專利名稱：應(yīng)用非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒的綜合抗原以檢測(cè)鼻咽癌病人治療前后的血清反應(yīng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是屬于使用方法的范疇，有關(guān)應(yīng)用非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒(Epstein-Barr簡(jiǎn)稱EB)病毒的綜合抗原以檢測(cè)鼻咽癌病人在治療前后的血清反應(yīng)。
在東南亞，鼻咽癌是一種很常見(jiàn)的腫瘤，高發(fā)區(qū)包括中國(guó)南部[Zeng，IntJ Cancer 36545，1985]、香港[Ho，Br J Cancer 37356，1978]、臺(tái)灣[Lynn，J Laryngol Otol 99567，1985]、新加坡[Zhu，Int J Cancer 37689，1986]，以及馬來(lái)西亞[Mathew，Cancer Immunol Immunother 3868，1994]，即一些較多華人或是華裔的地區(qū)。年齡調(diào)整后的年發(fā)生率約每年每十萬(wàn)人口三人至六十人左右[Muir，IARC Sci Publ 5840，1987]。遺傳傾向、飲食習(xí)慣、環(huán)境因素和病毒感染都與鼻咽癌的高發(fā)率有關(guān)[Ho，Br J Cancer 37356，1978；Chan，Int J Cancer 32171，1983；Zeng，Int J Cancer 36545，1985；Mathew，Cancer Immunol Immunother 3868，1994；Zheng，Acta Oncol33867，1994]。在這些因素當(dāng)中，非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒，Epstein-Barr病毒(EB病毒)，感染被認(rèn)為是與疾病的發(fā)展最有關(guān)。在鼻咽癌細(xì)胞中，不僅常能檢測(cè)到EB病毒的基因產(chǎn)物[Desgranges，Int J Cancer 2987，1982；Wu，Am J Pathol 1381461，1991；Feinmesser，N Engl J Med32617，1992，Yeung，Int J Cancer 53746，1993]，鼻咽癌患者血清中對(duì)EB病毒抗原的IgA和IgB也都較常人高出許多[Henle，J Natl Cancer Inst51361，1973；Ho，Br J Cancer 37356，1978；Cheng，Proc Natl Acad SciUSA 776162，1980]。
因此，EB病毒的血清研究、病毒研究、病理研究、免疫研究及分子生物研究，也最常被用來(lái)評(píng)估鼻咽癌疾病治療前后的狀況[Henle，J Natl CancerInst 51361，1973；Cheng，Proc Natl Acad Sci USA 776162，1980]。雖然某些研究結(jié)果顯示EB病毒的血清抗體效價(jià)與病人治療預(yù)后有關(guān)，但是，不同研究結(jié)果所產(chǎn)生的結(jié)論并不一致[Henle，J Natl Cancer Inst 51361，1973；Cheng，Proc Natl Acad Sci USA 776162，1980]。不同研究結(jié)論的產(chǎn)生，可能是不同的研究單位所采用的特殊EB病毒抗原，僅具有限的適用范圍所致；或者是因?yàn)樵诎┘?xì)胞中的EB病毒并不只是潛伏性感染而已[Fhraeus，Int J Cancer 42329，1998；Chow，Therapeut Radiol Oncol2243，1995]。最近，本實(shí)驗(yàn)室采用綜合EB病毒于潛伏性感染以及急性感染期所表現(xiàn)的抗原，例如，EBNA-1和EA-D，以檢測(cè)新鼻咽癌患者，其檢測(cè)敏感性竟可達(dá)到98.1％的檢測(cè)率[Chow，Cancer Epidemiol Biomarkers &Prev 6363，1997]。但上述兩項(xiàng)抗原的結(jié)合以檢測(cè)病人的血清并不能表現(xiàn)病人治療的效果或病情的發(fā)展。
