神經(jīng)細胞瘤細胞系IMR-32表面的結(jié)合；圖8以％顯示以Aβ(1-42)寡聚體B處理鼠皮質(zhì)神經(jīng)元后的神經(jīng)毒性作用，誤差條對應(yīng)于95％置信區(qū)間；圖9顯示以胰蛋白酶(泳道2)、糜蛋白酶(泳道3)、嗜熱菌蛋白酶(泳道4)、彈性蛋白酶(泳道5)、木瓜蛋白酶(泳道6)處理的或未經(jīng)處理的(泳道7)Aβ(1-42)制品；以及標準蛋白質(zhì)(分子量標志蛋白質(zhì)，泳道1)的SDS PAGE；圖10顯示下列反應(yīng)性的斑點印跡100pmol(A行)、10pmol(B行)、1pmol(C行)、0.1pmol(D行)、0.01pmol(E行)的實施例6b的Aβ(1-42)寡聚體B制品(列1)、實施例1a的HFIP處理的Aβ(1-42)單體(列2)、實施例15a的嗜熱茵蛋白酶剪切的Aβ(1-42)寡聚體B制品(列3)、實施例14a的戊二醛交聯(lián)的Aβ(1-42)寡聚體B制品(列4)、根據(jù)M.P.Lambert等，J.Neurochem.79，595-605(2001)在4℃或室溫或37℃(分別為列5、列6和列7)制備的ADDL、溶解于0.1％NH4OH中的Aβ(1-42)(列8)、實施例27的Aβ(1-42)原纖維制品(列9)、以及Sigma的PBS稀釋的APP(列10)，其中具有a)單克隆抗體6E10；b)實施例25d的多克隆抗血清(d1)；c)實施例25c的多克隆抗血清(c1)；d)實施例25a的多克隆抗血清(a1)；以及e)實施例25a的多克隆抗血清(a2)；圖11顯示實施例15a的Aβ(1-42)寡聚體B制品(泳道B)；實施例15b的Aβ(1-42)寡聚體C制品(泳道C)；實施例6b的Aβ(1-42)寡聚體B制品(泳道A)；以及標準蛋白質(zhì)(分子量標志蛋白質(zhì)，泳道D)的SDS PAGE；圖12顯示與實施例14a的Aβ(1-42)寡聚體B-CL制品比較，實施例6b的Aβ(1-42)寡聚體B制品的凝膠滲透層析；圖13顯示單體Aβ(1-42)蛋白質(zhì)(左)；Aβ(1-42)寡聚體(12體，A)；以及Aβ(1-42)寡聚體(12體，C)和Aβ(20-42)寡聚體(12體，B)的圖示表示，后二者可以通過蛋白酶水解剪切獲得；
圖14以Aβ(1-42)寡聚體B對海馬區(qū)作用的時間函數(shù)顯示興奮性突觸后電位(fEPSP)；圖15顯示描述與非特異性結(jié)合熒光相比(b)，Aβ(1-42)寡聚體B與大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)合的免疫熒光圖像(a)。
除非另外指出，本發(fā)明寡聚體的濃度以單體Aβ(1-42)多肽的摩爾濃度表示。術(shù)語β淀粉樣(1-42)蛋白質(zhì)相當于術(shù)語淀粉樣β(1-42)蛋白。除非另外指出，使用的蛋白質(zhì)(多肽)為人類來源。
實施例實施例1a)人類Aβ(1-42)貯存懸浮液的制備將2mg人類β淀粉樣(1-42)蛋白質(zhì)(簡稱Aβ(1-42)；肽合成材料、凍干物，來自Bachem，德國)溶解于800μl，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇中，在Eppendorf管中于37℃孵育30分鐘。繼之在真空濃縮器(Speed Vac)中蒸發(fā)至干燥。以88μl DMSO吸收殘余物，得到5mM Aβ(1-42)貯存懸浮液，可保存于-20℃。
b)大鼠Aβ(1-42)貯存懸浮液的制備將2mg大鼠β淀粉樣(1-42)蛋白質(zhì)(簡稱大鼠Aβ(1-42)；肽合成材料、凍干物，來自Bachem，德國)溶解于800μl 1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇中，在Eppendorf管中于37℃孵育30分鐘。繼之在真空濃縮器(Speed Vac)中蒸發(fā)至干燥。以88μl DMSO吸收殘余物，得到5mM大鼠Aβ(1-42)貯存懸浮液，可保存于-20℃。
實施例2a)具有15kDa和20kDa分子量的Aβ(1-42)寡聚體[Aβ(1-42)寡聚體A]的制備；使用SDS將690μl PBS緩沖液(20mM磷酸鈉，140mM NaCl，pH7.4)添加到60μl實施例1a的貯存溶液中，以75μl 2％強度的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液調(diào)節(jié)該混合物至SDS含量為0.2％。繼之為在37℃、5小時的孵育，以及于10000g、10分鐘的離心。該Aβ(1-42)寡聚體A制品(約400μMAβ(1-42))可以保存于-20℃。
b)具有15kDa和20kDa分子量的大鼠Aβ(1-42)寡聚體[大鼠Aβ(1-42)寡聚體A]的制備；使用SDS將690μl PBS緩沖液(20mM磷酸鈉，140mM NaCl，pH7.4)添加到60μl實施例1b的貯存溶液中，以75μl 2％強度的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液調(diào)節(jié)該混合物至SDS含量為0.2％。繼之為在37℃、5小時的孵育，以及于10000g、10分鐘的離心。該大鼠Aβ(1-42)寡聚體A制品(約400μM大鼠Aβ(1-42))可以保存于-20℃。
c)具有15kDa和20kDa分子量的Aβ(1-42)寡聚體[Aβ(1-42)寡聚體A]的制備；使用月桂酸將690μl PBS緩沖液(20mM磷酸鈉，140mM NaCl，pH7.4)添加到60μl實施例1a的貯存溶液中，以75μl 5％強度的月桂酸溶液調(diào)節(jié)該混合物至月桂酸含量為0.5％。繼之為在37℃、5小時的孵育，以及于10000g、10分鐘的離心。該Aβ(1-42)寡聚體A制品(約400μM Aβ(1-42))可以保存于-20℃。
d)具有15kDa和20kDa分子量的Aβ(1-42)寡聚體[Aβ(1-42)寡聚體A]的制備；使用油酸將690μl PBS緩沖液(20mM磷酸鈉，140mM NaCl，pH7.4)添加到60μl實施例1a的貯存溶液中，以75μl 5％強度的油酸溶液調(diào)節(jié)該混合物至油酸含量為0.5％。繼之為在37℃、5小時的孵育，以及于10000g、10分鐘的離心。該Aβ(1-42)寡聚體A制品(約400μM Aβ(1-42))可以保存于-20℃。
e)具有15kDa和20kDa分子量的Aβ(1-42)寡聚體[Aβ(1-42)寡聚體A]的制備；使用十二烷酰肌氨酸將690μl PBS緩沖液(20mM磷酸鈉，140mM NaCl，pH7.4)添加到60μl實施例1a的貯存溶液中，以75μl 5％強度的十二烷酰肌氨酸溶液調(diào)節(jié)該混合物至油酸含量為0.5％。繼之為在37℃、5小時的孵育，以及于10000g、10分鐘的離心。該Aβ(1-42)寡聚體A制品(約400μM Aβ(1-42))可以保存于-20℃。
實施例3a)制備具有15kDa和20kDa分子量的Aβ(1-42)寡聚體[Aβ(1-42)寡聚體A]的備選方法在220μl 10mM水HCl溶液中吸收1mg人類β淀粉樣(1-42)蛋白質(zhì)(簡稱Aβ(1-42)；肽合成材料、凍干物，來自Bachem，德國)，并于室溫孵育10分鐘。通過于10000g離心5分鐘去除不溶性成分。上清液(1mMAβ(1-42))含有Aβ(1-42)蛋白質(zhì)，并如下進行進一步加工將9μl PBS緩沖液和1μl 2％強度的SDS溶液添加至1μl上清液中，混合物于37℃孵育16h。hAβ(1-42)寡聚體A制品(100μM)可以保存于-20℃。
