專利名稱：微生物交叉抗原的篩選與鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高通量篩選和鑒定微生物交叉抗原的方法。
背景技術(shù)：
業(yè)已證明，采用疫苗接種是預(yù)防微生物性疾病的有效途徑。由于病原菌較多，對所有病原菌逐一進行接種具有一定困難。這在養(yǎng)殖動物微生物性疾病的預(yù)防上，表現(xiàn)得極為突出。因為在實際生產(chǎn)中，如針對養(yǎng)殖動物的所有常見致病菌逐一進行免疫在經(jīng)濟上和操作上是不可能的。因此，研制新型疫苗，以控制有關(guān)疾病，特別是養(yǎng)殖動物病害是一項緊迫任務(wù)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)不同細菌間的脂多糖(LPS)和核心抗原具有交叉保護作用。新近，我們發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌之間具有明顯的交叉保護作用，并采用蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合免疫保護攻毒技術(shù)從嗜水氣單胞菌的外膜蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了2個多價疫苗靶位。這些結(jié)果說明，細菌間存在交叉中和原性基因。因此，研制基因工程多價疫苗將成為今后疫苗發(fā)展的最重要方面。多價疫苗靶位來自具有交叉反應(yīng)的免疫原，但采用常規(guī)方法從全部微生物蛋白質(zhì)中鑒定所有具有交叉免疫原性的蛋白質(zhì)十分困難。目前對交叉免疫原的發(fā)現(xiàn)往往是從一種偶然觀察到的交叉免疫現(xiàn)象中認定，或者是對單個基因的確定，因此，效率不高。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是一種高通量篩選的技術(shù)，是功能基因組研究的重要平臺，通過由蛋白質(zhì)組學(xué)與免疫印跡(Western blotting)技術(shù)相結(jié)合而發(fā)展起來的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)(immunoproteomics)技術(shù)，已在患者血清中鑒定了白色鏈球菌(Candida albicans)和砂眼衣原體(Chlamydia trachomatis)的免疫原性蛋白質(zhì)。這些免疫性抗原可作為監(jiān)測疾病進展的一種指標(biāo)，將成為研制新疫苗的對象，有助于擺脫傳統(tǒng)疫苗研制的束縛，加快新疫苗的研制。但現(xiàn)有的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)僅能確定具有免疫原性的蛋白質(zhì)，而無法確定該蛋白質(zhì)是否具有交叉免疫原性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種高通量篩選和鑒定微生物交叉抗原的方法，其技術(shù)方案是利用雙向電泳(2-DE)技術(shù)使微生物蛋白質(zhì)展示在一個平面上，再采用多種抗血清(同種抗血清和異種抗血清)的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，確定具有交叉免疫原性的蛋白質(zhì)，最后采用質(zhì)譜技術(shù)分析和鑒定這些免疫原。
本發(fā)明所說的微生物交叉抗原的篩選和鑒定方法的具體步驟如下
1)用雙向電泳法分離微生物蛋白質(zhì)將微生物收集后，按質(zhì)量比微生物∶超聲緩沖液＝1∶2～4加入超聲緩沖液，超聲波破碎，然后進行雙向電泳。
2)雙向電泳后，進行免疫轉(zhuǎn)印，分別采用多種抗血清作為第一抗體，酶標(biāo)抗體為第二抗體，用聯(lián)苯二胺(DAB)或電化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色，當(dāng)作為第一抗體的抗血清有2種以上為陽性時，該點即為具有交叉免疫原性的蛋白質(zhì)。
3)再分析這些免疫原的交叉程度和范圍，陽性抗血清越多，交叉反應(yīng)范圍越大；陽性顯色越強，交叉反應(yīng)程度越好。
4)免疫原的定性取出具有交叉免疫原性的全部蛋白質(zhì)，按常規(guī)質(zhì)譜樣品處理方法進行樣品制備，然后進行質(zhì)譜和生物信息分析，以確定抗原的蛋白質(zhì)種類。
所說的微生物為細菌，真菌，病毒。
所說的超聲緩沖液可選用Tris-HCl或乙二胺四醋酸鹽(EDTA)等。
超聲破碎時所采用的輸出功率、時間、次數(shù)和時間間隔等可按研究對象進行調(diào)整，一般可采用每次10～20秒，間隔20～40秒，超聲2～4次。