如前所述，雖然鼻咽癌曾被認(rèn)為與EB病毒的潛伏性感染有關(guān)，但是從鼻咽癌患者的血清研究所得的結(jié)果，大多數(shù)的病人具有持續(xù)性對(duì)EB病毒的高效價(jià)IgA，顯示問(wèn)題可能不是一般所想像的簡(jiǎn)單[Henle，J Natl CancerInst 51361，1973；Ho，Br J Cancer 37356，1978；Zeng，Int J Cancer36545，1985]。對(duì)EB病毒的某特定抗原的高效價(jià)IgA，顯示宿主的免疫系統(tǒng)是在某特定的表皮性位置上，受到此特定抗原持續(xù)性的刺激所致[Stolzenberg，Int J Cancer 66337，1996；Chow，Cancer EpidemiolBiomarkers & Prev 6363，1997]。還有，對(duì)EB病毒早期和晚期基因產(chǎn)物以及病毒囊包蛋白抗原(VCA)的高效價(jià)抗體，更顯示病人的免疫系統(tǒng)可能最近才與這些抗原，甚至是與成熟的病毒顆粒相遇過(guò)[Chow，TherapeutRadiol Oncol 2243，1995Chow，Cancer Epidemiol Biomarkers & Prev6363，1997]。
但是，電子顯微鏡的徹底研究，并無(wú)法在鼻咽癌的癌細(xì)胞中找到EB病毒病毒顆粒的存在情況[Gazzolo，J Natl Cancer Inst 4873，1972]。有趣的是，若是這些鼻咽癌的癌細(xì)胞曾在裸鼠中培養(yǎng)過(guò)，其所產(chǎn)生的惡性表皮細(xì)胞卻可釋放出EB病毒顆粒來(lái)感染狨猿的淋巴細(xì)胞[Trumper，Int J Cancer20655，1997；Crawford，Int J Cancer 24294，1979]。其實(shí)，新鮮培養(yǎng)的鼻咽癌癌細(xì)胞受到溴化去氧尿苷酸[Trumper，Int J Cancer 17578，1976]或是咐喖酯[Tomei，Nature 32973，1987]的刺激后，細(xì)胞亦可釋放出EB病毒的病毒顆粒。在受丁酸鈉處理過(guò)的淋巴瘤細(xì)胞，同樣的現(xiàn)象，即EB病毒顆粒的釋放也曾被觀察到[Cheng，Proc Natl Acad Sci USA 776162，1980]。這些數(shù)據(jù)顯示，鼻咽癌病人的病理微環(huán)境，可調(diào)控鼻咽癌癌細(xì)胞內(nèi)EB病毒的基因表現(xiàn)，而此種EB病毒的基因表現(xiàn)，則在鼻咽癌病人的IgA表現(xiàn)上反映出來(lái)。這種數(shù)據(jù)亦顯示鼻咽癌病人對(duì)EB病毒不尋常的免疫反應(yīng)，可能也是因?yàn)獒槍?duì)EB病毒不尋常的基因表現(xiàn)，或是EB病毒感染再活化的結(jié)果[Stolzenberg，Int J Cancer 66337，1996]，或是這兩種情形的混合[Chow，Cancer Epidemiol Biomarkers & Prev 6363，1997]。所以，使用病毒某感染時(shí)期的某單一抗原來(lái)研究疾病，以及預(yù)測(cè)疾病治療的效果，應(yīng)該會(huì)有其先天的限制。
根據(jù)這種觀念，本實(shí)驗(yàn)室曾使用EB病毒在不同感染時(shí)期所表現(xiàn)的特異抗原，包括潛伏感染期以及病毒復(fù)制期[Martel-Renoir，J Gen Virol761401，1995]的六種不同抗原，來(lái)檢測(cè)鼻咽癌病人血清中對(duì)這六種不同抗原同時(shí)存在的IgA效價(jià)情況。本實(shí)驗(yàn)室的研究成果，完全與以有的觀察結(jié)果吻合，顯示EB病毒感染在鼻咽癌癌細(xì)胞內(nèi)，并不僅是潛伏性感染而已[Henle，J Natl Cancer Inst 51361，1973；Cheng，Proc Natl AcadSci USA 776162，1980；De-Vathaire，Int J Cancer 42176，1988]。雖然不同病人之間對(duì)不同抗原蛋白的免疫敏感性與免疫特異性都有不同的表現(xiàn)，但這不但表示不同抗原蛋白的免疫抗原性不同，更表示這些不同的抗原蛋白，在病人體內(nèi)的表現(xiàn)時(shí)段長(zhǎng)短，以及抗原蛋白表現(xiàn)量的多寡，呈現(xiàn)于病人生病期間的免疫系統(tǒng)的反應(yīng)度而已。因此，偵測(cè)到血清中的IgA對(duì)EB病毒在不同期間所表現(xiàn)的基因產(chǎn)物，更反映出在每一個(gè)不同的病人體內(nèi)其對(duì)EB病毒感染情況的免疫作用。雖然其他的說(shuō)法也有其可能性，但是，這種結(jié)果與EBNA-1是維持表體EB病毒所需的事實(shí)是一致的[Fhraeus，Int J Cancer 42329，1988；Liebowiz，1993]，即EB病毒可能受到病人體內(nèi)一種尚未明白的病理機(jī)制所活化[Martel-Renoir，J Gen Virol 761401，1995；Stolzenberg，Int JCancer 66337，1996；Chow，Cancer Epidemiol Biomarkers & Prev 6363，1997]。
