專利名稱：檢測肝纖維化的血清標記的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供了檢測哺乳動物中肝纖維化或肝纖維化級別改變的方法和試劑盒。診斷標記基于對存在于體液(如血清)中的診斷性碳水化合物所做的分布圖以及鑒定。
背景技術：
肝纖維化的特征是膠原蛋白和其它胞外基質(zhì)蛋白的沉積以及它們組成復雜的聚合物，這些聚合物不溶于水并且引起肝臟結(jié)構(gòu)的損失。形成纖維化的膠原蛋白和基質(zhì)蛋白大多是由激活的肝臟星狀細胞所產(chǎn)生。休眠的星狀細胞為脂細胞表型，經(jīng)激活而表現(xiàn)出成纖維細胞的表型。激活的過程分為2個階段起初，星狀細胞由炎癥過程所誘導產(chǎn)生的細胞因子(尤其是TGF-β)、趨化因子和其它信號分子所激活；隨后，星狀細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞表型，處于這一表型的細胞能夠增殖、吸引白細胞、并產(chǎn)生胞外膠原蛋白和基質(zhì)蛋白。在所有形式的慢性肝炎中，活躍的纖維化始于門靜脈周圍區(qū)域(門靜脈周區(qū)或1區(qū)纖維化，Metavir纖維化第1階段)，并逐漸向外進入小葉向中央靜脈延伸(3區(qū))，同時伴隨有分隔的形成(Metavir纖維化第2階段)。然后，發(fā)生橋連(Metavir纖維化第3階段)。纖維化的最終階段(Metavir纖維化第4階段)就是早期的肝硬化連接門靜脈區(qū)和中央?yún)^(qū)域的大范圍纖維化，同時伴隨有肝臟薄壁組織的結(jié)節(jié)性再生。除了Metavir系統(tǒng)以外，也經(jīng)常使用其它一些組織學評分，如HAI評分。HAI評分對不出現(xiàn)纖維化(0級)與較輕且無橋連的纖維化(1級)加以區(qū)分；也將橋連的纖維化(3級)和早期肝硬化(4級)加以區(qū)別。大多數(shù)的慢性肝病都伴隨有肝纖維化，其特征為在功能性的肝組織之間長出疤痕組織。雖然，像這樣的結(jié)締組織的生長是組織損傷的正常反應，但是該組織可能會“過度(overshoot)”，從而引發(fā)肝纖維化。纖維化的進展速度是慢性肝臟疾病的疾病評定標準，因為正是纖維化的進程最終導致肝臟結(jié)構(gòu)的畸變，并導致肝硬化。對纖維化的階段以及纖維化進展速度的評估是十分重要的，這是因為一些患有慢性肝病的患者進展迅速，最終發(fā)展成肝硬化和相關的危及生命的并發(fā)癥，而另一些患者的病情即使有進展也非常緩慢，而且可能永遠也不會罹患與肝臟相關的并發(fā)癥。因此，通常對新診斷的慢性肝病患者實施肝臟活檢。然而，這種診斷技術是侵入性的，通常還給患者帶來痛苦，有時還會伴隨發(fā)生嚴重的并發(fā)癥。另外，盡管肝臟活檢被認為是判斷纖維化的“金標準”，然而由于該技術僅僅探測一小部分區(qū)域，因而可能會導致對肝病真實狀態(tài)的采樣不夠充分。因此，活檢并不是十分適合作為常規(guī)的進度檢查工具。理想的肝纖維化進度檢查工具應當是非侵入性的臨床標記，該標記的測量值應當與纖維化的階段(肝纖維化的級別)相關聯(lián)。為此，已經(jīng)對多種標記和標記組進行了評估，卻沒有一個完全滿足這些要求。例如，曾經(jīng)使用過血清中的胞外基質(zhì)組分，其中最可靠的明顯是血清透明質(zhì)酸。然而，使用該標記的多項研究似乎達成了這樣的共識，即該標記可以相當可靠地排除很多患者的肝硬化(也就是具有較高的陰性預測值)，而該標記在檢測肝硬化中的準確率卻較低(靈敏度約為30％)。最近，為了滿足上述的標準，研究較多的是基于一系列臨床化學分析物的二元對數(shù)回歸模型(纖維測試)(fibrotest)(文獻14、15和WO0216949)。為了要能夠排除慢性肝病患者接受活檢的必要性，或在進度檢查中可靠地檢測出早期肝硬化的發(fā)生，就必須達到＞95％的特異性水平，然而在該水平下，這些標記的靈敏度卻很低。顯然，需要的是擁有高特異性和良好靈敏度的額外血清標記，以便將其用于肝纖維化及其進程的非侵入性監(jiān)測。在本發(fā)明中，我們開發(fā)了一種“臨床糖組學(glycomics)”方法，該方法使用標準PCR熱循環(huán)儀和自動化DNA測序儀/片段分析儀，來快速地產(chǎn)生高分辨率的存在于患者血清蛋白上的N-聚糖翻譯后修飾的分布圖。我們證明，血清N-糖組(glycome)可作為生物標記，它能將早期肝硬化患者與纖維化肝病患者加以區(qū)分，其靈敏度達到79％，特異性達到86％。重要的是，當我們的新型生物標記與其它臨床使用的基于化學的{纖維測試(Fibrotest)}生物標記(在我們的發(fā)明中，其檢測早期肝硬化的靈敏度為92％，特異性為76％)聯(lián)用時，對纖維化和早期肝硬化病例的區(qū)分特異性提高到了100％，而靈敏度也同時保持在75％。
附圖和附表的簡要說明

圖1總血清蛋白N-聚糖分布圖的實例。
上面一張圖包含麥芽寡糖作為參照。第二張圖顯示由對照血清樣品中的蛋白質(zhì)衍生而來的去唾液酸化的N-聚糖的典型電泳圖譜。在全部的檢測范圍內(nèi)共有9個明顯可見的峰，在電泳圖譜后面部分的10×放大圖中還有另外5個峰。用這14個峰的高度來得到本研究中所有樣品分布圖的數(shù)值描述。第三張圖表示來自肝硬化病例的代表性電泳圖譜。與本研究相關的N-聚糖的結(jié)構(gòu)顯示于圖下方，而所發(fā)現(xiàn)的與肝硬化標記尤為相關的峰用框標出。單糖單元符號(同樣適用于圖5)○β-連接的GlcNAc；●β-連接的Gal；□α-連接的Man；■β-連接的Man；△α-1，6-連接的Fuc。
圖2衍生診斷變量的趨勢圖。
將血清樣品分成9個臨床相關組。從圖1顯示的分布圖中得到3個診斷變量Log(峰1/峰8)，Log(峰2/峰8)和Log(峰7/峰8)。因為后者對肝硬化的診斷具有很高的效率，所以將其重新命名為GlycoCirrho檢查。注意縱坐標是以對數(shù)值表示的。隨著肝病嚴重程度的增加，尤其是在肝硬化的情況下，這3個變量的平均值也都表現(xiàn)出明顯的上升趨勢(誤差棒表示平均值95％的置信區(qū)間)。
圖3使用ROC分析3個衍生變量的分類效率。
a)運用ROC曲線分析，來評估圖2所示3個變量對較輕的肝硬化樣品組與肝硬化前慢性肝病組的區(qū)分效率。將由GlycoCirrho檢查和{纖維測試}ROC曲線所確定的截斷(cut-off)值用于本圖的b部分，將二維散點圖區(qū)域分成四個部分。b)二維散點圖，它用于對肝硬化樣品組和肝硬化前慢性肝病組加以分類。上圖加/不加HCC下，生化代償性肝硬化病例的檢測靈敏度為75％，特異性為100％。中圖加/不加HCC下，生化代償失調(diào)性肝硬化病例的檢測靈敏度為100％。c)對普通人群樣品(紅十字獻血者)以及非肝臟自身免疫疾病患者樣品所進行的GlycoCirrho檢查截斷值試驗。解釋參見說明書。這些個體通常都不是活檢的候選對象，而研究他們是為了了解IgG糖基化改變的可能干擾因素，這在某些自身免疫疾病中是典型的。
圖4一些糖組標記的值隨纖維化階段的改變而逐漸升高。
用3個糖組衍生標記的數(shù)據(jù)對纖維化階段進行繪圖。將F0和F1階段的病例(沒有纖維化或者只有門靜脈纖維化)歸為一組，原因在于只有4個F0病例，還因為這樣分組臨床上很重要，因為一般沒有開始對這些患者進行抗HCV治療。階段F4+代表生化代償失調(diào)性肝硬化。用非參數(shù)Lowess回歸來產(chǎn)生趨勢線。下面2張圖中的水平線代表由ROC確定的用于檢測肝硬化的截斷值。注意從F0/F1到F3 GlycoCirrho檢查相對穩(wěn)定，僅從F4才有所增加。同樣注意{纖維測試}模型預期的反曲行為。有趣的是，隨著纖維化階段的改變，Log(峰1/峰2)和Log(峰2/峰8)尤其是后者的值逐漸增加。對于Log(峰2/峰8)，用線性Spearman等級相關分析得到0.76的高相關系數(shù)。
圖5以不同方式調(diào)控的N-聚糖的部分結(jié)構(gòu)分析。
圖中的3列代表將3個血清樣品中的糖蛋白衍生的N-聚糖進行外切糖苷酶陣列測序的結(jié)果。選擇這些樣品來反映本研究中觀察到的改變的數(shù)量范圍。最左邊的測序列得自對患有慢性肝炎的樣品進行的分析，代表對照分布圖。中間的一列代表相對中等的改變，已經(jīng)進入了本文所述的所有3個肝硬化診斷變量的截斷值。右面一列是對病癥最嚴重的樣品之一進行分析所得的結(jié)果。將實施方式9中所述的峰與這3列加以比較是十分有用的，而且能夠進行這一比較將顯著地簡化在外切糖苷酶測序圖譜中對峰的跟蹤。繪成黑色的峰不帶有等分的(bisecting)GlcNAc殘基。在這種意義上，它們都可以看做是三甘露糖基-GlcNAc2核心寡糖的衍生物。繪成灰色的峰都由等分的GlcNAc殘基所修飾，因而，它們都可以看做是等分GlcNAc取代的三甘露糖基-GlcNAc2核心寡糖的衍生物。測序列下面的中間和右方的參考圖是從不同的電泳圖譜組合而來，每一張圖譜都是對已知結(jié)構(gòu)的參考聚糖用特殊的外切糖苷酶消化而得到。使用的參考聚糖是1)三唾液酸，三半乳糖，三觸角(triantennary)；2)具有核心-α-1，6-連接巖藻糖的雙唾液酸，雙半乳糖，雙觸角(biantennary)(在中間列下面的參考圖)和3)具有核心-α-1，6-連接巖藻糖和等分GlcNAc的單唾液酸，雙半乳糖，雙觸角(在最右側(cè)列下面的參考圖)。
圖6血清N-糖組分布圖中顯示期望趨勢的5個峰的數(shù)據(jù)偏差隨著肝病嚴重程度的增加，其值逐漸增加或降低。
分組與圖1所示一致。這些峰進一步用來產(chǎn)生文中所述的診斷變量。
圖7基于穩(wěn)定素-P板的樣品制備方法測得的肝硬化測定參數(shù)和基于新型熱循環(huán)儀的方法測得的參數(shù)之間的嚴格線性關聯(lián)。
從慢性肝病組和健康對照組中隨機選取20個樣品，用兩種樣品制備方法進行分析。3個診斷參數(shù)，即Log(峰1/峰8)，Log(峰2/峰8)和Log(峰7/峰8)，在兩種方法中表現(xiàn)出幾乎完全的線性關聯(lián)(Pearson’s r≥0.98)。這表示不管樣品制備方法如何，診斷的結(jié)果都具備有效性。
圖8用ABI310分析所得的總血清蛋白質(zhì)N-聚糖分布圖。
用基于毛細管電泳的ABI310DNA分析儀重新分析圖5中的2個肝硬化樣品。將本圖的葡聚糖水解產(chǎn)物電泳圖譜與圖5相比較，可以發(fā)現(xiàn)在ABI310上進行的分析其分辨率顯著優(yōu)于在ABI377膠上進行的分析。在2種方法中，N-聚糖的相對遷移行為有些不同，推測可能是因為毛細管方法用線性聚丙烯酰胺作為分離基質(zhì)，而不是使用交聯(lián)的聚丙烯酰胺凝膠。