b)制備具有15kDa和20kDa分子量的大鼠Aβ(1-42)寡聚體[大鼠Aβ(1-42)寡聚體A]的備選方法在10mM水HCl溶液220μl中吸收1mg大鼠β淀粉樣(1-42)蛋白質(zhì)(簡稱大鼠Aβ(1-42)；肽合成材料、凍干物，來自Bachem，德國)，并于室溫孵育10分鐘。通過于10000g離心5分鐘去除不溶性成分。上清液(1mM大鼠Aβ(1-42))含有大鼠Aβ(1-42)蛋白質(zhì)，并如下進行進一步加工將9μl PBS緩沖液和1μl 2％強度的SDS溶液添加至1μl上清液中，混合物于37℃孵育16h。大鼠Aβ(1-42)寡聚體A制品(100μM)可以保存于-20℃。
實施例4a)制備具有15kDa和20kDa分子量的Aβ(1-42)寡聚體[Aβ(1-42)寡聚體A]的備選方法將1mg人類β淀粉樣(1-42)蛋白質(zhì)(簡稱Aβ(1-42)；肽合成材料、凍干物，來自Bachem，德國)溶解于44μl 1％ SDS/H2O中(5mMAβ(1-42))。將5μl該溶液與40μl PBS及5μl 2％ SDS混和，于37℃孵育16h。通過于10000g離心5分鐘去除不溶性成分。由此獲得的Aβ(1-42)寡聚體A制品(500μM Aβ(1-42))可以保存于-20℃。
b)制備具有15kDa和20kDa分子量的大鼠Aβ(1-42)寡聚體[大鼠Aβ(1-42)寡聚體A]的備選方法將1mg大鼠β淀粉樣(1-42)蛋白質(zhì)(簡稱大鼠Aβ(1-42)；肽合成材料、凍干物，來自Bachem，德國)溶解于44μl 1％ SDS/H2O中(5mM大鼠Aβ(1-42))。將5μl該溶液與40μl PBS及5μl 2％ SDS混和，于37℃孵育16h。通過于10000g離心5分鐘去除不溶性成分。由此獲得的大鼠Aβ(1-42)寡聚體A制品(500μM大鼠Aβ(1-42))可以保存于-20℃。
實施例5a)具有38kDa和48kDa分子量的Aβ(1-42)寡聚體[Aβ(1-42)寡聚體B]的制備將根據(jù)實施例2a獲得的Aβ(1-42)寡聚體A溶液以2.475ml水稀釋(0.05％ SDS含量，0.1mM Aβ(1-42))，于37℃孵育20小時。該Aβ(1-42)寡聚體B制品的等分試樣可以于-80℃冷凍并保存用于進一步研究。
b)具有38kDa和48kDa分子量的大鼠Aβ(1-42)寡聚體[大鼠Aβ(1-42)寡聚體B]的制備將根據(jù)實施例2a獲得的大鼠Aβ(1-42)寡聚體A溶液以2.475ml水稀釋(0.05％ SDS含量，0.1mM大鼠Aβ(1-42))，于37℃孵育20小時。該大鼠Aβ(1-42)寡聚體B制品的等分試樣可以于-80℃冷凍并保存用于進一步研究。
c)具有38kDa和48kDa分子量的Aβ(1-42)寡聚體[Aβ(1-42)寡聚體B]的備選制備將根據(jù)實施例2c獲得的Aβ(1-42)寡聚體A溶液以2.475ml水稀釋(0.125％月桂酸含量，0.1mM Aβ(1-42))，于37℃孵育20小時。該Aβ(1-42)寡聚體B制品的等分試樣可以于-80℃冷凍并保存用于進一步研究。
d)具有38kDa和48kDa分子量的Aβ(1-42)寡聚體[Aβ(1-42)寡聚體B]的備選制備將根據(jù)實施例2d獲得的Aβ(1-42)寡聚體A溶液以2.475ml水稀釋(0.125％油酸含量，0.1mM Aβ(1-42))，于37℃孵育20小時。該Aβ(1-42)寡聚體B制品的等分試樣可以于-80℃冷凍并保存用于進一步研究。
e)具有38kDa和48kDa分子量的Aβ(1-42)寡聚體[Aβ(1-42)寡聚體B]的備選制備將根據(jù)實施例2e獲得的Aβ(1-42)寡聚體A溶液以2.475ml水稀釋(0.125％十二烷基肌氨酸含量，0.1mM Aβ(1-42))，于37℃孵育20小時。該Aβ(1-42)寡聚體B制品的等分試樣可以于-80℃冷凍并保存用于進一步研究。
f)具有38kDa和48kDa分子量的無SDS Aβ(1-42)寡聚體[Aβ(1-42)寡聚體B]的制備將根據(jù)實施例6b獲得的Aβ(1-42)寡聚體B制品10μl與4％/33％/63％比例的乙酸/甲醇/水混合物250μl混和，在冰上于0℃孵育30分鐘。離心(10000g，10分鐘)后，去除上清液，將沉淀的蛋白質(zhì)以200μl緩沖液(20mM磷酸鈉，140mM NaCl，pH7.4)吸收。以此方法獲得的制品含有無SDS形式的溶解的Aβ(1-42)寡聚體B，可保存于-20℃。
實施例6a)具有38kDa和48kDa分子量的Aβ(1-42)寡聚體[Aβ(1-42)寡聚體B]的透析和濃縮將根據(jù)實施例5a制備的Aβ(1-42)寡聚體B與30ml含有PluronicF68(BASF)的PBS混和，并于Amicon Centriprep YM，30KD中濃縮至3ml。通過離心(10000g，5分鐘)去除可能存在的殘余物。取出上清液。該Aβ(1-42)寡聚體B制品的等分試樣可以于-80℃冷凍并保存用于進一步研究。
b)具有38kDa和48kDa分子量的Aβ(1-42)寡聚體[Aβ(1-42)寡聚體B]濃縮物的制備將根據(jù)實施例5a制備的Aβ(1-42)寡聚體B 72.6ml經(jīng)30KDCentriprep YM Tube(Amicon)濃縮為2ml。于10000g離心10分鐘去除濃縮物。取出上清液，并于6℃在透析管中對11緩沖液(5mM磷酸鈉，35mM氯化鈉，pH7.4)透析16h。于10000g離心10分鐘去除透析物。取出上清液并于-80℃保存用于進一步研究。
實施例7生物素-Aβ(1-42)貯存懸浮液的制備將0.5mg生物素-β-淀粉樣(1-42)蛋白質(zhì)(簡稱生物素-Aβ(1-42)；肽合成材料、凍干物，AnaSpec)溶解于200μl 1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇中，在Eppendorf管中于37℃孵育30分鐘。繼之在真空濃縮器(Speed Vac)中蒸發(fā)至干燥。以20.5μl DMSO吸收殘余物，得到5mM生物素Aβ(1-42)貯存懸浮液，可保存于-20℃。
實施例8具有17kDa和22kDa分子量的生物素-Aβ(1-42)寡聚體[生物素-Aβ(1-42)寡聚體A]的制備將2μl實施例7的貯存懸浮液與23μl PBS緩沖液(20mM磷酸鈉，140mM NaCI，pH7.4)混和，以2.4μl 2％強度的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液調(diào)節(jié)至SDS含量為0.2％。繼之為于37℃孵育6小時。通過于10000g、5分鐘的離心去除不可溶成分。以此方法獲得的生物素-Aβ(1-42)寡聚體A制品可以保存于-20℃。
實施例9
具有42kDa和52kDa分子量的生物素-Aβ(1-42)寡聚體[生物素-Aβ(1-42)寡聚體B]的制備以82μl水稀釋(含0.05％SDS 0.1mM Aβ)根據(jù)實施例8獲得的生物素-Aβ(1-42)寡聚體A，于37℃孵育16小時。通過于10000g、5分鐘的離心去除不可溶成分。生物素-Aβ(1-42)寡聚體B制品可以于-20℃冷凍并保存用于進一步研究(圖3)。
實施例10熒光素-Aβ(1-42)貯存懸浮液的制備將0.5mg熒光素-β-淀粉樣(1-42)蛋白質(zhì)(簡稱熒光素-Aβ(1-42)；肽合成材料、凍干物，AnaSpec)溶解于200μl 1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇中，在Eppendorf管中于37℃孵育30分鐘。繼之在真空濃縮器(Speed Vac)中蒸發(fā)至干燥。以20.5μl DMSO吸收殘余物，產(chǎn)生5mM熒光素Aβ(1-42)貯存懸浮液，可保存于-20℃。