所說的多種抗血清選用抗同種微生物和異種微生物的特異性抗血清。
本發(fā)明先利用雙向電泳技術(shù)使細菌或病毒蛋白質(zhì)展示在一個平面上，再采用同種和異種血清的Western blotting以確定具有免疫原性的蛋白質(zhì)，最后利用質(zhì)譜技術(shù)和生物信息分析確定這些交叉免疫原性蛋白質(zhì)的種類。從而建立了一種采用多種抗血清作為第一抗體的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，用于高通量篩選具有交叉免疫原性的蛋白質(zhì)以作為多價疫苗的候選靶位。根據(jù)免疫原的交叉程度和范圍，可以確定其作為交叉免疫原的可能性及其作用范圍。本發(fā)明可迅速確定某種微生物的具有交叉免疫原性的全部蛋白質(zhì)，從而達到高效、快速、經(jīng)濟、實用的優(yōu)選交叉免疫原的目的。本發(fā)明能夠高通量篩選具有交叉原性的疫苗候選位點，為確定作為多價疫苗靶位的基因奠定了扎實基礎(chǔ)，提高了制備多價疫苗靶點的效率。由于所有微生物作為抗原免疫動物后，機體均會產(chǎn)生針對其抗原的特異性抗體，這些抗體均可以作為第一抗體進行Western blotting試驗，用于篩選交叉免疫原。故本發(fā)明的原理與方法具有普遍性，不僅可以用于細菌，而且還可以用于真菌和病毒等微生物交叉抗原的鑒定。
本發(fā)明進一步發(fā)展了免疫蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，即建立一種采用多種抗血清作為第一抗體的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，從而可以確定與一種以上抗血清發(fā)生免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)。由于這一設(shè)計是基于高通量篩選的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，故不僅可以快速確定某種微生物中所具有的交叉免疫原，而且可以得知這些免疫原的交叉范圍。根據(jù)這些免疫原的交叉程度和范圍，可以確定作為多價疫苗靶位的可能性和作用范圍。


圖1為副溶血弧菌的雙向電泳及其自身和異種抗血清的免疫轉(zhuǎn)印結(jié)果。其中，A、副溶血弧菌外膜蛋白質(zhì)的2-DE圖譜；B、副溶血弧菌抗血清與副溶血弧菌外膜蛋白質(zhì)的2-DEWestern-blot結(jié)果；C、嗜水氣單胞菌抗血清與副溶血弧菌外膜蛋白質(zhì)的2-DEWestern-blot結(jié)果；D、河弧菌抗血清與副溶血弧菌外膜蛋白質(zhì)的2-DE Western-blot結(jié)果；E、溶藻弧菌抗血清與副溶血弧菌外膜的2-DE Western-blot結(jié)果。
圖2為大腸桿菌的2-DE及其自身和異種抗血清的Western blotting結(jié)果。其中，A、大腸桿菌外膜蛋白質(zhì)的2-DE圖譜；B、溫和氣單胞菌抗血清與大腸桿菌外膜蛋白質(zhì)的2-DEWestern-blot結(jié)果；C、大腸桿菌抗血清與大腸桿菌外膜蛋白質(zhì)的2-DE Western-blot結(jié)果；D、副溶血弧菌抗血清與大腸桿菌外膜蛋白質(zhì)的2-DE Western-blot結(jié)果；E、河弧菌抗血清與大腸桿菌外膜蛋白質(zhì)的2-DE Western-blot結(jié)果。
具體實施例方式
以下實施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明的工藝步驟及其突出效果作進一步說明。
實施例11、細菌培養(yǎng)、計數(shù)、收集和破碎微生物采用副溶血弧菌，為本室保存菌種。將副溶血弧菌接種于LB培養(yǎng)基，28℃搖床培養(yǎng)18h，作為種子菌。而后以1∶50(菌液∶培養(yǎng)基)(體積比)比例接種于上述同種培養(yǎng)基，28℃搖床培養(yǎng)18h。培養(yǎng)結(jié)束后，取2mL菌液進行平板菌落計數(shù)。其余培養(yǎng)液于4000rpm離心10min，收集菌體，用生理鹽水洗滌菌體3次，稱菌體重，再用以1∶3(質(zhì)量比)的比例加入超聲破碎緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，1mmol/LEDTA)。用超聲細胞破碎儀超聲破碎。超聲破碎采用輸出功率40％，每次10～20秒，間隔20～40秒，超聲2～4次。
2、抗病原菌抗血清的制備培養(yǎng)18h的副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、嗜水氣單胞菌、河弧菌，4000rpm離心10min；用0.65％生理鹽水懸浮，血球計數(shù)板計數(shù)，將菌液稀釋至1×108個/mL；分別注射小鼠，每只0.1mL，對照組注射生理鹽水；每隔1周注射1次；第3周免疫后的第10天處死小鼠取血，靜置；4000rpm離心10min，取出血清，分裝，-20℃保存。