圖9從總血清糖蛋白的唾液酸化N-聚糖分布圖中獲得的纖維化標記。
對存在于研究中所有N-聚糖分布圖的7個主要的、分辨清晰的峰的峰高進行定量，并用各分布圖中定量峰的總豐度對這些峰高進行標準化。峰1和峰5與HAI纖維化階段關聯(lián)性最好(用Spearman等級相關試驗檢測，rho分別為-0.696和0.762)。95％的置信區(qū)間顯示于圖A和B中。而且，峰1和峰5的峰高有較高的相互關聯(lián)度(Pearson r＝-0.827)。因此，我們計算了兩峰間的比例，并將該值進行對數(shù)轉(zhuǎn)化使分布標準化。這就使試驗更為簡單，因為只要對2個峰進行定量，而不用對整個分布圖定量。所得參數(shù)對數(shù)值的95％的置信區(qū)間(sia5到sial)顯示于圖C中。這一參數(shù)與HAI纖維化階段具有很好的關聯(lián)度(Spearman rho＝0.765)。Sia5和sia1是指唾液酸化的聚糖峰1和5。唾液酸化分布圖中的峰5與去唾液酸化的分布圖中的峰1具有相同的結(jié)構(gòu)(參見，實施方式9)。唾液酸化分布圖中的峰1與去唾液酸化的分布圖中的峰3具有相同的結(jié)構(gòu)(參見，實施方式9)。注意與去唾液酸化的結(jié)構(gòu)相比，唾液酸化的結(jié)構(gòu)具有2個額外的α-2，6-N-乙酰神經(jīng)氨酸。
目的及詳細說明目前，對首次表現(xiàn)出癥狀的慢性肝病患者所進行的診斷檢查需要進行肝活檢來評估纖維化階段和活躍度，以及檢測早期肝硬化的發(fā)生10。然而，在一個大的慢性肝病患者群中(主要罹患慢性病毒性肝炎、遺傳造成的或與酗酒相關的肝病)，纖維化向肝硬化的發(fā)展速度不盡相同，而向肝硬化的發(fā)展最終將會導致嚴重的并發(fā)癥11以及高死亡率，而且這也是肝細胞癌(HCC)發(fā)生的主要危險因素。由于肝活檢給患者帶來很大的不適，而且還有引發(fā)并發(fā)癥的危險13，因此，不適宜將該方法并入常規(guī)的(通常是每年進行的)慢性肝病患者的進度檢查中。因此，臨床上需要可以常規(guī)地評估肝纖維化進程和可靠地檢測早期肝硬化階段的標記，而肝硬化與最嚴重的病狀相關。在本發(fā)明中，我們滿足了這一需求，建立了將臨床糖組應用于已診斷患有肝纖維化的患者以檢測肝纖維化和肝纖維化級別變化的技術平臺。我們定量地做出由存在于血清中的糖蛋白衍生而來的碳水化合物結(jié)構(gòu)的分布圖，也已經(jīng)確定了這些參數(shù)衍生而來的數(shù)量參數(shù)與研究的患者中組織學肝纖維化階段的統(tǒng)計學相關性。換言之，本發(fā)明驚奇地發(fā)現(xiàn)診斷性碳水化合物的數(shù)量或所述碳水化合物之間的相對數(shù)量與肝纖維化的嚴重性相關。
在第一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測哺乳動物體內(nèi)肝纖維化或肝纖維化級別變化的方法，包括a)做以下物質(zhì)的分布圖碳水化合物或其衍生的片段、或所述碳水化合物或所述片段的標記衍生物、或由所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的結(jié)構(gòu)所確定的所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的特征(feature)；所述碳水化合物或所述片段存在于復合糖混合物，或者從存在于或分離自所述哺乳動物體液樣品中的復合糖混合物中獲得，以及b)測定步驟a)的分布圖中至少一種碳水化合物或其衍生片段或所述碳水化合物或所述片段的標記衍生物的數(shù)量，或者測定存在于所述碳水化合物分布圖中至少一種碳水化合物或其衍生片段的特征，以及c)將步驟b)中所得測量數(shù)據(jù)與從未患肝纖維化的哺乳動物的分布圖中獲得的測量數(shù)據(jù)相比較，用以檢測肝纖維化，或者，將步驟b)中所得數(shù)據(jù)與先前在所述哺乳動物中測定的數(shù)據(jù)相比較，用以檢測肝纖維化的級別變化，和d)對步驟c)中所得的比較結(jié)果進行歸因(attributing)，以檢測哺乳動物的肝纖維化或肝纖維化級別的變化。
術語“一種檢測肝纖維化的方法”可以廣泛地理解為肝纖維化的篩選方法、診斷方法或預后(或監(jiān)測)方法。術語“肝纖維化級別的變化”是指隨著時間推移而發(fā)生的肝纖維化的進展，這可能意味著肝硬化階段的改善(例如，從Metavir第3階段降至Metavir第2階段)，或者意味著肝纖維化階段的穩(wěn)定或肝纖維化階段的惡化。換言之，一種檢測肝纖維化級別的方法就是可以對先前診斷罹患肝纖維化的患者(或患者群)做出預后的監(jiān)測儀器。術語“對得到該比較結(jié)果進行歸因”是指可能獲得的不同形式的結(jié)果?！敖Y(jié)果”可以包括數(shù)值的增加、數(shù)值的減少、數(shù)值的穩(wěn)定。或者，“結(jié)果”可以落于一個數(shù)值范圍內(nèi)(例如，95％置信區(qū)間，標準差)，該“結(jié)果”來源于，例如，對組織學上確定為某一特殊纖維化階段的一組患者的分析。在本發(fā)明中，Metavir第4階段(IV)是指早期肝硬化或晚期纖維化，該術語意味著早期肝硬化或晚期纖維化或等價的意思。同樣，術語“肝硬化前”是指纖維化的第1、或第2、或第3階段。
在另一個實施方式中，碳水化合物的分布圖用于制備檢測肝纖維化的診斷試驗，所述的診斷試驗包括以下步驟a)做以下物質(zhì)的分布圖碳水化合物或其衍生的片段、或所述碳水化合物或所述片段的標記衍生物、或由所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的結(jié)構(gòu)所確定的所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的特征；所述碳水化合物或所述片段存在于復合糖混合物，或者從存在于或分離自所述哺乳動物體液樣品中的復合糖混合物中獲得，以及b)測定步驟a)的分布圖中至少一種碳水化合物或由其衍生片段或所述碳水化合物或所述片段的標記衍生物的數(shù)量，或者測定存在于所述碳水化合物分布圖中至少一種碳水化合物或其衍生片段的特征，以及c)將步驟b)中所得的測量數(shù)據(jù)與從未患肝纖維化的哺乳動物的分布圖中獲得的測量數(shù)據(jù)相比較，用以檢測肝纖維化，或者，將步驟b)中所得數(shù)據(jù)與先前在所述哺乳動物中測定的數(shù)據(jù)相比較，用以檢測肝纖維化的級別變化，和d)對步驟c)中所得的比較結(jié)果進行歸因，以檢測哺乳動物的肝纖維化或肝纖維化級別的變化。
術語“存在于……中的復合糖”指的是不經(jīng)過所述碳水化合物的分離步驟而在復合糖上檢測到的碳水化合物；因此，樣品就這樣使用，而不包含任何分離步驟，而術語“分離自體液樣品”指碳水化合物是從存在于樣品中的復合糖中分離得到。
在
具體實施例方式
中，本發(fā)明的方法可以用來監(jiān)測對患有肝纖維化的哺乳動物所施用的療法其效果如何。在另一個具體實施方式
中，本發(fā)明的方法特異性地檢測肝纖維化。術語“特異性地”指肝纖維化可以區(qū)別于其它肝病(包括早期肝硬化和晚期肝硬化)而得到診斷。
術語“碳水化合物”可以理解為以復合糖結(jié)構(gòu)存在的聚糖或由復合糖衍生而來的聚糖，包括本領域所知的聚糖類別，如蛋白質(zhì)中天冬氨酸連接的聚糖(也稱為N-聚糖)或絲氨酸/蘇氨酸連接的聚糖(也稱為O-聚糖)或葡糖胺聚糖或由蛋白聚糖衍生而來的聚糖，存在于或衍生自糖脂的聚糖以及GPI錨衍生而來的碳水化合物。在優(yōu)選的實施方式中，碳水化合物為N-聚糖。術語“聚糖”和“碳水化合物”可互換使用?！皬秃咸恰敝负刑妓衔锊糠值娜魏位衔?例如，蛋白質(zhì)或脂類)。術語“復合糖混合物”是指含有至少2種(至少3種，至少4種，至少5種或更多種)所述復合糖的組合物，還可能含有非復合糖物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂類、鹽或水。術語“碳水化合物或其衍生片段”是指可以將碳水化合物片段化，而在片段化處理的產(chǎn)物中至少有1種寡糖或其衍生物。該片段化過程的其它產(chǎn)物可以包括單糖和寡糖或其衍生物。寡糖是指其化學結(jié)構(gòu)由至少2個化學連接單元即本領域所稱的單糖組成。所述的片段化過程可包括酶、化學和物理處理。例如，可以用糖苷酶處理(或消化)碳水化合物，(例如，用唾液酸酶從碳水化合物上除去唾液酸殘基，或用巖藻糖酶從碳水化合物上除去巖藻糖殘基)，這樣所得的分布圖由碳水化合物的片段組成。進行糖苷酶消化可以是為了，例如，得到更簡單的分布圖。也可以用化學方法用弱酸水解碳水化合物去除唾液酸。在質(zhì)譜分析方法中，術語“片段”是指在分析過程中(例如，在碰撞引發(fā)解離的過程中)碳水化合物常常被片段化，這種情況下，片段化產(chǎn)物也可產(chǎn)生由與1個或多個單糖殘留物相連的寡糖組成的寡糖衍生物，在片段化發(fā)生前這些單糖是碳水化合物結(jié)構(gòu)的一部分。由質(zhì)譜片段化過程所產(chǎn)生的寡糖衍生物的一個實例在本領域中稱為交叉環(huán)切割產(chǎn)物離于?！八鎏妓衔锏奶卣鳌笔侵溉魏慰蓽y量的參數(shù)，其特征和/或數(shù)量是由碳水化合物的結(jié)構(gòu)所決定的。這些可計量的參數(shù)有，例如，核磁共振參數(shù)諸如化學位移、同核和異核的耦合常數(shù)、核奧佛好塞效應以及殘基偶極耦合。或者，這些可計量的參數(shù)可以是所述碳水化合物與其它分子(如識別碳水化合物中特異結(jié)構(gòu)決定簇或其組合的凝集素和抗體)的結(jié)合程度。還有其它這類可計量的參數(shù)可以是碳水化合物作為(特異性修飾某些碳水化合物例如糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶的)酶底物而發(fā)揮功能的能力。