實施例11具有17kDa和22kDa分子量的熒光素-Aβ(1-42)寡聚體[熒光素-Aβ(1-42)寡聚體A]的制備將2μl實施例10的貯存懸浮液與23μl PBS緩沖液(20mM磷酸鈉，140mM NaCI，pH7.4)混和，以2.4μl 2％強度的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液調(diào)節(jié)至SDS含量為0.2％。繼之為于37℃孵育6小時。通過于10000g、5分鐘的離心去除不可溶成分。以此方法獲得的熒光素-Aβ(1-42)寡聚體A制品可以保存于-20℃。
實施例12具有42kDa和52kDa分子量的熒光素-Aβ(1-42)寡聚體[熒光素-Aβ(1-42)寡聚體B]的制備以82μl水稀釋(0.05％SDS含量，0.1mM Aβ)根據(jù)實施例11獲得的熒光素-Aβ(1-42)寡聚體A，于37℃孵育16小時。熒光素-Aβ(1-42)寡聚體B制品可以于-80℃冷凍并保存用于進一步研究(圖4)。
實施例13實施例2a的Aβ(1-42)寡聚體A的交聯(lián)[Aβ(1-42)寡聚體A-CL]以7.5μl PBS、0.2％ SDS將10μl根據(jù)實施例2a制備的Aβ(1-42)寡聚體A稀釋為100μMAβ(1-42)含量。將1μl新制的10mM戊二醛水溶液添加至該溶液中，繼之于室溫攪拌3h。向樣品中添加1μl 100mM的氨基乙醇水溶液(pH7.4)并攪拌1h，以飽和過量的戊二醛。以此方法獲得的制品含有交聯(lián)Aβ(1-42)寡聚體A，將其稱為Aβ(1-42)寡聚體A-CL制品。
實施例14a)實施例5a的Aβ(1-42)寡聚體B的交聯(lián)[Aβ(1-42)寡聚體B-CL]將10μl根據(jù)實施例5a制備的Aβ(1-42)寡聚體B與1μl新制的10mM戊二醛水溶液混和，并于室溫攪拌3h。向樣品中添加1μl 100mM的氨基乙醇水溶液(pH7.4)并攪拌1h，以飽和過量的戊二醛。以此方法獲得的制品含有交聯(lián)Aβ(1-42)寡聚體B，將其稱為Aβ(1-42)寡聚體B-CL制品。
b)交聯(lián)Aβ(1-42)寡聚體[Aβ(1-42)寡聚體B-CL]的備選方案將72.6ml根據(jù)實施例5a制備的Aβ(1-42)寡聚體B與7.26ml新制的10mM戊二醛水溶液混和，并于室溫攪拌2h。向樣品中添加726μl緩沖液(20mM磷酸鈉，140mM NaCl，500mM氨基乙醇，pH74溶液(pH7.4)并攪拌30分鐘，以飽和過量的戊二醛。通過15ml 30kDa Centriprep管將反應(yīng)混合物濃縮至3ml。經(jīng)10000g、10分鐘的離心去除濃縮物。去除上清液，并在透析管中與6℃對1L 5mM磷酸鈉、35mM NaCl，pH7.4透析16h。隨后經(jīng)10000、10分鐘的離心去除透析物，取出上清液并可于-80℃保存以進一步研究。以此方法獲得的制品含有交聯(lián)的Aβ(1-42)寡聚體B，將其稱為Aβ(1-42)寡聚體B-CL制品。
實施例15a)以嗜熱菌蛋白酶切割，從Aβ(1-42)寡聚體B制備截短的Aβ(20-42)寡聚體將1.59ml根據(jù)實施例6b制備的Aβ(1-42)寡聚體B制品與38ml緩沖液(50mM MES/NaOH，pH7.4)及1mg/ml的嗜熱茵蛋白酶水溶液(Roche)200μl混和。將反應(yīng)混合物于室溫攪拌20h。然后加入80μl 100mM EDTA水溶液(pH7.4)，另外以400μl 1％強度的SDS溶液將混合物調(diào)節(jié)至SDS含量為0.01％。以15ml 30kDa Centriprep管將反應(yīng)混合物濃縮至約1ml。將濃縮物與9ml緩沖液(50mM MES/NaOH，0.02％SDS，pH7.4)混和，再次濃縮至1ml。將濃縮物在透析管中于6℃對1L緩沖液(5mM磷酸鈉，35mM NaCl)透析16h。以2％強度的SDS水溶液將透析物調(diào)節(jié)至SDS含量為0.1％。通過于10000g、10分鐘的離心取出樣品，并去除上清液。
進一步分析由此得到的材料(SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；見圖11)；對產(chǎn)生的截短的寡聚體的質(zhì)譜分析顯示，該寡聚體由截短的Aβ(20-42)組成。
b)以蛋白質(zhì)內(nèi)切酶GluC切割，從Aβ(1-42)寡聚體B制備截短的Aβ(12-42)寡聚體將2ml根據(jù)實施例6b制備的Aβ(1-42)寡聚體B制品與38ml緩沖液(5mM磷酸鈉，35mM氯化鈉，pH7.4)及1mg/ml的GluC蛋白質(zhì)內(nèi)切酶水溶液(Roche)150μl混和。將反應(yīng)混合物于室溫攪拌6h，隨后加入另外150μl 1mg/ml的GluC蛋白質(zhì)內(nèi)切酶水溶液(Roche)。將反應(yīng)混合物于室溫攪拌另外16h，繼之以添加8μl 5M DIFP溶液。以15ml 30kDaCentriprep管將反應(yīng)混合物濃縮至約1ml。將濃縮物與9ml緩沖液(5mM磷酸鈉，0.02％SDS，pH7.4)混和，再次濃縮至1ml。將濃縮物在透析管中于6℃對1L緩沖液(5mM磷酸鈉，35mM NaCl)透析16h。以1％強度的SDS水溶液將透析物調(diào)節(jié)至SDS含量為0.1％。通過于10000g、10分鐘的離心取出樣品，并去除上清液。
進一步分析由此得到的材料(SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；見圖11)；對產(chǎn)生的截短的寡聚體的質(zhì)譜分析顯示，該寡聚體由截短的Aβ(12-42)組成。
Aβ(1-42)寡聚體的特征實施例16SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)在變性條件下，根據(jù)標準條件在4-20％強度的Tris-甘氨酸SDS PAGE中分析實施例2a、5a、9、12、13和14a的制品，所有這些制品含有寡聚體A和B，從而表征變性條件下的分子量。
上述SDS PAGE的評價(圖1)揭示，起始蛋白質(zhì)Aβ(1-42)依然以約4kDa的條帶存在于寡聚體A制品中，而實施例2a的寡聚體A1和A2(在圖1中分別表示為1和2)在約15kDa(較弱條帶)和在約20kDa(主要條帶)處可見。
在寡聚體B制品中，可以檢測到相對較少的起始蛋白質(zhì)Aβ(1-42)(在約4kDa處的相對弱條帶)。相反，實施例5a的寡聚體B1和B2(在圖1中分別表示為3和4)出現(xiàn)在約38kDa和約48kDa(見箭頭)。對于實施例9和12的生物素和熒光素衍生的寡聚體B，出現(xiàn)約42kDa和約52kDa的相應(yīng)較高的分子量(圖3、4)。
分別含有交聯(lián)產(chǎn)物A-CL和B-CL的制品(實施例13和14a；圖2)的分析顯示，兩個樣品基本保持其寡聚化程度(見條帶A與條帶A′，以及條帶B與B′)。與寡聚體A和B相比略微不同的遷移行為可以由輕微改變的SDS結(jié)合能力和N末端氨基基團和賴氨酸殘基各自的修飾解釋。
截短的Aβ(20-42)寡聚體(實施例15a)的分析顯示，以嗜熱茵蛋白酶蛋白酶水解去除N末端肽，使38/48kDa雙條帶(圖11，泳道A)轉(zhuǎn)變?yōu)?8/38kDa雙條帶(圖11，泳道B)。相似地，截短的Aβ(12-42)寡聚體(實施例15a)的分析顯示，以Glu-C蛋白質(zhì)內(nèi)切酶蛋白酶水解去除N末端肽，使38/48kDa雙條帶(圖11，泳道A)轉(zhuǎn)變?yōu)?3/40kDa雙條帶(圖11，泳道C)。