3、外膜蛋白的提取超聲破碎后的副溶血弧菌液，2500g，4℃離心10min，收集上清。上清液100，000g，4℃離心40min。棄上清，沉淀用2％月桂?；彼徕c(配于50mmol/LTris-HCl，pH7.4)洗滌，室溫放置20min。100,000g，4℃離心40min。沉淀溶于一定體積超聲緩沖液中。用Bradford法測定樣品中蛋白質(zhì)濃度。
4、雙向電泳法操作步驟第一向預(yù)電泳200V 15min，300V 30min，400V 2h，上樣(樣品為副溶血弧菌液)后電壓400V，18h等電聚焦后迅速取出膠條，平衡后移至10％十二烷基磺酸納一聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠上繼續(xù)電泳，其一端外側(cè)加上標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，1％瓊脂糖封固。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍R-250染色，掃描，輸出照片。參見圖1-A，結(jié)果顯示，比較清楚的蛋白點40余個。
5、Western-blotting操作步驟雙向電泳結(jié)束后，進行電轉(zhuǎn)，恒壓40V電轉(zhuǎn)過夜；電轉(zhuǎn)結(jié)束后，用麗春紅染色檢測電轉(zhuǎn)的效果；洗去麗春紅，加封閉液(脫脂奶粉用TTBS配制為5％終濃度)封閉，室溫孵育1h；三羥甲基氨基甲烷-鹽酸-吐溫20緩沖液(TTBS)洗膜，3次，每次5min；分別加入鼠抗副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、嗜水氣單胞菌、河弧菌抗血清(用封閉液配制)，室溫孵育1h；取出膜，TTBS洗膜3次，每次10min；加入辣根過氧標(biāo)記的山羊抗鼠抗體(用封閉液配制)，室溫孵育1h；取出膜，TTBS洗膜3次，每次10min；50mmol/LpH7.4 Tris-HCl洗膜5min；DAB顯色；終止反應(yīng)，掃描，封好膜，保存。Western-blotting分析，結(jié)果有8個抗原出現(xiàn)明顯的交叉結(jié)合反應(yīng)(見圖1-B～E)，分別編號為1～8。
6、質(zhì)譜樣品的制備用一干凈解剖刀切下目的蛋白點，從無蛋白質(zhì)污染區(qū)切下一塊大致相同的膠塊為對照，把膠塊切成約1mm3大小，置于0.5ml試管中，接著按以下步驟進行用50％乙腈(ACN)洗膠塊以脫掉考馬斯亮藍(2～3次×15min)，棄50％ACN；100％ACN覆蓋膠塊至白色，棄ACN；接著用0.1mol/L NH4HCO3泡脹，然后反復(fù)用ACN/0.1mol/LNH4HCO3洗至無色，真空離心干燥。用10mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)/0.1mol/L NH4HCO3于56℃還原45min后，再用新鮮配置的55mmol/L碘乙酰胺/0.1mol/LNH4HCO3烷基化，避光30min。重復(fù)上述步驟至脫色干凈。真空離心干燥后加入胰酶(Trypsin)(12.5μg/mL)冰上孵育45min，吸掉多余酶液后加入無酶消化液，37℃過夜。依次用5％三氟乙酸(TFA)和50％ACN/2.5％TFA反復(fù)抽提1～2次，合并上清液，真空離心干燥。點樣前加1～2μL 0.1％TFA溶解樣品。
7、肽質(zhì)量指紋圖譜樣品的分析和數(shù)據(jù)庫查詢質(zhì)譜樣品使用德國BRUKER公司的基質(zhì)輔助激光解析電離(ReFlexTMIII MALDI-TOF)質(zhì)譜儀進行分析，反射模式，離子源加速電壓1為20kv，加速電壓2為23kv，N2激光波長337nm，脈沖寬度為3ns，離子延遲提取2000ns，真空度1.4×10-7Torr，質(zhì)譜信號單次掃描累加50次，并用標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子峰作為外標(biāo)校正質(zhì)譜峰，正離子譜測定，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜。