如前所述，以EBNA-1互補(bǔ)與EB病毒溶解周期有關(guān)的抗原，可以提供比單一抗原更好的鼻咽癌偵測(cè)法，不但其偵測(cè)率可以提高，而且能提早偵測(cè)到鼻咽癌。因此，此包括潛伏感染期以及病毒復(fù)制期所表現(xiàn)的整系列基因產(chǎn)物，作成的免疫檢驗(yàn)試片，當(dāng)然可以提供一個(gè)較精確的方法以預(yù)估病人的治療效果，并能提早偵測(cè)到鼻咽癌的復(fù)發(fā)；此外，本實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不僅與其他實(shí)驗(yàn)室所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果非常一致[Henle，J Natl Cancer Inst 51361，1973；Ho，Br J Cancer 37356，1978；Cheng，Proc Natl Acad Sci USA 776162，1980]，而且顯示出癌細(xì)胞和病理微環(huán)境的相互作用，亦可影響EB病毒在癌細(xì)胞內(nèi)的基因表現(xiàn)。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)用非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒的綜合抗原以檢測(cè)鼻咽癌病人治療前后的血清反應(yīng)的方法，進(jìn)而可以提供一種更好的檢測(cè)方法，以評(píng)估鼻咽癌病人的治療療效。
本發(fā)明中，我們使用EB病毒在不同感染時(shí)期所表現(xiàn)的特異抗原，包括潛伏感染期以及病毒復(fù)制期的六種不同抗原，以免疫分析法來(lái)檢測(cè)并評(píng)估鼻咽癌病人在治療前后，血清中對(duì)這六種不同抗原同時(shí)存在的IgA效價(jià)情況。本發(fā)明也證實(shí)了這種方法的有效性，即本發(fā)明可以提供一種更好的檢測(cè)方法，以評(píng)估鼻咽癌病人的治療療效。


圖1是一個(gè)代表所有以西方墨漬法檢測(cè)分析鼻咽癌病人在治療前后血清中IgA濃度變化的反應(yīng)圖，每一條硝酸纖維膜上皆含有六種EB病毒的特異抗原，其個(gè)別含量如右所列EDP，0.25μg；DBP，0.25μg；TK，0.25μg；EA-D，0.25μg；EBNA-1，0.1μg；及ZEBRA，0.25μg。每一種EB病毒特異蛋白的相關(guān)位置(標(biāo)示于右邊)顯示于S道，此S道上的EB病毒特異蛋白是以0.25％Coomasie blue染色的。箭頭蛋白質(zhì)分子重量標(biāo)準(zhǔn)的位置。每一條個(gè)別道的相關(guān)以酵素聯(lián)結(jié)免疫吸附法所測(cè)讀的A450吸收光譜值；第一道，0.598；第二道1.196；第三道，1.010(A例)；第四道，1.120；第五道，1.318；第六道，1.570(B例)；第七道，0.632；第八道，0.650；第九道，0.408；第十道，0.217(C例)；第十一道，1.212；第十二道，0.935(D例)；第十三道，1.196；和第十四道，0.461(E例)。