術語“存在于復合糖混合物中或得自復合糖混合物的所述碳水化合物或所述片段”是指“碳水化合物或其衍生片段、或所述碳水化合物或所述片段的標記衍生物、或由所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的結(jié)構(gòu)所決定的所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的特征的分布圖”，可以是分析仍舊以化學鍵與混合物中的復合糖相連的碳水化合物而得到，或者是分析已經(jīng)用酶、化學或物理方法從復合糖上釋放(分離)出來的碳水化合物而得到的。在一個優(yōu)選的實施方式中，N-聚糖是用肽N-糖苷酶F或其它本領域已知的內(nèi)切糖苷酶用酶消化的方式從混合物中的糖蛋白上釋放出來。在另一個實施方式中，可以用本領域技術人員已知的方法用肼將N-和O-聚糖釋放出來。在另一個實施方式中，可以根據(jù)公知的程序，用堿性條件下的β-消除方法選擇性地釋放O-聚糖。如果分布圖得自仍然以化學鍵與混合物中的復合糖相連的碳水化合物，一個實施方式包括在得到分布圖之前，用酶或化學程序來修飾復合糖的非聚糖部分，如用蛋白水解酶或用修飾糖脂中脂質(zhì)部分的酶。術語“碳水化合物分布圖”是指包含所述碳水化合物質(zhì)和/或量信息的任何實體。例如，這可以意味著所述碳水化合物的電泳或色譜圖譜。在具體實施方式
中，分布圖是所述碳水化合物的質(zhì)譜圖?；蛘撸植紙D可以是由核磁共振分析得到的信息。在另一個實施方式中，分布圖可以是描述與碳水化合物結(jié)合的凝集素的質(zhì)或量方面的信息?；蛘?，分布圖可以是描述在多達程度上碳水化合物可作為特異性酶(如糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷酶)的底物的信息。這類信息可以包括計量這類酶反應副產(chǎn)物的讀數(shù)，如在糖基轉(zhuǎn)移酶反應中所釋放的核苷酸的當量。在具體實施方式
中，術語“產(chǎn)生碳水化合物的分布圖”或“做碳水化合物分布圖”也可以表示分離出并隨后測定聚糖結(jié)構(gòu)。通常在碳水化合物分布圖中可以鑒定很多碳水化合物。通常，碳水化合物存在于復雜的混合物中，要進行有效的檢測，必須將其分離是?？捎玫姆蛛x方法包括電泳和色譜方法?？捎玫臋z測方法包括抗體檢測、凝集素檢測、NMR、質(zhì)譜和熒光檢測。在具體實施方式
中，有必要在做聚糖分布圖之前用化學和/或酶方法從糖蛋白中去除聚糖。從糖蛋白中制備聚糖的方法是本領域熟知的。在另一個具體實施方式
中，有必要在分離與檢測之前制備聚糖的衍生物。在一種方法中，本發(fā)明做聚糖分布圖的方法(包括分離和檢測)可以與DNA-測序儀聯(lián)用。然而，對本領域技術人員很顯然的是，該方法也可以與適用于激光感生熒光檢測儀的毛細管電泳系統(tǒng)聯(lián)用。這類系統(tǒng)，例如，包括P/ACE系列的毛細管電泳系統(tǒng)(Beckman Instruments，Inc.，F(xiàn)ullerton，Calif.)。本發(fā)明也可以與適用于激光感生熒光檢測儀的任何毛細管電泳系統(tǒng)聯(lián)用。在另一個實施方式中，還可以使用質(zhì)譜檢測方法，如MALDI-TOF-MS，來測定至少一種碳水化合物或其衍生片段的數(shù)量。在質(zhì)譜方法中，碳水化合物常常是片段化的，因此所述方法中檢測的是碳水化合物片段。
在另一個實施方式中，可以用微流體學的方法來做分布圖。微流體學是正在迅速發(fā)展的領域，該學科基于液體通過孔徑狹窄的通道所進行的遷移，孔徑狹窄的通道是借用微芯片工業(yè)的(光蝕刻和化學濕蝕刻)技術在固體基質(zhì)(大多是硅晶片或高純度玻璃板)上產(chǎn)生的。液體可以通過毛細作用或主動泵送而遷移通過這些通道，而分析物則可以在充滿液體的通道中通過電泳作用進行遷移(Schmalzing等(2001)Methods Mol.Biol.163，163-173)。在另一個實施方式中，可以通過色譜分離方法，包括薄層層析(TLC)、高效液相色譜或氣相色譜，來分離碳水化合物。
術語“至少一種碳水化合物”是指測定存在于碳水化合物分布圖中至少一種碳水化合物的數(shù)量，該碳水化合物對肝纖維化的檢測具有診斷相關作用(因此，所述的至少一種碳水化合物可以稱為至少一種珍斷性碳水化合物)。在一個實施方式中，對于一種碳水化合物的計量足以診斷肝纖維化。這就意味著在一種具體情況下，一種碳水化合物存在于罹患纖維化的哺乳動物中，而在不患纖維化的哺乳動物體內(nèi)卻沒有；在另一種具體情況下，一種碳水化合物存在于不患纖維化的哺乳動物體內(nèi)，卻不存在于患纖維化的哺乳動物體內(nèi)。在另一個具體實施例中，一種碳水化合物的不同數(shù)量足以區(qū)分罹患和不患纖維化的哺乳動物。在優(yōu)選的實施方式中，測定了1種、2種或者甚至更多(診斷性)碳水化合物的數(shù)量。在分布圖的制作方法中，(診斷性)碳水化合物的數(shù)量可以用，例如，計算峰高或峰表面積的方法來測定。將存在于患者樣品中的至少一種(診斷性)碳水化合物的數(shù)量與存在于不患肝纖維化的個體內(nèi)對應的診斷性碳水化合物的水平相比較，就可以診斷是否存在肝纖維化。本發(fā)明可以用于來自哺乳動物如人的樣品。診斷性碳水化合物可以是寡糖、或多糖。診斷性碳水化合物可以是分支的或不分支的。從一個罹患肝纖維化的個體身上取得的樣品中，診斷性碳水化合物存在的豐度(數(shù)量)始終高于或始終低于從不罹患(沒有肝纖維化)的個體身上所取得的樣品。
術語“所述碳水化合物或所述片段的標記衍生物”是指用試劑標記過的碳水化合物，這樣就能有效地檢測到該碳水化合物。所述標記碳水化合物也稱為衍生碳水化合物。作為實例，發(fā)熒光的化合物可以用于碳水化合物的標記。所述發(fā)熒光的化合物優(yōu)選地帶有電荷，這樣，衍生化合物可以在電泳條件下發(fā)生遷移。當熒光團標記不帶有電荷時，可以將其與傳遞電荷的物質(zhì)相耦合。所述熒光團標記也使得衍生碳水化合物的數(shù)量可以通過熒光來定量測定。諸如9-氨基芘-1，4，6-三磺酸(APTS)和8-氨基萘-1，3，6-三磺酸(ANTS)等的發(fā)熒光化合物尤其適用于衍生碳水化合物的電泳分離。其它用作碳水化合物熒光標記的化合物包括2-氨基吡啶(AP)、5-氨基萘-2-磺酸鹽(ANA)、1-氨基-4-萘磺酸(ANSA)、1-氨基-6，8-二磺酸(ANDA)、3-(4-羧基苯甲酰)-2-喹啉羧醛(CBQCA)、熒光黃、2-氨基吖啶酮和4-氨基芐腈(ABN)。
在
具體實施例方式
中，可以用本領域已知的任何檢測方法檢測熒光標記的碳水化合物，但是優(yōu)選用激光檢測，如二極管激光、He/Cd激光或氬離子激光。在具體實施方式
中，用基于電荷耦合裝置(CCD)照相機的成像系統(tǒng)對電泳分離的標記碳水化合物條帶圖譜進行顯影。從CCD照相機而來的信息可以以數(shù)字形式存儲并用各種計算機程序進行分析，從而將個體間和參考標準間的診斷性碳水化合物模式加以比較。在另一個具體實施方式
中，可以將凝膠分離的診斷性碳水化合物轉(zhuǎn)移至固定化膜上，也就是印記，然后，再用各種診斷性碳水化合物特異性的試劑進行探測，如凝集素或所述診斷性碳水化合物特異性的單克隆或多克隆抗體。在具體實施方式
中，本發(fā)明提供了一種檢測哺乳動物體內(nèi)肝纖維化的方法，該方法包括使用特異地與所述至少一種聚糖結(jié)構(gòu)和/或復合糖相結(jié)合的配體，對來源于罹患和不患纖維化個體的樣品中豐度有所不同的至少一種聚糖結(jié)構(gòu)和/或復合糖進行計量和檢測。配體包括凝集素和抗體。例如，可以用特異性識別以等分GlcNAc修飾的聚糖(或其復合物)的凝集素檢測體液樣品中具有“等分GlcNAc”殘基(GnT-III產(chǎn)物)的N-聚糖結(jié)構(gòu)(或其復合物)豐度的增加，這樣的凝集素例如來自菜豆(Phaseolus vulgaris)的紅細胞凝集素(E-PHA)或其突變體，該突變體具有，例如，對這種修飾聚糖更高的特異性或抗體特異性?；蛘撸捎弥荒芎臀从玫确諫lcNAc殘基取代的N-聚糖(或其復合物)相結(jié)合的凝集素與N-聚糖(或其復合物)結(jié)合的減少來檢測具有“等分GlcNAc”殘基的N-聚糖結(jié)構(gòu)(或其復合物)豐度的提高。這類凝集素的一個實例是來自Canavalia ensiformis(Con A)的凝集素。觀察到的血清糖蛋白N-聚糖的低半乳糖苷化可以用末端GlcNAc結(jié)合凝集素進行檢測，如Griffoniasimplicifolia II(GS-II)凝集素。或者，低半乳糖苷化可以用末端半乳糖結(jié)合凝集素如來自Erythrina crystagelli的凝集素進行檢測，其結(jié)合的減少則代表低半乳糖苷化。
在
具體實施例方式
中，對作為特異的糖基轉(zhuǎn)移酶底物的碳水化合物的特征進行檢測而得到“由碳水化合物結(jié)構(gòu)決定的特征分布圖”。在優(yōu)選的實施方式中，這一糖基轉(zhuǎn)移酶是β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，而碳水化合物存在于血清或血漿全部蛋白質(zhì)的混合物中。該反應的另一底物是UDP-半乳糖，該反應產(chǎn)出化學計量的UDP。因此，可以通過測量反應前后去唾液酸蛋白質(zhì)的半乳糖基化程度的差異而得到分布圖，例如，用糖蛋白與末端β-半乳糖特異性的凝集素相結(jié)合的方法(如，本領域已知的來自Ricinus communis和Erythrinacrystagalli的凝集素，或者半乳糖凝集素(galectin)，如來自Coprinuscinereus)?；蛘撸梢詼y量β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在血清或血漿蛋白質(zhì)混合物中的反應所產(chǎn)出的UDP數(shù)量，從而獲得分布圖，例如，用HPLC的方法。可以用耦合的酶反應來測量UDP的數(shù)量，所用的酶是核苷酸代謝中已知的1種或多種酶，例如，核苷酸二磷酸酯酶，如酵母的高爾基GDPase，它對UDP也表現(xiàn)出很高的水解活性。在后面這種情況下，可以用熟知的技術通過測量UMP或磷酸鹽而得到分布圖。還有一個測量UDP的實施例，包括使用本領域已知的對UDP-Gal和UDP具有不同親和度的超大分子膜孔。這樣得到的分布圖可以，例如，對存在于血清或血漿樣品中的蛋白質(zhì)或碳水化合物的總量進行標準化。在另一個實施方式中，可以將存在于血清或血漿蛋白質(zhì)混合物中的碳水化合物用作β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶的底物，以UDP-半乳糖和CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸作為糖供體底物而得到分布圖。在該實施方式中，分布圖可以由反應前后結(jié)合唾液酸的凝集素(如，本領域熟知的來自Maackiaamurensis或Sambucus nigra的凝集素)與糖蛋白結(jié)合的不同情況所組成，或者可以由用本領域已知方法測量反應中釋放的UDP和/或CMP所得的數(shù)量組成。