通過Mascot(http//www.matrixscience.com.)數(shù)據(jù)庫選擇NCBI，種屬選擇otherproteobacteria.Peptident(http//www.expasy.org/tools/peptident.htmL).數(shù)據(jù)庫選擇Swiss-prot，種屬選擇其它細菌(other bacteria).用ExPASy Molecular Biology Server網(wǎng)站提供的Peptident軟件(http//www.expasy.org/tools/peptident.html)進行查詢。查詢條件肽質(zhì)量指紋圖譜中的肽片段質(zhì)量控制在800～3500，表觀分子量的誤差范圍為±20％，對表觀pI值未作要求，肽片段分子量最大容許誤差范圍為±0.5Da，每個肽允許有2個不完全裂解位點，物種來源選擇細菌，離子選擇[M+H]+(數(shù)據(jù)庫中的選項，無中文名)和單一同位素(monoisotopic)，最少匹配肽片段數(shù)規(guī)定為4，半胱胺酸為碘乙酰胺處理。鑒定結(jié)果見表1。
表1副溶血弧菌與自身和異種抗血清的交叉反應(yīng)蛋白質(zhì)的MALDI-TOF/MS鑒定

實施例2 除細菌改為大腸桿菌外，其余均與實施例1相同。結(jié)果如下1、大腸桿菌細胞外膜的2-DE圖譜采用2-DE技術(shù)，對大腸桿菌的細胞外膜進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約40個蛋白點，見圖2-A。
2、免疫原性蛋白確定采用Western blotting技術(shù)，分別以鼠抗溫和氣單胞菌、大腸桿菌、副溶血弧菌、河弧菌抗血清和HRP-兔抗小鼠為第一和第二抗體，按試驗程序進行Western blotting分析，結(jié)果有6個抗原出現(xiàn)明顯的結(jié)合反應(yīng)，分別編號為1～6。大腸桿菌細胞外膜的Western blotting的結(jié)果見圖2-B～E。
3、MALDI-TOF肽質(zhì)量指紋譜分析采用生物質(zhì)譜對6個具有交叉免疫原性的蛋白點進行分析，分別得到各自的肽質(zhì)量指紋圖譜。
根據(jù)獲得的肽指紋譜數(shù)據(jù)和分子量范圍及其他一些參數(shù)，通過Peptident軟件查詢SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫中與之匹配的蛋白質(zhì)，搜索結(jié)果如表2所示。
表2.大腸桿菌與自身和異種抗血清的交叉反應(yīng)蛋白質(zhì)的MALDI-TOF/MS鑒定

權(quán)利要求
1.微生物交叉抗原的篩選與鑒定方法，其特征在于其步驟如下1)用雙向電泳法分離微生物蛋白質(zhì)將微生物收集后，按質(zhì)量比微生物∶超聲緩沖液＝1∶2～4加入超聲緩沖液，超聲波破碎，然后進行雙向電泳；2)雙向電泳后，進行免疫轉(zhuǎn)印，分別采用多種抗血清作為第一抗體，酶標(biāo)抗體為第二抗體，用聯(lián)苯二胺或電化學(xué)發(fā)光試劑顯色，當(dāng)作為第一抗體的抗血清有2種以上為陽性時，該點即為具有交叉免疫原性的蛋白質(zhì)；3)再分析這些免疫原的交叉程度和范圍，陽性抗血清越多，交叉反應(yīng)范圍越大；陽性顯色越強，交叉反應(yīng)程度越好；4)免疫原的定性取出具有交叉免疫原性的全部蛋白質(zhì)，按常規(guī)質(zhì)譜樣品處理方法進行樣品制備，然后進行質(zhì)譜和生物信息分析，以確定抗原的蛋白質(zhì)種類。
2.如權(quán)利要求1所述的微生物交叉抗原的篩選與鑒定方法，其特征在于所說的微生物為細菌，真菌，病毒。
3.如權(quán)利要求1所述的微生物交叉抗原的篩選與鑒定方法，其特征在于所說的超聲緩沖液選用Tris-HCl或乙二胺四醋酸鹽。
4.如權(quán)利要求1所述的微生物交叉抗原的篩選與鑒定方法，其特征在于超聲破碎時每次10～20秒，間隔20～40秒，超聲2～4次。
5.如權(quán)利要求1所述的微生物交叉抗原的篩選與鑒定方法，其特征在于所說的多種抗血清選用抗同種微生物和異種微生物的特異性抗血清。
全文摘要
微生物交叉抗原的篩選與鑒定方法，涉及一種高通量篩選和鑒定微生物交叉抗原的方法。用雙向電泳法分離微生物蛋白質(zhì)，再免疫轉(zhuǎn)印，多種抗血清作為第一抗體，酶標(biāo)抗體為第二抗體，顯色后檢查其陽性；分析免疫原的交叉程度和范圍；免疫原的定性，確定抗原的蛋白質(zhì)種類。建立了一種采用多種抗血清作為第一抗體的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，用于高通量篩選具有交叉免疫原性的蛋白質(zhì)以作為多價疫苗的候選靶位。根據(jù)免疫原的交叉程度和范圍，可以確定其作為交叉免疫原的可能性及其作用范圍。可迅速確定某種微生物的具有交叉免疫原性的全部蛋白質(zhì)，高效、快速、經(jīng)濟、實用。其方法具有普遍性，不僅可用于細菌，而且還可用于真菌和病毒等微生物交叉抗原的鑒定。
文檔編號G01N33/544GK1563982SQ20041003328
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月14日
發(fā)明者彭宣憲, 徐常新, 彭博, 王三英 申請人:廈門大學(xué)