實施例17凝膠滲透層析為了更詳細地研究非變性條件下的分子量行為，使用Superose 12HR10/30柱，以FPLC流程方法實施凝膠滲透層析(GPC)。在4℃進行GPC。
將柱子以5個體積的PBS緩沖液(流速0.5ml/min，UV檢測，214nm)平衡，并首先使用蛋白質(zhì)標準標定。隨后，分析實施例5a的Aβ(1-42)寡聚體B制品(圖5，底部)以及用于比較的相同濃度的Aβ(1-42)凍干物，其中Aβ(1-42)凍干物新鮮稱量，溶于PBS，于10000g、5分鐘的離心去除不溶性成分后進行分析(圖5，上部)。
評價顯示，Aβ(1-42)寡聚體B制品具有蛋白質(zhì)級份，該蛋白質(zhì)級份以在約50kDa上下的分子量范圍內(nèi)的主峰為特征。而在變性條件下的SDSPAGE中，該蛋白質(zhì)級份略有別于單體Aβ(1-42)蛋白質(zhì)，其中單體Aβ(1-42)蛋白質(zhì)以約16kDa上下的分子量范圍內(nèi)的主峰為特征。
為了研究實施例6b的Aβ(1-42)寡聚體B和實施例14a的Aβ(1-42)寡聚體B-CL在非變性條件下的分子量行為，使用Superose 12HR10/30柱，以FPLC流程方法于室溫實施凝膠滲透層析(GPC)。將柱子以5個體積的PBS緩沖液(流速0.5ml/min，UV檢測，214nm)平衡，并首先使用蛋白質(zhì)標準標定。隨后，以PBS緩沖液將實施例6b的Aβ(1-42)寡聚體B稀釋為1mg/ml，以PBS緩沖液將實施例14a的Aβ(1-42)寡聚體B-CL稀釋為1mg/ml，分析兩個混合物(圖12)。
評價顯示，SDS含量降低的Aβ(1-42)寡聚體B制品具有蛋白質(zhì)級份，該蛋白質(zhì)級份以在約100kDa上下的分子量范圍內(nèi)的主峰為特征。與此相比，具有降低的SDS含量的Aβ(1-42)寡聚體B-CL制品具有蛋白質(zhì)級份，該蛋白質(zhì)級份以約60kDa上下的分子量范圍內(nèi)的主峰為特征。
實施例18實施例5a的Aβ(1-42)寡聚體B的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳(NATIVEPAGE)在非變性條件下，在4-20％強度的Tris-甘氨酸中分析實施例5a含有寡聚體B的制品，從而表征天然條件下的分子量。
以非離子去垢劑Triton X-100中和制品中存在的去垢劑。為此目的，將1μl(4％ Triton X-100)移取到10μl實施例5a的制品中，并于室溫孵育5分鐘。隨后，取10μl與相同體積的天然樣品緩沖液(4ml 1M Tris、pH6.8、8ml甘油、1ml溴酚藍于50ml H2O中)混和并電泳(運行緩沖液7.5g Tris、36g甘氨酸于2.5L H2O中)。
天然PAGE的評價顯示，起始蛋白質(zhì)Aβ(1-42)依然以約28kDa的條帶(泳道A，表示為1)存在于寡聚體B制品中，而實施例5a制品的主要條帶在表觀分子量64-90kDa處可見(泳道A，表示為2)(圖6)。
重要的是，還可以天然分子量分析方法，例如凝膠滲透層析(見實施例17)或天然凝膠電泳(見實施例18)，為本發(fā)明的寡聚體(特別是寡聚體B)指定分子量。
混和SDS之后，可以在SDS PAGE中指定約38和48kDa分子量的寡聚體B，在天然凝膠中，基于選擇的標準蛋白質(zhì)，其被檢測為約64-90kDa分子量范圍內(nèi)的條帶。由于寡聚體的遷移行為除了其大小之外，基本尤其電荷本質(zhì)決定，不能期望該方法提供分子量的精確讀數(shù)。然而，該結(jié)果導(dǎo)致確定的寡聚體種類存在的結(jié)論。
實施例19a)在生理緩沖液中，Aβ(1-42)寡聚體B于多種蛋白質(zhì)濃度的穩(wěn)定性在下列條件下，于PBS緩沖液中測試根據(jù)實施例6b獲得的Aβ(1-42)寡聚體B的穩(wěn)定性。
用PBS以2×稀釋步驟將5mg/ml稀釋至0.08mg/ml。于室溫將所有獲得的溶液孵育24小時。繼之與冷凍的對照制品比較，分析SDS PAGE中的條帶模式。在所有樣品中，條帶模式一致。
b)在生理緩沖液中，Aβ(1-42)寡聚體B于多種溫度并在不同時期后的穩(wěn)定性以PBS緩沖液將根據(jù)實施例6b獲得的Aβ(1-42)寡聚體B稀釋至0.5mg/ml，并于室溫或于37℃孵育24h或96h。
隨后，在SDS PAGE中分析條帶模式。在所有樣品中，條帶模式一致。
實施例20用多種蛋白酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶、嗜熱茵蛋白酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶)酶解Aβ(1-42)寡聚體B以緩沖液(20mM磷酸鈉，140mM NaCl，pH7.4)將根據(jù)實施例6b獲得的Aβ(1-42)寡聚體B制品的等分試樣稀釋至0.5mg/ml，并在下列條件下于37℃和pH7.4與占圖9所示各種蛋白酶溶液重量1/50的蛋白酶溶液孵育20h，蛋白酶溶液如圖9所示。任何在SDS-PAGE中分析1μl反應(yīng)混合物。
SDS PAGE顯示，在選擇的限制性蛋白質(zhì)水解條件下，從Aβ(1-42)寡聚體B制品開始，所有蛋白酶將約為38/48kDa的雙帶恢復(fù)為約32/28kDa的雙帶。
實施例21Aβ(1-42)寡聚體B在大鼠血漿中的穩(wěn)定性將4μl根據(jù)實施例6b制備的Aβ(1-42)寡聚體B制品76μl大鼠血漿于室溫孵育0h、1h、2h、4h和8h。在干冰中冷凍終止孵育。
隨后，添加SDS樣品緩沖液后，將所有樣品在SDS PAGE中分析。繼之通過在蛋白質(zhì)印跡中對Aβ(1-42)寡聚體B染色進行穩(wěn)定性評價。抗Aβ(1-42)抗體6E10(Signet)用于檢測。通過與堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗小鼠IgG抗體并添加底物NBT/BCIP使條帶顯影。所觀察條帶的分子量和強度經(jīng)2h、4h和8h時期幾乎保持不變。
結(jié)果提示，Aβ(1-42)寡聚體B具有高的血漿穩(wěn)定性。據(jù)此，血漿中的生物半衰期在約8小時和更長的范圍內(nèi)。
實施例22分別具有分子量17kDa和22kDa[生物素-Aβ(1-42)寡聚體A]以及42kDa和52kDa[生物素-Aβ(1-42)寡聚體B]的生物素-Aβ(1-42)寡聚體對人類神經(jīng)細胞表面的結(jié)合通過FACScan(Beckton Dickinson)研究人類β-淀粉樣(1-42)蛋白質(zhì)和兩種Aβ(1-42)寡聚體A和Aβ(1-42)寡聚體B對人類成神經(jīng)細胞瘤細胞系IMR-32(ATCC編號CCL-127)的結(jié)合。將IMR-32細胞懸浮液(1.5×106細胞/0.1ml PBS)與生物素標記的人類β淀粉樣(1-42)蛋白質(zhì)(肽合成材料，凍干物，AnaSpec)以及含有生物素標記的寡聚體A和B的制品(分別為實施例8和9)與37℃孵育20分鐘。隨后以緩沖液(PBS加1％ BSA)清洗細胞，并與偶聯(lián)到鏈霉親和素異硫氰酸酯上的熒光素(Sigma)于室溫孵育20分鐘。在使用緩沖液的清洗步驟之后，通過FACScan分析對IMR-32細胞表面的結(jié)合。虛線表示不存在生物素標記的組分時的背景熒光。個別制品的添加導(dǎo)致細胞相關(guān)熒光的強烈增加并以實線表示。寡聚體A(圖7B)和B(圖7C)對細胞表面的結(jié)合與單體β-淀粉樣(1-42)蛋白質(zhì)的結(jié)合(圖7A)截然不同。數(shù)據(jù)表示所述寡聚體對人類細胞表面的特定結(jié)合位點。