在另一個實施方式中，碳水化合物分布圖方法可以在電泳之前補充一個步驟，即用與連接于碳水化合物分析物的標記所不同的發(fā)色團或熒光團標記1個或多個內(nèi)標。通過將衍生碳水化合物電泳遷移率參考于內(nèi)標混合物組分的遷移率，內(nèi)標可以使得衍生碳水化合物電泳遷移率得到精確而可重復的測定。例如，可以在做分布圖之前，向衍生聚糖中加入羅丹明標記的寡核苷酸標準GenescanTM500(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)或羅丹明標記的6-、18-、30-和42-寡核苷酸的混合物?？梢栽趯Ψ治鰳悠愤M行標記之前，先對診斷標準進行標記；然而，優(yōu)選的是同時標記診斷標準與分析標準。而且，優(yōu)選地對標準中的珍斷性碳水化合物加以定量，來和分析樣品中的珍斷性碳水化合物的數(shù)量做量和質(zhì)的比較。
術語“體液”包括，血液、血清、血漿、唾液、尿液、骨髓液、腦脊液、滑膜液、淋巴液、羊膜液、乳頭吸取液等。優(yōu)選的用于分析的體液是可以方便地從患者身上取得的體液，尤其優(yōu)選的體液包括血清和血漿。
盡管在實施本發(fā)明時，對(衍生)聚糖做分布圖之前可以不對樣品進行預處理，在具體實施方式
中，在對診斷性碳水化合物分離和定量之前，分析樣品可能要求先進行加工。采用的樣品加工的具體方法可以根據(jù)多種(由樣品體液的選擇和診斷性碳水化合物的識別而帶來的不同)因素而有所改變；這些因素包括診斷性碳水化合物的豐度、背景碳水化合物的濃度、干擾分子的存在情況(例如，減慢碳水化合物條帶的遷移率的分子或減弱診斷性碳水化合物熒光標記的分子)、以及熒光標記是否必需與衍生的珍斷性碳水化合物分離。合適的樣品加工或預處理方法包括透析，來去除干擾分子(例如，去除鹽類，使質(zhì)譜檢測效率更高)；超濾，來濃縮珍斷性碳水化合物并除去干擾分子；離心，來去除干擾粒子或濃縮細胞；沉淀，來去除干擾分子，從血清中除去白蛋白而富集糖基化的蛋白質(zhì)，并因此富集低豐度的聚糖；用糖苷酶去糖基化(例如，用唾液酸酶消化聚糖)而產(chǎn)生更簡單的聚糖分布圖；色譜方法，如親和色譜，用來，例如，從血清中去除白蛋白。
在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測哺乳動物體內(nèi)肝纖維化或肝纖維化級別變化的方法，包括a)做以下物質(zhì)的分布圖碳水化合物或其衍生的片段、或所述碳水化合物或所述片段的標記衍生物、或由所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的結(jié)構(gòu)所確定的所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的特征；所述碳水化合物或所述片段存在于復合糖的混合物中，或者是從存在于或分離自所述哺乳動物體液樣品中的復合糖混合物中獲得，以及b)測定步驟a)的分布圖中至少一種碳水化合物或由其衍生片段或所述碳水化合物或所述片段的標記衍生物的數(shù)量，或者測定存在于所述碳水化合物分布圖中至少一種碳水化合物或其衍生片段的特征，以及c)將步驟b)中所得的測量數(shù)據(jù)與從未患肝纖維化的哺乳動物的分布圖中獲得的測量數(shù)據(jù)相比較，用以檢測肝纖維化，或者，將步驟b)中所得數(shù)據(jù)與先前在所述哺乳動物中測定的數(shù)據(jù)相比較，用以檢測肝纖維化的級別變化，和d)對步驟c)中所得的比較結(jié)果進行歸因，以檢測哺乳動物的肝纖維化或肝纖維化級別的變化。術語“檢測相對數(shù)量”是指至少一種碳水化合物或片段(例如，一種特殊的碳水化合物或片段)的數(shù)量可以在2個分布圖中進行測定，其中，一張分布圖來自未患肝纖維化的哺乳動物，而另一張分布圖則來自可能罹患肝纖維化而需要診斷是否患病的哺乳動物。或者，可以從未患肝纖維化的哺乳動物中獲得特定碳水化合物的平均參考范圍，將其與需要診斷是否罹患肝纖維化的哺乳動物中所述的特定碳水化合物的測量數(shù)量加以比較。在另一個實施方式中，“檢測相對數(shù)量”是指測量存在于動物體液樣品的一個碳水化合物分布圖中的至少2種碳水化合物或其衍生片段的相對數(shù)量，或所述碳水化合物或所述片段的標記衍生物的相對數(shù)量，或所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的特征的相對數(shù)量。
在本發(fā)明的另一個實施方式中，為了能夠測定碳水化合物的相對數(shù)量，還在用以分析對象樣品中診斷性碳水化合物的凝膠中加入了診斷標準；然而，由診斷標準所體現(xiàn)的信息，例如，條帶遷移距離和條帶強度，也可以用如下方法獲得即在測定前，將診斷標準置于和分析樣品所處的分析條件相類似的條件中，進行熒光團輔助碳水化合物電泳，并將結(jié)果存儲下來，然后在測定時將所得的結(jié)果與該存儲記錄相比較。診斷標準可以是陽性標準，也就是對應于患病個體的完整的碳水化合物模式，或者，診斷標準可以是陰性，也就是對應于未患病個體的模式。診斷標準的組成可以與分析樣品相似，就是它們可以同時含有與實際樣品中所發(fā)現(xiàn)的具有相似組分的診斷性碳水化合物和背景碳水化合物。診斷標準可以是來自患病個體的樣品和來自非患病個體的樣品?；蛘?，診斷標準可以不含背景碳水化合物而包含1種或更多種診斷性碳水化合物。
在
具體實施例方式
中，檢測肝纖維化或肝纖維化級別變化的診斷技術不要求事先詳細了解碳水化合物的結(jié)構(gòu)。
因此，在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了檢測哺乳動物體內(nèi)肝纖維化或肝纖維化級別改變的方法，包括a)做以下物質(zhì)的分布圖碳水化合物或其衍生的片段、或所述碳水化合物或所述片段的標記衍生物、或由所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的結(jié)構(gòu)所確定的所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的特征；所述碳水化合物或所述片段存在于復合糖的混合物中，或者是從存在于或分離自所述哺乳動物體液樣品中的復合糖混合物中獲得，以及b)測定步驟a)的分布圖中至少一種碳水化合物或由其衍生片段或所述碳水化合物或所述片段的標記衍生物的數(shù)量，或者測定存在于所述碳水化合物分布圖中至少一種碳水化合物或其衍生片段的一個特征，其中所述的至少1種碳水化合物選自i)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，3)[GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)[Fuc(α-1，6)]GlcNAc(聚糖1)，ii)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，3)[GlcNAc(β-1，4)][GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)[Fuc(α-1，6)]GlcNAc(聚糖2)，iii)Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，3)[GlcNAc(β-1，4)][Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)[Fuc(α-1，6)]GlcNAc(聚糖7)，iv)Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)[Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)]Man(α-1，3)[Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)GlcNAc(聚糖8)，v)聚糖1、2、7或8的衍生片段，vi)聚糖1、2、7或8的唾液酸化衍生物，vii)聚糖1、2、7或8或其衍生物或其片段的特征。
以及c)將步驟b)中所得的測量數(shù)據(jù)與從未患肝纖維化的哺乳動物的分布圖中獲得的測量數(shù)據(jù)相比較，用以檢測肝纖維化，或者，將步驟b)中所得數(shù)據(jù)與先前在所述哺乳動物中測定的數(shù)據(jù)相比較，用以檢測肝纖維化的級別變化，和d)對步驟c)中所得的比較結(jié)果進行歸因，以檢測哺乳動物的肝纖維化或肝纖維化級別的變化。