實施例23腦室內(nèi)(icv)給藥后，在大鼠腦勻漿物中檢測Aβ(1-42)寡聚體B以腦室內(nèi)快速給藥施用10nmol根據(jù)實施例6b獲得的Aβ(1-42)寡聚體B 10。分別在15和120分鐘后制備腦。同樣制備未處理的對照動物的腦。為了這個目的，各例中，將1g大鼠腦與9ml破碎緩沖液A(200ml 5mM磷酸鈉，35mM NaCl，300mM蔗糖，調(diào)節(jié)至pH7.4，并與4片來自Roche的Complete蛋白酶抑制品混合物混和)在50ml Falcon管中混和，并在冰上以超聲破碎2分鐘。靜置溶液20分鐘，然后簡短震蕩，并分裝為8×1ml的等分試樣(＝勻漿物)。
為了實施定量檢測，首先在PBS中制備一系列標準Aβ(1-42)寡聚體B制品，制品濃度在1.58ng/μl-0.005ng/μl范圍內(nèi)。
另外，作為陽性對照，也處理未處理大鼠對照腦的勻漿物，并以相同的方法在此腦勻漿物中制備一系列標準Aβ(1-42)寡聚體B。然后將勻漿物進行100000g、1h的超離心，上清液用于隨后的分析。
根據(jù)對兩個系列的標準物(PBS與對照腦勻漿物上清液)測量的值的比較，可以如下定量確定Aβ(1-42)寡聚體B的含量，首先在陽性對照中比較，然后也與經(jīng)處理的大鼠的腦樣品中比較。
1)斑點印跡檢測將1μl標準樣品系列和經(jīng)處理動物的樣品提取物液滴加于硝化纖維紙上，使用抗體6E10(抗Aβ(1-42)；Signet)檢測Aβ(1-42)。使用偶聯(lián)到抗小鼠IgG上的堿性磷酸酶并添加染色試劑NBT/BCIP進行染色。
盡管在未處理大鼠的腦提取物中沒有可檢測的Aβ(1-42)(0.01nmol/g)，通過與相應(yīng)濃度的陽性對照比較染色強度，在處理后15分鐘處死的大鼠中可以檢測到約0.4nmol/g Aβ(1-42)，以相同的方法，在處理后120分鐘處死的大鼠中仍然可以檢測到約0.2nmol/g。由此得到外源性給藥的Aβ(1-42)寡聚體B約105分鐘的平均生物半衰期。
2)蛋白質(zhì)印跡檢測所有斑點印跡分析的樣品液同樣以蛋白質(zhì)印跡分析。蛋白質(zhì)印跡也以mMAb 6E10(抗Aβ(1-42)；Signet)、并另外以偶聯(lián)到抗小鼠IgG上的堿性磷酸酶和添加染色試劑NBT/BCIP顯色。
抗Aβ(1-42)反應(yīng)性條帶僅僅出現(xiàn)在38/48kDa區(qū)域，相當于Aβ(1-42)寡聚體B的表觀分子量，即，即使給藥2小時后，寡聚體結(jié)構(gòu)仍然在體內(nèi)保持。
另外，通過與陽性對照中相應(yīng)于Aβ(1-42)寡聚體B的強染色條帶的比較染色強度，在15分鐘大鼠(0.4nmol/g)和120分鐘大鼠(0.2nmol/g)的腦中，可以評估出與點印跡方法中相同的濃度。
實施例24具有38kDa和48kDa分子量的Aβ(1-42)寡聚體[Aβ(1-42)寡聚體B]對鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的神經(jīng)毒性作用按照文獻制備鼠皮質(zhì)神經(jīng)元并與神經(jīng)膠質(zhì)細胞以混和培養(yǎng)物培養(yǎng)(Choi等，(1987)J.Neurosci.7，357-368)。從腦膜和下腦區(qū)(lower brainregion)用器械取下發(fā)育第14-15天胚胎的皮質(zhì)。在0.05％強度的胰蛋白酶溶液中于37℃孵育5-7分鐘，將細胞彼此分離，隨后用開口減小的巴斯德吸管將上述溶液吹打數(shù)次。確定細胞數(shù)量后，于0.5ml維持培養(yǎng)基(含有0.8mM谷氨酰胺、18mM葡萄糖、23mM NaHCO3和10％馬血清的基本必需培養(yǎng)基)中以每2cm2430 000個細胞將細胞接種于細胞培養(yǎng)材料上，細胞培養(yǎng)材料以多聚L鳥氨酸和層黏連蛋白包被。在潮濕的細胞培養(yǎng)孵育器中于37℃、5％ CO2中實施培養(yǎng)和后續(xù)的孵育。培養(yǎng)3-5天后，使用(+)-5-氟-2′-脫氧尿苷/尿苷混合物(各10μM)培養(yǎng)1天，以中斷神經(jīng)膠質(zhì)細胞的繁殖。培養(yǎng)14天后，研究Aβ(1-42)寡聚體B的毒性作用。為此目的，將細胞在腦細胞緩沖液(120mM NaCl，5.4mM KCl，1.8mM CaCl2，15mM葡萄糖，25mM HEPES，pH7.2)中孵育15分鐘。將對照細胞1與300μM L-谷氨酰胺在腦細胞緩沖液中孵育相同時間。將Aβ寡聚體儲備液以無血清培養(yǎng)基(含有0.8mM谷氨酰胺、20mM葡萄糖、26mM NaHCO3)稀釋至多個終濃度，并孵育24小時。在無血清培養(yǎng)基中平行孵育以L谷氨酰胺處理的對照細胞1。另一組細胞(對照細胞2)僅用腦細胞緩沖鹽和無血清培養(yǎng)基處理。24h后去除細胞培養(yǎng)物上清液，殘余細胞在蒸餾水中孵育20分鐘而被破壞，酶學(xué)測定兩種溶液中的乳酸脫氫酶(LDH)活性。為了評價，測定細胞培養(yǎng)物上清液的LDH活性與上清液和殘余細胞的LDH活性總和的比，形成四重測定的平均值。實施3次實驗，每個實驗條件存在一式四份(n＝12)。將谷氨酰胺處理的細胞(對照細胞1)平均值設(shè)定為100％神經(jīng)元死亡，將既沒有以L谷氨酰胺也沒有以Aβ寡聚體處理的細胞(對照細胞2)的平均值設(shè)定為0％神經(jīng)元死亡，將以Aβ寡聚體處理的細胞的值加以相應(yīng)轉(zhuǎn)換。在各例所用的濃度下測定的所有神經(jīng)毒性平均值顯示，具有38kDa和48kDa分子量的Aβ(1-42)寡聚體[Aβ(1-42)寡聚體B]截然不同的毒性作用，見圖8。
實施例25抗體的產(chǎn)生用于免疫的混合物含有所有佐劑(Biogenes)，基本成分如下95％ 石蠟油2.4％ 吐溫400.1％ 膽固醇0.1％ 脂多糖將佐劑與抗原溶液以2∶1比例混和直至獲得穩(wěn)定乳劑。乳劑經(jīng)注射并形成穩(wěn)定釋放抗原的儲庫。
a)以實施例15a的截短的Aβ(20-42)寡聚體B免疫兔產(chǎn)生多克隆抗血清根據(jù)標準程序，以實施例15a的未綴合的Aβ(20-42)寡聚體B制品免疫兩只兔第1天 初次免疫，并取免疫前血清第2天 第一次加強第14天 第二次加強第28天 第三次加強并采血第35天 取血將兔血于室溫放置，隨后于室溫離心，從中獲得抗血清。將以此方式獲得的血清稱為血清(a1)。
在標準條件下，使用戊二醛將2mg實施例15a的Aβ(20-42)寡聚體B制品與LPH偶聯(lián)，根據(jù)標準程序，以該綴合的Aβ(1-42)寡聚體B免疫另兩只兔第1天 初次免疫，并取免疫前血清第2天 第一次加強第14天 第二次加強第28天 第三次加強并采血第35天 取血將兔血于室溫放置，隨后于室溫離心從中獲得抗血清。將以此方式獲得的血清稱為血清(a2)。
b)以實施例15b的截短的Aβ(12-42)寡聚體B免疫兔產(chǎn)生多克隆抗血清根據(jù)標準程序，以實施例15b的未綴合的Aβ(12-42)寡聚體B制品免疫兩只兔第1天 初次免疫，并取免疫前血清第2天 第一次加強第14天 第二次加強第28天 第三次加強并采血第35天 取血將兔血于室溫放置，隨后于室溫離心從中獲得抗血清。將以此方式獲得的血清稱為血清(b1)。
在標準條件下，使用戊二醛將2mg實施例15b的Aβ(12-42)寡聚體B制品與LPH偶聯(lián)，根據(jù)標準程序，以該綴合Aβ(12-42)寡聚體B免疫另兩只兔第1天 初次免疫，并取免疫前血清第2天 第一次加強第14天 第二次加強第28天 第三次加強并采血第35天 取血將兔血于室溫放置，隨后于室溫離心從中獲得抗血清。將以此方式獲得的血清稱為血清(b2)。
c)以實施例14a的Aβ(20-42)寡聚體制品B-CL免疫兔產(chǎn)生多克隆抗血清根據(jù)標準程序，以實施例14a的未綴合的Aβ(1-42)寡聚體B-CL制品免疫兩只兔第1天 初次免疫，并取免疫前血清第2天 第一次加強第14天 第二次加強第28天 第三次加強并采血第35天 取血將兔血于室溫放置，隨后于室溫離心從中獲得抗血清。將以此方式獲得的血清稱為血清(c1)。
d)以實施例6b的Aβ(1-42)寡聚體制品B免疫兔產(chǎn)生多克隆抗血清根據(jù)標準程序，以實施例6b的未綴合的Aβ(1-42)寡聚體B制品免疫兩只兔第1天 初次免疫，并取免疫前血清第2天 第一次加強第14天 第二次加強第28天 第三次加強并采血第35天 取血將兔血于室溫放置，隨后于室溫離心從中獲得抗血清。將以此方式獲得的血清稱為血清(d1)。
在標準條件下，使用戊二醛將2mg實施例6b的Aβ(1-42)寡聚體B制品與LPH偶聯(lián)，根據(jù)標準程序，以該綴合Aβ(1-42)寡聚體B制品免疫另兩只兔第1天 初次免疫，并取免疫前血清第2天 第一次加強第14天 第二次加強第28天 第三次加強并采血第35天 取血將兔血于室溫放置，隨后于室溫離心從中獲得抗血清。將以此方式獲得的血清稱為血清(d2)。
實施例26實施例25的免疫多克隆血清關(guān)于與多種Aβ(1-42)形式交聯(lián)反應(yīng)的特征描述為了描述多克隆抗血清的特征，在100pmol/μl-0.01pmol/μl范圍內(nèi)，于PBS中制備多種Aβ(1-42)形式的連續(xù)稀釋物。在各例中，將1μl樣品加至硝化纖維膜使用實施例25的適當?shù)耐醚鍖嵤z測。使用mMAb6E10(Signet)實施檢測以對比。偶聯(lián)到抗兔IgG的堿性磷酸酶(用于比較偶聯(lián)到抗小鼠IgG的堿性磷酸酶)加染色試劑NBT/BCIP的添加一起用于染色。圖10顯示以此方式獲得的斑點印跡，可以用數(shù)字評價如下

*未在圖10中顯示表中數(shù)字顯示可見抗原的最小量[pmol；除了APP，各例以單體為基礎(chǔ)](檢出限)與以實施例15a的未綴合Aβ(20-42)寡聚體免疫獲得的兔血清(a1)，的免疫學(xué)反應(yīng)比較明確顯示，抗這些寡聚體的抗體僅與其它形式例如原纖維、APP和單體微弱地交叉反應(yīng)。相反，觀察到與Aβ(1-42)寡聚體B(見行1)的顯著的強烈交叉反應(yīng)以及此外與穩(wěn)定CL抗原的交叉反應(yīng)。該數(shù)據(jù)顯示在此提出的寡聚體形式與APP、單體和原纖維結(jié)構(gòu)相比截然不同的結(jié)構(gòu)。抗體與寡聚體特異的結(jié)構(gòu)結(jié)合。
與以實施例15a的綴合Aβ(20-42)寡聚體免疫獲得的兔血清(a2)的免疫學(xué)反應(yīng)也顯示，抗這些寡聚體的抗體僅與其它形式例如原纖維和單體微弱地交叉反應(yīng)。相反，觀察到與Aβ(1-42)寡聚體B(見行1)的弱交叉反應(yīng)，以及此外與穩(wěn)定CL抗原和APP的交叉反應(yīng)。該數(shù)據(jù)同樣顯示在此提出的寡聚體形式與單體和原纖維結(jié)構(gòu)相比截然不同的結(jié)構(gòu)。
與以實施例6b的Aβ(1-42)寡聚體免疫獲得的兔血清(d1)、以及以實施例14a的Aβ(1-42)寡聚體B-CL免疫獲得的兔血清(c1)的免疫學(xué)反應(yīng)比較顯示，抗這些寡聚體的抗體與其它形式(例如原纖維、APP和單體)的交叉反應(yīng)與同Aβ(1-42)寡聚體B的反應(yīng)一樣強烈(見行1)。這些抗體展示與mMAb 6E10(Signet)相當?shù)拿庖叻磻?yīng)，并非結(jié)合寡聚體特異的結(jié)構(gòu)。
相應(yīng)地，以實施例6b的Aβ(1-42)寡聚體免疫小鼠，以本身已知的方式建立單克隆抗體。在此，10個雜交瘤中的2個分泌單克隆抗體，其結(jié)合峰型圖(特別是就上面測試的反應(yīng)性而言)與抗血清(a1)相似。
實施例27Aβ(1-42)原纖維的制備以300μl緩沖液(20mM磷酸鈉、140mM NaCl，pH7.4)將100μl溶于0.1％NH4OH中的2mg/ml的Aβ(1-42)溶液稀釋至0.5mg/ml，并以0.1M HCl調(diào)節(jié)至pH7.4(100μM Aβ(1-42))。將樣品于37℃孵育24h，然后通過于10000g、10分鐘的離心取出。將得到的蛋白質(zhì)殘留物以400μl緩沖液(20mM磷酸鈉、140mM NaCl，pH7.4)重懸浮。以此方法獲得的Aβ(1-42)原纖維制品可以于-20℃保存并用于進一步研究。
實施例28Aβ(1-42)寡聚體B-CL(實施例14b)對海馬切片的作用將400μM厚度的海馬橫切片于34℃在染毒(gassed)Ringer’s溶液(NaCl 124mM，KCl 4.9mM，MgSO41.3mM，CaCl 2.5mM，KH2PO41.2mM，NaHCO325.6mM，葡萄糖10mM)灌注下置于浸漬切片槽中。隨后，在單極刺激電極的輔助下刺激謝弗側(cè)枝(Schaffer collateral)，記錄輻射層中的興奮性突觸后電位(fEPSP)。以產(chǎn)生最大fEPSP的刺激水平的30％給以測試脈沖。每10分鐘施以三次100個脈沖，誘導(dǎo)長時程增強，單個脈沖具有200μs的寬度(強烈的強直收縮)。產(chǎn)生的fEPSP增強至少記錄240分鐘。實施例14b的寡聚體B-CL(500nM)的加入(rinsing-in)在第一次痙攣前20分鐘開始，于最后痙攣10分鐘后停止。測定fEPSP的升高(斜率)，并作為對時間的函數(shù)作圖。
圖14顯示，Aβ(1-42)寡聚體的洗入(washing-in)抑制海馬長時程增強，特別是在維持期。因此，Aβ(1-42)寡聚體BCL影響神經(jīng)細胞的信息儲存(細胞記憶)。
實施例29Aβ(1-42)寡聚體B(實施例5b)與大鼠原代海馬神經(jīng)元的結(jié)合研究實施例5b的Aβ(1-42)寡聚體B與大鼠原代海馬神經(jīng)元的結(jié)合。將海馬神經(jīng)元在含有B27添加物的Neurobasal培養(yǎng)基中于多聚L賴氨酸包被的蓋玻片上培養(yǎng)，并在培養(yǎng)的第14天使用。向新鮮培養(yǎng)基添加200nM(總單體Aβ濃度)寡聚體并于37℃孵育15分鐘，使寡聚體與神經(jīng)元細胞膜結(jié)合。去除含有Aβ的培養(yǎng)基后，實施使用培養(yǎng)基的兩步清洗步驟，然后將細胞于3.7％的甲醛中固定。在細胞的進一步清洗之后，在PBS緩沖液中，于室溫以10％正常驢血清封閉非特異性結(jié)合位點90分鐘。于室溫將6E10(來自小鼠)以1∶2000稀釋液作為第一抗體應(yīng)用2h。再次清洗細胞，并與抗小鼠并偶聯(lián)熒光色素Cy3的第二抗體(來自驢)于室溫孵育2h。細胞經(jīng)過再次清洗之后，以包埋介質(zhì)將含有神經(jīng)元的蓋玻片固定于載玻片上。在熒光顯微鏡下描繪具有結(jié)合的Aβ寡聚體的海馬神經(jīng)元。使用的對照為混合物，該混合物中免除了第一抗體6E10。該對照因此展示了不基于Aβ的非特異性熒光。
如圖15a所示，寡聚體以斑點方式與神經(jīng)元細胞表面結(jié)合。相反，由于第二抗體與神經(jīng)元的結(jié)合，沒有第一抗體的對照僅展示低的非特異性熒光(圖15b)。