為了表示清楚，峰1、2、7和8的結(jié)構(gòu)與圖1的碳水化合物分布圖相對應，也與圖5中用圖形表示的這些結(jié)構(gòu)相對應。所述碳水化合物分布圖是去唾液酸的分布圖(聚糖上沒有唾液酸)，這就意味著峰1、2、7和8的結(jié)構(gòu)是嚴格意義上的碳水化合物片段(丟失了唾液酸結(jié)構(gòu))。本文中碳水化合物的表示方法參照IUPAC的命名規(guī)則(htt p:∥www.chem.qmul.ac.uk/iupac/2carb/38.html)，對應于本發(fā)明圖1的峰已經(jīng)過鑒定，并且以它們的縮寫和擴展命名加以表示。在權(quán)利要求書中使用的是縮寫命名。4個結(jié)構(gòu)的命名歸納如下圖1中峰1的去唾液酸聚糖結(jié)構(gòu)縮寫命名GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，3)[GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)[Fuc(α-1，6)]GlcNAc擴展命名β-D-GlcpNAc-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-[β-D-GlcpNAc-(1→2)-α-D-Manp-(1→6)]-β-D-Manp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→4)-[α-L-Fucp-(1→6)]-D-GlcpNAc圖1中峰2的去唾液酸聚糖結(jié)構(gòu)縮寫命名GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，3)[GlcNAc(β-1，4)][GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)[Fuc(α-1，6)]GlcNAc擴展命名β-D-GlcpNAc-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-[β-D-GlcpNAc-(1→4)][β-D-GlcpNAc-(1→2)-α-D-Manp-(1→6)]-β-D-Manp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→4)-[α-L-Fucp-(1→6)]-D-GlcpNAc圖1中峰7的去唾液酸聚糖結(jié)構(gòu)縮寫命名Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，3)[GlcNAc(β-1，4)][Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)[Fuc(α-1，6)]GlcNAc擴展命名β-D-Galp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-[β-D-GlcpNAc-(1→4)][β-D-Galp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→2)-α-D-Manp-(1→6)]-β-D-Manp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→4)-[α-L-Fucp-(1→6)]-D-GlcpNAc圖1中峰8的去唾液酸聚糖結(jié)構(gòu)縮寫命名Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)[Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)]Man(α-1，3)[Ga1(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)GlcNAc擴展命名β-D-Galp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→2)-[β-D-Galp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→4)]-α-D-Manp-(1→3)-[β-D-Galp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→2)-α-D-Manp-(1→6)]-β-D-Manp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→4)-D-GlcpNAc在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測哺乳動物體內(nèi)肝纖維化或肝纖維化級別變化的方法，包括a)做以下物質(zhì)的分布圖碳水化合物或其衍生的片段、或所述碳水化合物或所述片段的標記衍生物、或由所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的結(jié)構(gòu)所確定的所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的特征；所述碳水化合物或所述片段存在于復合糖的混合物中，或者是從存在于或分離自所述哺乳動物體液樣品中的復合糖混合物中獲得，以及b)測定聚糖結(jié)構(gòu)1或其片段與聚糖結(jié)構(gòu)8或其片段、唾液酸衍生物或其特征之間的相對數(shù)量和/或聚糖結(jié)構(gòu)2或其片段與聚糖結(jié)構(gòu)8或其片段、唾液酸衍生物或其特征之間的相對數(shù)量和/或聚糖結(jié)構(gòu)7或其片段與聚糖結(jié)構(gòu)8或其片段、唾液酸衍生物或其特征之間的相對數(shù)量，以及c)將步驟b)中所得的測量數(shù)據(jù)與從未患肝纖維化的哺乳動物的分布圖中獲得的測量數(shù)據(jù)相比較，用以檢測肝纖維化，或者，將步驟b)中所得數(shù)據(jù)與先前在所述哺乳動物中測定的數(shù)據(jù)相比較，用以檢測肝纖維化的級別變化，和d)對步驟c)中所得的比較結(jié)果進行歸因，以檢測哺乳動物的肝纖維化或肝纖維化級別的變化。
在另一個實施方式中，本發(fā)明還包括一種用于診斷肝纖維化或用于檢測肝纖維化級別變化的診斷試劑盒。例如，可以制備用于熒光團輔助碳水化合物電泳診斷肝纖維化的試劑盒。作為另一個實施例，可以制備用質(zhì)譜來診斷肝纖維化的試劑盒。熒光團輔助碳水化合物電泳診斷試劑盒提供了進行肝纖維化診斷所需的試劑組。合適的試劑盒使得實驗室可以方便地進行熒光團輔助碳水化合物電泳診斷。試劑盒可以包括鑒定肝纖維化試驗所需的試劑。試劑盒可以包括診斷標準，熒光標記，印記和結(jié)合材料，例如，膜、碳水化合物特異性結(jié)合試劑、凝集素、使用說明、樣品容器、和聚丙烯酰胺凝膠試劑、預凝的凝膠、酶類的緩沖液、還原試劑(用于碳水化合物的熒光團標記)，和能夠催化珍斷性碳水化合物結(jié)構(gòu)改變反應的糖苷酶(例如，唾液酸酶、半乳糖苷酶、巖藻糖苷酶)。更完整的試劑盒可以包括進行熒光團輔助碳水化合物電泳所用的儀器，如聚丙烯酰胺凝膠裝置、CCDs、激光、DNA測序儀、計算機、軟件等等。優(yōu)選地，在熒光團輔助碳水化合物電泳診斷試劑盒中的試劑以預測量的數(shù)量提供。優(yōu)選地，試劑盒包括實施本發(fā)明的熒光團輔助碳水化合物電泳方法的使用說明。
診斷試驗在實踐中很有用，因為很容易由經(jīng)過普通訓練的實驗室人員進行大規(guī)模的應用。而且，由于基于電泳技術的高分辨率和高靈敏度的DNA測序和突變檢測分析儀已經(jīng)以很快的增長速度出現(xiàn)于越來越多的臨床實驗室中，或者已經(jīng)是大多數(shù)實驗室可以購置得起的，因此，可以在這些儀器上進行新型的肝纖維化檢測的診斷糖組學。而且，可獲得的DNA分析儀的分析范圍很寬，根據(jù)每個實驗室的需求可以使分析樣品的通量從僅僅幾個樣品提升至每天每臺儀器分析幾百個樣品。DNA分析儀器還有另一個優(yōu)勢，即自動化，這就降低了整個分析過程的復雜程度。對整個糖蛋白混合物做分布圖就使試驗更有可能檢測到混合物中每種糖蛋白的豐度和糖基化模式的個體間差異。這樣的檢測就比目前使用的研究純化糖蛋白糖基化模式的經(jīng)典方法更強有力。
在另一個實施方式中，檢測肝纖維化的方法還包括臨床化學參數(shù)和/或組織學數(shù)據(jù)。因此，本發(fā)明也可以方便地與臨床化學參數(shù)和/或組織學和/或成像參數(shù)聯(lián)用。臨床化學參數(shù)的測量包括檢測膽紅素和/或白蛋白和/或凝血酶原時間和/或C-反應性蛋白和/或IgA豐度和/或血清透明質(zhì)酸濃度和/或氨基轉(zhuǎn)移酶和/或幾個本領域已知的肝臟代謝試驗的水平。在具體實施方式
中，如WO0216949所述對纖維測試(fibrotest)的二元對數(shù)回歸模型進行計算并與本發(fā)明的診斷試驗聯(lián)用。
組織學包括肝活檢。成像包括超聲和/或CT掃描和/或MRI掃描和/或肝臟特異性的放射性示蹤劑成像。
給出以下的實施例作為對某些實施方式的描述，因此，它們僅僅作為示范之用，而不對其本質(zhì)做任何限制。
實施方式1.數(shù)據(jù)收集與處理對所研究的248個對象血清樣品做了去唾液酸化N-聚糖分布圖(圖1)(參見血清樣品及臨床診斷，表1)，我們對所有樣品中均能檢測到的14個峰進行了定量。根據(jù)這14個峰的總峰高強度對它們的豐度進行了標準化。在此，輕度肝硬化定義為具有經(jīng)典Child-Pugh肝硬化分類法的3個生化組分(血清白蛋白、總膽紅素和國際標準化比例，后一個測量凝血速度)參照范圍內(nèi)的值的病例。這3個標記中的1個或多個值超出參照范圍的病例定義為“代償失調(diào)性”肝硬化。因此，以目前的生化肝硬化評估方法進行評估，“輕度肝硬化”病例組會被錯誤地歸到“非肝硬化”組，顯然，對于這一亞組的評估，新型的生物標記意味著真正的改善。我們發(fā)現(xiàn)，在血清N-糖組的14個峰中，有5個峰表現(xiàn)出期望的趨勢，即按照以下順序，其豐度逐漸升高或降低健康的獻血者</>非肝硬化慢性肝病</>輕度肝硬化</>代償失調(diào)性肝硬化，而對照組的豐度則相對“正?！?圖6)。峰1、2和7豐度的增加與峰3和8豐度的降低呈現(xiàn)負相關(Pearson’s r值在-0.5至-0.8之間變動，對所用值P＜0.0001)。因此，通過計算峰1、2和7的增加的豐度對峰8降低的豐度的比值，我們建立了3個變量(圖2)，隨后將這些新型變量進行對數(shù)轉(zhuǎn)換，而將其分布標準化。用這種方法，我們歸納了所關心的3個變量數(shù)據(jù)的變化趨勢，于是只需要對血清N-糖組分布圖中的4個峰進行計量即可(這4個峰在圖1中用框標識出來；根據(jù)以下所述的評估，再將峰3納入考慮范圍并不會增加額外的診斷信息)。
2.肝硬化的檢測對于這3個新型變量中的1個[Log(峰7/峰8)；本文重新命名為GlycoCirrho檢查，在0.005的顯著性水平下(ANOVA，Tukey’s HSD)，輕度肝硬化組(包括那些并發(fā)有肝細胞癌的輕度肝硬化)的平均值與所有其它樣品組的平均值顯著不同。其它2個由血清糖組衍生而來的變量，其平均值也與所有其它樣品組的平均值顯著不同，但是顯著性水平較低(αFW＝0.05)。用非參數(shù)受試者操作特征(Receiver Operating Characteristic)(ROC)曲線分析16，17評估了三種聚糖參數(shù)和{纖維測試(Fibrotest)}對于輕度肝硬化患者(如上定義)和肝硬化前慢性肝病患者的區(qū)別能力。ROC分析的結(jié)果表明如曲線下面積(AUC)測量所得的GlycoCirrho檢查和{纖維測試(Fibrotest)}的分類效率均為85-90％(圖3a，上圖)。其它2個血清糖組衍生參數(shù)的分類效率稍低(Log(峰1/峰8)的AUC＝0.81±0.07，而Log(峰2/峰8，圖3a，下圖)的AUC＝0.81±0.06)。然后，我們計算了ROC曲線的截斷值，并以這些截斷值用二維散點圖將患者分類(圖3b，上圖)。將本研究中2個表現(xiàn)最佳的肝硬化診斷生物標記(基于糖組的GlycoCirrho檢查和{纖維測試(Fibrotest)}二元對數(shù)回歸模型)聯(lián)用所得到的對輕度肝硬化的檢測特異性為100％，靈敏度為75％(18/24)。整體分類效率為93％(76/82)。對至少有1個肝硬化經(jīng)典生化標記(白蛋白、膽紅素、INR)代償失調(diào)的慢性肝病患者組，也用上面計算所得的截斷值對其進行分類(圖3b，中圖)，結(jié)果顯示對于此類晚期肝硬化的靈敏度達到100％。