序列表<110>阿伯特有限及兩合公司<120>淀粉樣β(1-42)蛋白寡聚體、其衍生物及抗體、其制備方法和用途<130>M-44023<150>DE 103 03 974.0<151>2003-01-31<160>2<170>patentIn版本3.1<210>1<211>42<212>PRT<213>人<400>1Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40<210>2<211>42<212>PRT
<213>大鼠<400>2Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Ash Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40
權(quán)利要求
1.淀粉樣β(1-42)寡聚體或其衍生物，其中寡聚體在SDS凝膠電泳中具有約15kDa的表觀分子量。
2.淀粉樣β(1-42)寡聚體或其衍生物，其中寡聚體在SDS凝膠電泳中具有約20kDa的表觀分子量。
3.淀粉樣β(1-42)寡聚體或其衍生物，其中寡聚體在SDS凝膠電泳中具有約38kDa的表觀分子量。
4.淀粉樣β(1-42)寡聚體或其衍生物，其中寡聚體在SDS凝膠電泳中具有約48kDa的表觀分子量。
5.組合物，包括權(quán)利要求1要求的寡聚體和權(quán)利要求2中要求的寡聚體或它們的衍生物的混合物。
6.組合物，包括權(quán)利要求3要求的寡聚體和權(quán)利要求4中要求的寡聚體或它們的衍生物的混合物。
7.權(quán)利要求1至6中任一項要求的寡聚體或組合物，其特征在于衍生物具有可檢測標記。
8.權(quán)利要求7要求的寡聚體或組合物，其特征在于標記為熒光、發(fā)光、比色、放射或磁性標記，或是對互補結(jié)合伙伴具有親和力的標記。
9.權(quán)利要求1至8中任一項要求的寡聚體或組合物，其特征在于，寡聚體或衍生物為交聯(lián)的。
10.權(quán)利要求1至8中任一項要求的寡聚體或組合物，其特征在于，衍生物可以通過寡聚體的蛋白酶剪切獲得。
11.權(quán)利要求10要求的寡聚體或組合物，其特征在于衍生物是Aβ(X-42)片段的寡聚體，其中X為8至24，優(yōu)選10至22，特別是從12至20。
12.權(quán)利要求11要求的寡聚體或組合物，其特征在于衍生物是Aβ(12-42)片段或Aβ(20-42)片段的寡聚體。
13.制備衍生或非衍生的淀粉樣β(1-42)蛋白寡聚體的方法，其特征在于將單體淀粉樣β(1-42)蛋白或其衍生物暴露于去垢劑，并任選地以本身已知的方法獲得至少一種寡聚體或其衍生物。
14.制備衍生或非衍生的淀粉樣β(1-42)蛋白寡聚體的方法，其特征在于將單體淀粉樣β(1-42)蛋白或其衍生物暴露于去垢劑，然后降低去垢劑作用并繼續(xù)孵育，并任選地以本身已知的方法獲得至少一種寡聚體或其衍生物。
15.權(quán)利要求14要求的方法，其特征在于去垢劑為離子型去垢劑。
16.權(quán)利要求15要求的方法，其特征在于去垢劑為十二烷基磺酸鈉。
17.權(quán)利要求13至16中任一項要求的方法，其特征在于暴露于去垢劑的時間為約1至20小時。
18.權(quán)利要求17要求的方法，其特征在于暴露溫度為約20至50℃。
19.權(quán)利要求14至16中任一項要求的方法，其特征在于連續(xù)孵育時間為10至30小時。
20.權(quán)利要求19要求的方法，其特征在于暴露溫度為約20至50℃。
21.權(quán)利要求13至20中任一項要求的方法，其特征在于淀粉樣β(1-42)蛋白預(yù)先至少部分未折疊。
22.權(quán)利要求21要求的方法，其特征在于為此目的將蛋白質(zhì)暴露于氫鍵斷裂劑，優(yōu)選HFIP。
23.權(quán)利要求13至22中任一項要求的方法，其特征在于將寡聚體暴露于交聯(lián)劑。
24.權(quán)利要求13至23中任一項要求的方法，其特征在于將寡聚體暴露于蛋白酶。
25.權(quán)利要求1至12中任一項要求的寡聚體、其衍生物或組合物在體外診斷性檢測方法中的用途。
26.權(quán)利要求1至12中任一項要求的寡聚體、其衍生物或組合物在體內(nèi)診斷性檢測方法中的用途。
27.權(quán)利要求1至12中任一項要求的寡聚體、其衍生物或組合物在產(chǎn)生寡聚體特異的抗體中的用途。
28.表征物質(zhì)或物質(zhì)混合物的方法，該方法包括i)提供所述物質(zhì)或所述物質(zhì)混合物；ii)將權(quán)利要求1至12中任一項要求的寡聚體、其衍生物或組合物暴露于所述物質(zhì)或物質(zhì)混合物；以及iii)測定該物質(zhì)或該物質(zhì)混合物的特定部分是否與寡聚體、其衍生物或存在于組合物中的至少一種寡聚體或其衍生物結(jié)合。
29.物質(zhì)或物質(zhì)混合物的部分，其特征在于該物質(zhì)或混合物部分通過權(quán)利要求28中要求的方法確定可以作為與寡聚體、其衍生物、或存在于組合物中的至少一種寡聚體或其衍生物結(jié)合的配體。
30.權(quán)利要求29要求的物質(zhì)或物質(zhì)混合物的部分在制備淀粉樣β相關(guān)的紊亂(特別是癡呆)的治療藥物中的用途。
31.權(quán)利要求29要求的物質(zhì)或物質(zhì)混合物的部分在制備淀粉樣β相關(guān)的紊亂(特別是癡呆)的診斷組合物中的用途。
32.產(chǎn)生抗體的方法，該方法包括i)以至少一種權(quán)利要求1至12中任一項要求的寡聚體、其衍生物或組合物免疫宿主；以及ii)獲得作為應(yīng)答所述免疫而產(chǎn)生的含有抗體的宿主血清。
33.權(quán)利要求32要求的方法，其特征在于選擇至少一種血清抗體，該抗體識別用作免疫原的寡聚體或其衍生物或識別用作免疫原的組合物中存在的至少一種寡聚體或其衍生物。
34.制備抗體的方法，其中抗體對權(quán)利要求1至12中任一項要求的寡聚體或其衍生物具有特異性，該方法包括i)提供包含所述寡聚體或其衍生物的抗原；ii)將抗體所有組成成分暴露于該抗原；以及iii)從該抗體所有組成成分中選擇與該寡聚體或其衍生物特異性結(jié)合的抗體。
35.權(quán)利要求34要求的方法，其中抗體所有組成成分經(jīng)抗體免疫動物而體內(nèi)暴露于抗原。
36.權(quán)利要求34要求的方法，其中另外建立來自動物淋巴細胞的若干雜交瘤，選擇分泌與寡聚體或其衍生物特異性結(jié)合的抗體的雜交瘤。
37.權(quán)利要求34要求的方法，其中的動物從小鼠、大鼠、小雞、Camelid、恒河猴、兔和山羊中選擇。
38.權(quán)利要求37要求的方法，其中的動物為APP缺陷的基因敲除小鼠。
39.權(quán)利要求37要求的方法，其中的動物為具有人類免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其在抗原刺激后產(chǎn)生人類抗體。
40.權(quán)利要求37要求的方法，其中的動物為具有重度聯(lián)合免疫缺損(SCID)的小鼠，該小鼠以人類外周單核血細胞或淋巴樣細胞或其前體重建。
41.權(quán)利要求37要求的方法，其中的動物為小鼠，該小鼠以致死性全身放射處理，然后以來自具有重度聯(lián)合免疫缺損(SCID)小鼠的骨髓細胞抵御放射，隨后將功能性人類淋巴細胞或其前體移植其體內(nèi)。
42.權(quán)利要求34要求的方法，其中以抗原篩選重組抗體文庫而將抗體體外暴露于該抗原。