所以，用我們的新型肝硬化診斷標記組合對診斷患有慢性肝病而成為肝活檢候選者的患者組進行診斷，未得出假陽性結(jié)果，對生化代償性肝硬化病例的檢測靈敏度為75％，而對生化代償失調(diào)性病例，靈敏度達到100％。
3.在肝硬化前纖維化階段，診斷變量的行為將所得數(shù)據(jù)根據(jù)組織學確定的肝纖維化階段做圖18(圖4)，數(shù)據(jù)的趨勢即說明GlycoCirrho檢查比其它2個血清糖組衍生生物標記具有更優(yōu)越的分類效率。從F0/F1階段開始，隨著纖維化階段的升高，Log(峰1/峰8)，尤其是Log(峰2/峰8)的值逐漸上升，而GlycoCirrho檢查則保持穩(wěn)定，或者甚至從F0/F1至F3階段有點下降，僅在肝硬化階段才上升。很顯然，纖維化階段與Log(峰2/峰8)的值接近線性關聯(lián)(Spearman等級相關，p＝0.76)，這就使其很有希望成為纖維化進程(或纖維化不再繼續(xù)發(fā)展)的進度檢查標記。對于{纖維測試(Fibrotest)}模型，觀察到隨著纖維化階段的升高，{Fibro檢查}值呈現(xiàn)S型增長。正如預計的那樣(二元對數(shù)回歸模型以0-1的間隔回歸，接著是在兩端的漸進行為)。在以前的研究中14，報道的S型曲線的轉(zhuǎn)變發(fā)生在大約F2階段。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)變發(fā)生在F3階段。還不清楚這一差異的原因所在。
4.在其它疾病和普通群體樣品中評估GlycoCirrho檢查為了更廣泛地了解新型GlycoCirrho檢查的特性，我們分出了一組紅十字獻血者對照組(普通群體樣品，HBV、HCV和HIV陰性)，其截斷值最適用于肝硬化的檢測。只有2個病例(總共60；3％)評分為輕度陽性結(jié)果(圖3b，下圖)。定期飲酒并不屬于獻血排除標準(因而，在這種設置中，酗酒可能不被注意到)，而這正是開展研究的HCV低發(fā)率地區(qū)(如佛蘭德斯和比利時)發(fā)生肝硬化的主要原因。與這一組相當高的中位數(shù)年齡(61歲)結(jié)合起來看，2-3％的代償性肝硬化的發(fā)生率是在期望范圍之內(nèi)的19。我們還納入了一組由24個自身免疫病患者組成的對照組，因為在大部分這些疾病尤其是類風濕性關節(jié)炎中20，都大量記錄了血清IgG的低半乳糖苷化。顯然，由于血清中IgG的存在量大約為11g/l，并且IgG是該體液中主要的非肝臟產(chǎn)生的糖蛋白，因此，IgG聚糖的修飾情況可以由總血清糖蛋白的聚糖模式反映出來。這樣，我們使用蛋白L親和層析從這24個患者和健康獻血組的6個成員的血清中微量純化了免疫球蛋白，并獲得了這些純化的免疫球蛋白制品的N-聚糖分布圖。正如所預期的那樣，在自身免疫病組中檢測到相對強的低半乳糖苷化，這主要是由非半乳糖苷化的核心-α-1，6-巖藻糖基化聚糖豐度的升高反映出來(圖1中的結(jié)構(gòu)1，比對照平均高出55％，P＝0.01)。而且，圖1中結(jié)構(gòu)7聚糖的豐度平均增長了1倍(P＜0.0001)，由此，我們發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白的N-聚糖被等分GlcNAc殘基取代的水平大大提高。然而，這些增長在大多數(shù)的病例中不足以強烈地擾亂總血清糖蛋白的N-聚糖模式而使他們在GlycoCirrho檢查中得到陽性評分(4/24陽性)。由于沒有獲得足夠的血清，我們不能評估纖維測試在這些患者中的效果。為了評估升高的血清碳水化合物缺乏轉(zhuǎn)鐵蛋白21(CDT)水平是否影響血清N-糖組肝硬化診斷參數(shù)，我們從CDT水平升高和未升高的長期酗酒患者體內(nèi)取得血清樣品。CDT陽性組中，上述3個肝硬化診斷參數(shù)的平均值并沒有顯著區(qū)別于CDT水平正常組的平均值(P＞0.1，Student’s t-測驗)，這表明CDT水平的不同并不影響我們的肝硬化標記。
5.豐度不同的N-聚糖的部分結(jié)構(gòu)分析一篇文獻報道描述了對存在于“健康”人體血清中糖蛋白上的N-聚糖進行三維HPLC做圖22，借助于該文獻，我們能夠得到大量關于肝硬化中調(diào)控方式不同的血清N-聚糖的結(jié)構(gòu)信息。而且，在我們的診斷研究中，所得樣品中感興趣峰的數(shù)值范圍很寬。這對于在后-外切糖苷酶-微陣列分布圖中“跟蹤”感興趣峰有很大幫助。圖5顯示了其中3個樣品的外切糖苷酶測序。在實施例9中有對結(jié)構(gòu)分析的完整描述。結(jié)構(gòu)分析歸納所得的結(jié)論是在肝硬化中，低半乳糖苷化的N-聚糖(峰1和2)豐度增加，等分N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNac)殘基修飾的N-聚糖(峰2和7)增加，而完全半乳糖苷化的二觸角和三觸角的N-聚糖(峰3和8)降低。
6.發(fā)展在常規(guī)分子診斷實驗室中實施該方法的技術
6.1僅用PCR熱循環(huán)儀制備樣品獲得以上血清N-糖組分布圖具有診斷應用價值的證據(jù)以后，我們進一步介紹樣品制備方案的簡化程序。使用標準的熱蓋PCR熱循環(huán)儀，我們發(fā)展了在8小時內(nèi)就能從血清中產(chǎn)出可直接用于分析的標記N-聚糖的程序，該程序包括液體添加/去除和稀釋步驟，而且人為操作時間極少(參見方法部分)。所得的方案基于血清糖蛋白濃度很高，以及我們的聚糖分析方法十分靈敏(可以容易地檢測到15fmol)。因此，在少量血清樣品中可獲得的N-聚糖量與分析所需量之間有很大的空間。于是，我們可利用這種很大的空間在樣品制備方案中降低一些步驟的效率，但卻使操作更簡便。在20個先前曾用我們的標準樣品制備方法分析過的血清樣品上測試了這一方案。用這2種技術確定的先前描述的3個診斷變量值表現(xiàn)出很強的線性關聯(lián)(Pearson’s r≥0.98；圖7)，這就表明新型的基于熱循環(huán)儀的方法可以取代過去使用的更費力的基于穩(wěn)定素P板的樣品制備程序。在我們目前的實驗室操作中，我們已經(jīng)將用于這一方案的所有試劑都以試劑盒的形式裝配到一起，這樣可以平行制備48或96個樣品。
6.2用ABI 310DNA分析儀制作血清N-糖組毛細管凝膠電泳分布圖在分子病理實驗室中已經(jīng)廣泛地使用基于毛細管凝膠電泳的DNA分析儀，這些分析儀用于診斷試驗，包括DNA測序或高分辨率DNA片段分析(實體瘤分析、傳染性疾病診斷，……)。由于其自動化水平高、使用方便，使它們更適用于臨床診斷實驗室的操作，因此，這些分析儀正在迅速取代以往使用的基于凝膠的DNA分析儀。因此，為了能在分子病理實驗室的標準配置中完全實施我們的糖組學試驗，我們在ABI310單毛細管DNA分析儀上優(yōu)化了去唾液酸化總血清N-聚糖的分析步驟。只需對標準的DNA分析程序做少量的修改就能在18min內(nèi)獲得更好的分布圖，甚至比用基于凝膠的ABI377獲得的結(jié)果具有更高的分辨率(圖8)。這樣，在沒有人為操作的情況下，一次過夜運行就能分析48個APTS標記的血清聚糖樣品。與基于熱循環(huán)儀的樣品制備方法聯(lián)用，我們對48個樣品的完成時間為24h，而且，所需的人工干預并不比在分子病理實驗室中進行的典型DNA片段分析反應多。由于已經(jīng)有售多毛細管測序儀，因此，需要的話還可以方便地提高通量。
7.血清樣品和臨床診斷所研究的患有慢性肝病的患者組由根特大學醫(yī)院的腸胃病及肝臟病學系的肝活檢候選患者組成，不論他們潛在的病因(病毒性的、酒精性的、自身免疫性的、病源不明的，參見下文)。得到以下數(shù)據(jù)患者的年齡和性別、血清白蛋白、總膽紅素、INR、AST、ALT、GGT、總血清蛋白、α2-巨球蛋白、結(jié)合珠蛋白和載脂蛋白A1。血清白蛋白、總膽紅素、INR、AST、ALT、GGT和總血清蛋白用模塊分析儀進行檢測(Roch Diagnostics，Basel，瑞士)。結(jié)合珠蛋白、α2-巨球蛋白和載脂蛋白A1在BNII分析儀上用固定時間免疫散射測濁法進行檢測(Dade Behring，Marburg，德國)。α2-巨球蛋白和結(jié)合珠蛋白試驗以國際CRM 470參照材料進行定標(Dati，F(xiàn).等(1996)Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.34，517-520)。根據(jù)IFCC標準對載脂蛋白A1進行標準化(Albers，J.J.&Marcovina，S.M.(1989)Clin.Chem.35.1357-1361)。上述的一個或多個數(shù)據(jù)點缺失的患者排除于研究之外。根據(jù)α2-巨球蛋白、結(jié)合珠蛋白、GGT、年齡、膽紅素、載脂蛋白A1和性別，計算出一個分數(shù)用于{纖維測試}二元對數(shù)回歸模型。這一稱為纖維測試的二元對數(shù)回歸模型是由Dr.T.Poynard創(chuàng)立的(參考材料14、15以及WO0216949)。我們在本發(fā)明中使用以下公式(來源于W00216949)f＝4.467×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-1.357×Log[結(jié)合珠蛋白(g/l)]+1.017×Log[GGT(IU/l)+0.0281×[年齡(年)]+1.737×Log[膽紅素(μmol/l)-1.184×[載脂蛋白A1(g/l)]+0.301×性別(女性＝0，男性＝1)-5.540。在此，我們所說的二元對數(shù)回歸模型是如WO0216949中所采用的模型。根據(jù)Child-Pugh分類法基于生化標準患有代償失調(diào)性肝硬化的患者(至少達到以下一個標準血清白蛋白＜3.5g/dl，血清總膽紅素＞2mg/dl，國際標準比例＞1.7)分類至“代償失調(diào)性肝硬化”組(N＝24)，并且不進行活檢從而避免對這些參與者造成不必要的與研究相關的危險。在82個其他患者中，(沒有信息顯示不應當進行肝臟活檢)，用穿過皮膚的肝活檢來評估肝纖維化階段，并由不知道GlycoCirrho檢查和{纖維測試}結(jié)果的病理學家根據(jù)METAVIR標準進行評分。拒絕接受活檢的患者、或者不能達到可判斷的活檢結(jié)果的患者排除在本研究之外。所有收集到的有關上述106位患者的數(shù)據(jù)及其慢性肝病的病因列于表1中。