43.權(quán)利要求42要求的方法，其中重組抗體文庫在噬菌體表面表達。
44.權(quán)利要求42要求的方法，其中重組抗體文庫在酵母細胞表面表達。
45.權(quán)利要求42要求的方法，其中重組抗體文庫在細菌細胞表面表達。
46.權(quán)利要求42要求的方法，其中重組抗體文庫以RNA-蛋白質(zhì)融合物表達。
47.權(quán)利要求42要求的方法，其中重組抗體文庫是scFv文庫或Fab文庫。
48.權(quán)利要求42要求的方法，其中重組抗體文庫是單結(jié)構(gòu)域文庫。
49.權(quán)利要求34要求的方法，其中通過以抗原體內(nèi)免疫動物將抗體所有組成成分暴露于所述抗原，然后以該抗原篩選從該動物淋巴樣細胞制備的重組抗體文庫。
50.權(quán)利要求34要求的方法，其中通過以抗原體內(nèi)免疫動物將抗體所有組成成分暴露于所述抗原，然后將從該動物淋巴樣細胞制備的重組抗體文庫經(jīng)受體外親和力成熟。
51.權(quán)利要求34要求的方法，其中通過以抗原免疫動物將抗體所有組成成分暴露于所述抗原，然后選擇分泌抗原結(jié)合抗體的單個細胞，并從單獨的細胞獲得重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNA。
52.通過權(quán)利要求32至51中任一項要求的方法獲得的抗體。
53.與權(quán)利要求1至12中任一項要求的寡聚體或其衍生物特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。
54.權(quán)利要求53要求的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)以KD＝10-6-10-2M范圍內(nèi)的親和力與寡聚體或其衍生物結(jié)合。
55.權(quán)利要求54要求的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)以高于KD＝10-8M的親和力與寡聚體或其衍生物結(jié)合。
56.權(quán)利要求54要求的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)以高于KD＝10-9M的親和力與寡聚體或其衍生物結(jié)合。
57.權(quán)利要求54要求的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)以高于KD＝10-10M的親和力與寡聚體或其衍生物結(jié)合。
58.權(quán)利要求54要求的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)以高于KD＝10-11M的親和力與寡聚體或其衍生物結(jié)合。
59.權(quán)利要求53至58中任一項要求的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)以低于KD＝10-8M的親和力與單體Aβ(1-42)蛋白質(zhì)和/或單體Aβ(1-40)蛋白質(zhì)結(jié)合。
60.權(quán)利要求53至59中任一項要求的蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)對寡聚體或其衍生物的親和力比對單體Aβ(1-42)蛋白質(zhì)和/或單體Aβ(1-40)蛋白質(zhì)的親和力高出至少10倍。
61.權(quán)利要求53至59中任一項要求的蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)對寡聚體或其衍生物的親和力比對單體Aβ(1-42)蛋白質(zhì)和/或單體Aβ(1-40)蛋白質(zhì)的親和力高出至少100倍。
62.權(quán)利要求53至59中任一項要求的蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)對寡聚體或其衍生物的親和力比對單體Aβ(1-42)蛋白質(zhì)和/或單體Aβ(1-40)蛋白質(zhì)的親和力高出至少1000倍。
63.權(quán)利要求53至62中任一項要求的蛋白質(zhì)，根據(jù)表面等離振子共振方法測定，該蛋白質(zhì)以0.1s-1或更低的Koff速率常數(shù)與寡聚體或其衍生物結(jié)合。
64.權(quán)利要求53至63任一項要求的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)以1×10-5或更低的抑制常數(shù)IC50抑制寡聚體或其衍生物的活性。
65.權(quán)利要求53至64中任一項要求的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是抗體或其抗原結(jié)合部分。
66.權(quán)利要求65要求的抗體，該抗體基本為人類抗體或其抗原結(jié)合部分。
67.權(quán)利要求65要求的抗體，該抗體為嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分。
68.權(quán)利要求65要求的抗體，該抗體為CDR移植物抗體或其抗原結(jié)合部分。
69.權(quán)利要求53至64中任一項要求的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是從T細胞受體衍生的分子，或從T細胞受體衍生的受體結(jié)構(gòu)域，或該受體結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白Fc部分的融合蛋白質(zhì)。
70.藥物制劑，包括權(quán)利要求53至69中任一項要求的蛋白質(zhì)以及任選的藥物適合的載體。
71.權(quán)利要求53至69中任一項要求的蛋白質(zhì)在制備淀粉樣β相關(guān)的紊亂(特別是癡呆)的治療藥物中的用途。
72.權(quán)利要求53至69中任一項要求的蛋白質(zhì)在制備淀粉樣β相關(guān)的紊亂(特別是癡呆)的診斷組合物中的用途。
73.疫苗，包含權(quán)利要求1-12中的任一項要求的至少一種寡聚體或至少一種其衍生物或組合物。
74.權(quán)利要求1-12中的任一項要求的寡聚體或其衍生物或組合物在制備淀粉樣β相關(guān)的紊亂(特別是癡呆)的治療疫苗中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及淀粉樣β(1－42)蛋白神經(jīng)調(diào)節(jié)的寡聚體、具體的生產(chǎn)方法(通過此方法能夠以可重復(fù)方式高得率獲得該寡聚體)、該寡聚體作為診斷性和治療性試劑在寡聚體特異性抗體的產(chǎn)生中及發(fā)現(xiàn)及形成可與該寡聚體相互作用的物質(zhì)中的用途。正如抗體本身和抗體或物質(zhì)作為診斷或治療劑的用途，也公開了產(chǎn)生抗體和發(fā)現(xiàn)物質(zhì)的相應(yīng)方法。本發(fā)明還涉及該寡聚體的衍生物以及基于淀粉樣β(1－42)蛋白的簡短形式的寡聚體、其產(chǎn)生和用途。
文檔編號G01N33/68GK1768076SQ200480008812
公開日2006年5月3日 申請日期2004年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月31日
發(fā)明者H·希倫, A·施特賓格, C·克蘭茨, A·默勒, R·米勒 申請人:阿伯特有限及兩合公司