表1數(shù)據(jù)是中位數(shù)(四分位數(shù)間距)或病例數(shù)(N％)研究的106位慢性肝病患者的特征

6個月的時間內(nèi)，在血液中存在可檢測到的hepBsAg和HBV DNA或可檢測到的抗HCV抗體和HCV RNA，至少2份血液樣品中的ALT水平上升(高于正常水平的上限)，則診斷患有慢性乙型肝炎和丙型肝炎。根據(jù)國際自身免疫肝炎組織出版的標準(Johnson，J.L.&McFarlane，I.G.(1993)Hepatology 18，998-1005)對自身免疫肝炎進行診斷。通過臨床交談來建立慢性酗酒史。
在患有肝硬化的患者中，將檢測到α-胎兒蛋白的升高以及利用一種成像技術(CT或MRI)發(fā)現(xiàn)血管過度生長病變的病例診斷為肝細胞癌(HCC)。在未檢測到α-胎兒蛋白升高的情況下，將2種成像技術都顯示出血管過度生長病變的病例診斷為HCC。對診斷結(jié)果有所懷疑的患者，則對病灶區(qū)域?qū)嵤㏕rucut針活檢。進行這些診斷的臨床中心是佛蘭德斯地區(qū)的HCC參考中心，該地區(qū)擁有大約6百萬居民(主要是高加索人)，是HCC的低發(fā)地區(qū)。
我們分析了58個懷疑為長期酗酒并且因此獲準進入安特衛(wèi)普Stuivenberg科學醫(yī)院(Academic Hospital Stuivenberg)的精神病學系(安特衛(wèi)普是佛蘭德斯地區(qū)的主要城市)的患者的樣品。用％CDT-TIA測驗(AxisBiochemicals，Oslo，Norway)測定了碳水化合物缺乏轉(zhuǎn)鐵蛋白，并將樣品組分成了2個亞群，一個是CDT測驗陽性亞群(高于6％CDT)，而另一個是陰性亞群。精神病臨床設置規(guī)定不允許對這一患者組獲得更多詳細信息，所以我們不能評估肝病階段，而只能將此患者組用于研究CDT水平升高對我們肝硬化診斷標記的影響。我們將24個患者樣品納入研究范圍，這些患者由根特大學醫(yī)院的風濕病學系的?？婆R床醫(yī)師診斷患有類風濕性關節(jié)炎、或強直性脊柱炎或節(jié)段性腸炎。
為了建立所測聚糖的參考值，我們研究了由60名符合紅十字健康標準(HBV、HCV和HIV陰性)的獻血者組成的對照組。這些樣品取自比利時根特的紅十字輸血中心。
8.使用蛋白質(zhì)L親和層析純化血清免疫球蛋白，并對制備產(chǎn)物做N-聚糖分布圖將5μl血清與130μl磷酸緩沖鹽溶液(PBS)相混合，并與40μl蛋白質(zhì)L-瓊脂糖親和樹脂(Pierce Biotechnology，Rockford，Illinois)在旋轉(zhuǎn)裝置上共同培養(yǎng)1h。然后，用鋪有Durapore膜的96孔板(Millipore，Bedford，Massachusetts)捕獲樹脂，并且用300μl PBS洗滌8次。接著，用250μl 0.1M甘氨酸(pH＝2.0)對結(jié)合的免疫球蛋白洗脫2次。制品中的免疫球蛋白結(jié)合在96孔板中的穩(wěn)定素P上，其余的N-聚糖分析步驟如(Callewaert，N.等(2001)Glycobiology 11，275-281)所述。分布圖中7個最顯著的峰(未顯示)在總信號強度中占有高于％的信號強度，對這些峰進行計量，并根據(jù)總信號強度進行標準化。與本研究相關的峰1和7的數(shù)據(jù)列在下面(表2)。
表2純化的免疫球蛋白上相關N-聚糖的定量


9.以不同方式調(diào)控的N-聚糖的部分結(jié)構(gòu)分析(參見圖5)在一項平行研究中(Callewaert，N.等(2003)Glycobiology 13，367-375)，我們已經(jīng)指定了健康血清分布圖中4個主要峰的結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)及其外切糖苷酶產(chǎn)物在圖5中表示為黑色峰)。得到這些結(jié)構(gòu)大大簡化了在分布圖中跟蹤剩余的、以不同方式調(diào)控的峰這一任務。用不同的外切糖苷酶混合物消化購得的(Glyko，Novato，California)高度純化的具有去唾液酸結(jié)構(gòu)6、7和8(圖5中的編號)的參考聚糖，即得到圖5中的參考圖(在第2和第3列下方的圖)。在所有情況下中均得到了期望的消化產(chǎn)物。為了壓縮圖5的大小，結(jié)構(gòu)6和8的消化電泳圖譜合并在一張圖中，顯示在圖5第2列的下方。結(jié)構(gòu)7(帶有等分GlcNAc殘基)的消化反應電泳圖譜合并顯示在圖5第3列的下方圖中。不同的峰并不是以數(shù)字順序加以討論的，而是以便于論證的順序加以討論。
峰3所確定的峰3的結(jié)構(gòu)(Callewaert，N.等(2003)Glycobiology 13，367-375)是雙觸角的二-β-1，4-半乳糖苷化結(jié)構(gòu)。在HCC和/或肝硬化中，這一聚糖水平下調(diào)，這與其低半乳糖苷化對應物豐度的增加以及其它雙觸角聚糖的增加相一致，這一基本的雙觸角底物是其它雙觸角聚糖的前體。
峰8確定的峰8的結(jié)構(gòu)是2，4-分支的三觸角三-β-1，4-半乳糖苷化聚糖結(jié)構(gòu)(Callewaert，N.等(2003)Glycobiology 13，367-375)。
峰7
在慢性肝炎患者的血清分布圖中(圖5的左側(cè)測序列中第2張圖的第3個箭頭)以及正常人的血清分布圖中(未顯示)，這個峰也以相對較低的豐度存在?？梢苑浅Ｈ菀椎卦诘?張測序列中跟蹤其序列分析，該測序列表示的是我們所收集的患病最嚴重的血清之一。峰7是這張分布圖中豐度排在第3的聚糖，而且該峰和其任何的消化產(chǎn)物都不與上述的任何參考聚糖或它們的消化產(chǎn)物共同遷移。由于對于4個外切糖苷酶的聯(lián)合消化不顯示出共遷移，這就意味著存在著不包含這些參考聚糖的取代物。在4個糖苷酶聯(lián)合消化后，峰7的消化產(chǎn)物比三甘露糖核心寡糖的遷移慢一個葡萄糖單位，這意味著在這個三甘露糖核心中存在一個單糖大小的取代物?？紤]到對健康血清總糖蛋白N-聚糖所做的3D HPLC圖譜(Nakagawa H.等(1995)Anal.Biochem.226，130-138)，這只可能是一個等分的GlcNAc。在此處所用的條件下，這一取代物不能被Jack Bean β-N-乙酰氨基己糖苷酶消化。等分的雙觸角核心巖藻糖基化參考聚糖上的等分GlcNAc殘基也能抵抗β-N-乙酰氨基己糖苷酶，這就證實了上述的說法，(參見圖5，第3個測序列下方的參考圖)。巖藻糖苷酶消化使峰7的遷移位置移動了1.2個葡萄糖單位，這表明存在有核心-α-1，6-連接巖藻糖殘基。再用β-1，4-半乳糖苷酶進一步消化則使峰又移動了2個葡萄糖單位，這就表明存在2個β-1，4-半乳糖殘基。因此，我們得出的結(jié)論是，峰7代表等分的雙觸角、二-β-1，4-半乳糖苷化、核心-α-1，6-巖藻糖苷化聚糖結(jié)構(gòu)。該結(jié)論由以下實驗結(jié)果得到證實，即所有的峰7的消化產(chǎn)物都與具有這一結(jié)構(gòu)的參考聚糖的對應消化產(chǎn)物一同被洗脫(圖5的第3個測序列底部的圖片)。這一等分GlcNAc取代物是N-乙酰葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶III(GnT-III)對峰6所代表結(jié)構(gòu)、峰3的核心-α-1，6-巖藻糖變異體作用的產(chǎn)物(峰6的結(jié)構(gòu)由附屬研究所確定(Callewaert，N.等(2003)Glycobiology13，367-375)。
峰1用巖藻糖苷酶消化后，峰1遷移了1.2個葡萄糖單位，移動到單半乳糖雙觸角參考聚糖的位置(中間測序列底部參考圖中的第一個峰)。而且，用半乳糖苷酶消化后，該位置的峰達到很高的峰強度，這是因為峰6移動到了這個位置(峰6的結(jié)構(gòu)二半乳糖核心-巖藻糖苷化雙觸角聚糖)。將這些數(shù)據(jù)一起考慮，則表明峰1是雙觸角、單半乳糖核心-α-1，6-巖藻糖苷化聚糖。因此，在HCC和/或肝硬化樣品組中，該峰的上調(diào)代表了血清糖蛋白低半乳糖苷化和核心巖藻糖苷化增加的共同結(jié)果。
峰2由于其豐度相對較低，該峰的鑒別更加困難。然而，可以獲得足夠的信息來斷定其結(jié)構(gòu)用唾液酸酶和β-1，4-半乳糖苷酶雙酶消化得到的分布圖中，唾液酸圖中峰7的產(chǎn)物完全與峰2的產(chǎn)物共遷移。隨后，由于在該尺度下左側(cè)測序列(肝炎樣品)中并未觀察到峰2，我們可以在可檢測到峰2的唾液酸+巖藻糖苷酶對其它2個樣品的雙酶消化模式中鑒別其外切糖苷酶產(chǎn)物。用巖藻糖消化后，在峰2的位置上沒有任何峰存在，而且只有一個新出現(xiàn)的峰可能是消化產(chǎn)物(用灰色高亮，中間測序列的唾液酸+巖藻糖苷酶分布圖中的第1個箭頭)。在三酶消化分布圖中(再用β-1，4-半乳糖苷酶進行消化)，該峰強度更大，這是因為峰7的消化產(chǎn)物與其共遷移。再用氨基己糖苷酶補充消化，則在這個位置不再留下任何峰的痕跡。據(jù)此，我們得出的結(jié)論是，峰2代表雙觸角、單半乳糖核心-α-1，6-巖藻糖苷化結(jié)構(gòu)。因此，該峰結(jié)合了峰3和峰7的結(jié)構(gòu)改變，也就是，它是非半乳糖苷化的并且具有等分GlcNAc殘基。
峰9過去對峰9已經(jīng)進行過鑒定(Callewaert，N.等(2003)Glycobiology13，367-375)，它是一個三觸角三半乳糖結(jié)構(gòu)的分支巖藻糖苷化衍生物。
總的說來，在肝硬化中，低半乳糖苷化的N-聚糖(峰1和2)的豐度增加，等分N-乙酰葡萄糖氨(GlcNAc)殘基修飾的N-聚糖(峰2和7)增加，而完全半乳糖苷化的雙觸角和三觸角N-聚糖(峰3和8)降低。
10.用唾液酸化的N-聚糖分布圖檢測纖維化獲得了存在于131個血清樣品中的總蛋白混合物的唾液酸化N-聚糖分布圖。60個樣品由健康獻血者提供，HBV和HCV陰性。假定這個組沒有嚴重的肝纖維化(HAI纖維化級別0)，雖然這可能稍微低估了他們的纖維化情況。12位患者經(jīng)組織學檢測確定僅患有門靜脈纖維化而沒有發(fā)生橋連(HAI纖維化級別1)。4位患者罹患橋連的纖維化(HAI纖維化級別3)，而45位患者患有纖維化(HAI纖維化級別4)。該實驗的詳細解釋可以參見圖9的圖例。N-聚糖的加工方法如材料和方法中所述，除了其中的唾液酸酶消化步驟在此被省略。
材料和方法1.血清樣品和臨床診斷臨床研究得到Ghent大學醫(yī)院地方道德倫理委員會的批準，并得到所有血清提供者的知情允諾。下面的患者的詳細特征和臨床診斷程序可以在實施例7中找到。
2.血清蛋白N-糖組樣品處理取5μl血清(總共248)，在其中的蛋白質(zhì)結(jié)合到鋪有穩(wěn)定素P的96孔板后，將存在于蛋白質(zhì)上的N-聚糖釋放出來，用8-氨基芘-1，3，6-三磺酸制備衍生物，去唾液酸，在ABI 377A DNA測序儀5(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，California)上進行分析。最有利于聚糖釋放和標記的使用PCR熱循環(huán)儀的優(yōu)化方案如下往含有5μl血清的PCR小管中加入1μl含有10％SDS的20mM的NH4Ac緩沖液(pH＝7)。將這些小管放入有熱蓋的標準PCR熱循環(huán)儀中，95℃條件下加熱5min。冷卻后，加入1μl 10％的NP-40溶液，用以中和SDS對肽N-糖苷酶F(PNGase F，Glyko，Novato，California)的變性效果。加入1IUBMB mU PNGase F后，關上管蓋，并將它們置于熱循環(huán)儀中，37℃孵育3h。然后，加入8μl 50mM的NaAc(pH5.0)，再加入2μU的A.ureafaciens唾液酸酶(Glyko，Novato，California)并且將小管置于熱循環(huán)儀中，37℃孵育3h。轉(zhuǎn)移1μl所得溶液至一個新的PCR小管，并在65℃的條件下打開熱循環(huán)儀的蓋子和管蓋，直至小管中液體蒸發(fā)至干燥。這一蒸發(fā)過程在5min之內(nèi)完成，然后，往管底加入1.5μl標記溶液5。將蓋緊的小管在90℃條件下加熱1h。(升高溫度可以確保有較快的反應動力學)。往每個小管中加入150μl水以終止反應，并且將標記稀釋至約100pmol/μl。所得溶液在ABI 377上進行分析，方法如上所述，或者在裝備有標準47cm ABI DNA-分析毛細管的ABI 310儀器上進行分析，其方法如下所述我們使用遺傳分析緩沖液以1∶3的稀釋度稀釋專賣的POP6聚合物(所有材料均購自Applied Biosystems)，將其作為分離基質(zhì)。將APTS-衍生的血清聚糖溶液以1∶25的稀釋度稀釋于去離子的甲酰胺中(參見上面段落)而制備成注射混合物。注射條件為15kV，5秒，然后在15kV和30℃的條件下分離18分鐘。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，將羅丹明標記的Genescan2500(ABI)參考梯度用于稀釋液中，作為內(nèi)標。進行這些分析，除了如前所述5將外部冷卻水浴與ABI 377聯(lián)合外，不需要對測序儀的硬件和軟件(參見下文)做任何改動。
3.數(shù)據(jù)處理使用Genescan 3.1軟件(Applied Biosystems)進行數(shù)據(jù)分析。我們對在所有樣品中均能檢測到的14個峰的高度進行定量，而獲得對分布圖的數(shù)字描述，用SPSS 11.0(SPSS Inc.，Chicago，Illinois)分析這些數(shù)據(jù)。用Kolmogorov-Smirnov測驗在0.05這一顯著水平評估所研究人群中變量的常態(tài)分布假設。先對變量進行單向分析，然后在αFW＝0.0001的水平下進行Tukey’s真實顯著性差異檢測。我們在SPSS 11.0中使用受試者操作特征(Receiver Operating Characteristic)(ROC)曲線分析來評估候選診斷變量的分類效率。圖4中的曲線是用非參數(shù)Lowess回歸得到的。
4.用外切糖苷酶陣列測序分析N-聚糖庫的部分結(jié)構(gòu)根據(jù)上述程序制得的APTS標記的N-聚糖以每組1μl的批量用不同的外切糖苷酶的混合物在20mM NaAc pH5.0中進行消化。所用的酶是Arthrobacter ureafaciens唾液酸酶(2U/ml，Glyko)、肺炎雙球菌β-1，4-半乳糖苷酶(1U/ml，Boehringer，Mannheim，德國)、Jack bean β-N-乙酰氨基己糖苷酶(30U/ml，Glyko)和牛附睪α-巖藻糖苷酶(0.5U/ml，Glyko)。酶單位的定義根據(jù)酶供應商的說明。消化完成后，將樣品蒸發(fā)至干燥，在1μl水中重建，并以如上所述的方法在ABI377上進行分析。
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權(quán)利要求
1)一種檢測哺乳動物中肝纖維化或肝纖維化級別變化的方法，該方法包括a)產(chǎn)生以下物質(zhì)的分布圖碳水化合物或其衍生片段、或所述碳水化合物或所述片段的標記衍生物、或由所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的結(jié)構(gòu)所確定的所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的特征；所述碳水化合物或所述片段存在于復合糖的混合物中，或者是從存在于或分離自所述哺乳動物體液樣品中的復合糖混合物中獲得，和b)測定步驟a)的分布圖中至少一種碳水化合物或由其衍生片段或所述碳水化合物或所述片段的標記衍生物的數(shù)量，或者測定存在于所述碳水化合物分布圖中至少一種碳水化合物或其衍生片段的特征，和c)將步驟b)中所得的測量數(shù)據(jù)與未患肝纖維化的哺乳動物的分布圖中獲得的測量數(shù)據(jù)相比較，用以檢測肝纖維化，或者，將步驟b)中所得數(shù)據(jù)與先前在所述哺乳動物中測定的數(shù)據(jù)相比較，用以檢測肝纖維化的級別變化，以及d)對步驟c)中得到該比較結(jié)果進行歸因，以檢測哺乳動物的肝纖維化或肝纖維化級別的變化。
2)根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述至少一種碳水化合物選自i)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，3)[GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)[Fuc(α-1，6)]GlcNAc(聚糖1)，ii)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，3)[GlcNAc(β-1，4)][GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)[Fuc(α-1，6)]GlcNAc(聚糖2)，iii)Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，3)[GlcNAc(β-1，4)][Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)[Fuc(α-1，6)]GlcNAc(聚糖7)，iv)Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)[Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)]Man(α-1，3)[Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)GlcNAc(聚糖8)，v)聚糖1、2、7或8的衍生片段，vi)聚糖1、2、7或8的唾液酸化衍生物，vii)聚糖1、2、7或8或其衍生物或其片段的特征。
3)根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于，所述的數(shù)量以聚糖1和聚糖8和/或聚糖2和聚糖8和/或聚糖7和聚糖8或其片段，唾液酸化衍生物或其特征之間的相對數(shù)量來測定。
4)根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于，用所述的聚糖2和聚糖8或其片段，唾液酸化衍生物或其特征之間的相對數(shù)量來檢測肝硬化級別線性變化。
5)根據(jù)權(quán)利要求1-4的方法，其特征在于，所述的哺乳動物是人。
6)根據(jù)權(quán)利要求1-5的方法，其特征在于，所述的體液是血清或血漿。
7)一種檢測肝纖維化或肝纖維化級別變化的診斷試劑盒，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求1-6的方法進行操作。
8)根據(jù)權(quán)利要求1-7的檢測哺乳動物中肝纖維化或肝纖維化級別變化的方法，其特征在于，該方法還包括對所述哺乳動物的生理狀況，如臨床化學參數(shù)，進行定量和定性的評估值的測量。
9)根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其特征在于，所述的臨床化學參數(shù)的檢測包括如WO0216949中所述的纖維測試(fibrotest)。
全文摘要
本發(fā)明提供檢測哺乳動物中肝纖維化或肝纖維化級別變化的方法和試劑盒。診斷標記基于存在于體液例如血清中的診斷性碳水化合物的分布圖以及對這些碳水化合物的鑒定。
文檔編號G01N33/66GK1759320SQ200480006752
公開日2006年4月12日 申請日期2004年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月14日
發(fā)明者R·康特里拉斯, N·卡勒瓦特 申請人:Vib研究所, 根特大學