本發(fā)明是屬于使用方法的范疇，有關(guān)應(yīng)用EB病毒的綜合抗原以檢測(cè)鼻咽癌病人在治療前后的血清反應(yīng)，特別是利用EB病毒所表現(xiàn)的特異蛋白，如DNA結(jié)合蛋白(DBP)、早期擴(kuò)散性抗原(EA-D)、EB病毒一號(hào)核抗原(EBNA-1)、EB病毒特異性DNA聚合酶(EDP)、胸腺嘧啶激活酶(TK)及EB病毒BZLF-1復(fù)制激活質(zhì)(ZEBRA)等。例如使用硫酸化十二脂酸鈉-聚丙烯酰胺膠電泳法與西方墨漬法所得的硝酸纖維膜來(lái)檢測(cè)時(shí)，每一片硝酸纖維膜細(xì)條，都包括此六種EB病毒的特異抗原；有關(guān)基因工程所產(chǎn)生的細(xì)菌，即利用基因工程大腸桿菌所攜帶的雜種載體以及雜種載體上所攜帶的基因，和其所制備的DNA結(jié)合蛋白、早期擴(kuò)散性抗原、EB病毒一號(hào)核抗原、EB病毒特異性DNA聚合酶、胸腺嘧啶激活酶及EB病毒BZLF-1復(fù)制激活質(zhì)。使用時(shí)，每個(gè)細(xì)條單獨(dú)與病人的血清反應(yīng)，其反應(yīng)則以信號(hào)產(chǎn)生物連結(jié)的抗人類IgA抗體來(lái)辨識(shí)。例如以堿性磷酸酶連結(jié)的羊?qū)θ说腎gA抗體及硝化四佐琳藍(lán)和磷酸-五-溴化-四-氯化-三-吲哚辨識(shí)(Sigma，St.Louis，MO)每個(gè)硝酸纖維膜細(xì)條上的陽(yáng)性反應(yīng)是在特定位置上所顯現(xiàn)的藍(lán)紫色條紋。而本發(fā)明所謂的信號(hào)產(chǎn)生物則不限定為酵素。另固態(tài)載體檢測(cè)法包括酵素聯(lián)結(jié)免疫吸附法(ELISA)，其檢測(cè)原理在于將上述EB病毒的綜合抗原固定于固態(tài)載體表面；固態(tài)載體可能為聚苯乙烯(Polystyrene)、硝酸纖維膜及其他能以化學(xué)鍵結(jié)或物理吸附蛋白質(zhì)的材質(zhì)。這些固定化的抗原與病人血清反應(yīng)，當(dāng)病人血清中具有對(duì)抗EB病毒抗原抗體存在而其存在抗體的種類與濃度則有關(guān)于病人當(dāng)時(shí)的診療及病情發(fā)展的狀況。病人血清中的人類抗EB病毒抗原抗體與相對(duì)應(yīng)的抗原結(jié)合反應(yīng)形成免疫絡(luò)合物(Complex)。將固態(tài)載體表面未參與反應(yīng)的血清洗凈后，在與信號(hào)產(chǎn)生物連結(jié)的抗人類IgA抗體來(lái)反應(yīng)。信號(hào)產(chǎn)生物的種類依探測(cè)方法的不同而有差別。信號(hào)產(chǎn)生物可以是酵素，酵素與其相對(duì)的顯色劑產(chǎn)生顏色而得以判讀；信號(hào)產(chǎn)生物亦可以是熒光物、有色聚合物、電化學(xué)活性物等物質(zhì)。本發(fā)明亦可以單步驟或多步驟免疫層析法來(lái)實(shí)施。根據(jù)臺(tái)灣第NI55849號(hào)專利固態(tài)相驗(yàn)定法中闡述免疫層析法，EB病毒抗原固著于長(zhǎng)條固態(tài)載體的一端；而信號(hào)產(chǎn)生物結(jié)合的對(duì)抗人類免疫球蛋白抗體或結(jié)合蛋白則于固態(tài)載體的另一端，藉由人體血清的濕潤(rùn)同時(shí)藉毛細(xì)現(xiàn)象將信號(hào)產(chǎn)生物及分析物攜帶至EB病毒抗原固著處而與之結(jié)合，檢測(cè)信號(hào)產(chǎn)生物的濃度而達(dá)到所欲檢測(cè)的目的。
本發(fā)明以下列實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明，唯這些實(shí)施例所述內(nèi)容并非用以界定本發(fā)明的范圍，任何熟習(xí)本項(xiàng)技術(shù)的人士所知的修飾和改變均仍涵蓋于本發(fā)明的技術(shù)方案范圍中。
實(shí)施例1病人的選擇與追蹤。
從1980年六月至1992年七月，總共有314位新診斷的鼻咽癌病人參與本研究。所有的病人都是病理確定的病人，而且至少有一次的追蹤治療或是死亡的登記；所有的病人都追蹤到1997年六月為止。臨床期別是根據(jù)UICC系統(tǒng)分期。從103位具有相當(dāng)?shù)哪挲g與性別分布的健康人所收集的血清列為對(duì)照組。從122位對(duì)cytomegalovirus或是對(duì)herpes simplex virus-1具有高效價(jià)IgG者的血清則用來(lái)測(cè)試交叉反應(yīng)[Chow，Cancer EpidemiolBiomarkers & Prev 6363，1997]。本研究計(jì)劃曾經(jīng)過(guò)本院醫(yī)藥道德委員會(huì)首肯通過(guò)，而且都得到每一位病人的同意、簽名后執(zhí)行。
初診斷時(shí)，就開(kāi)始收集每一位病人的血清及周邊血球細(xì)胞；之后，第一年每三個(gè)月復(fù)診時(shí)，各抽一次；第二年之后，則每六個(gè)月復(fù)診時(shí)，再各抽一次。治療方法主要是在鼻咽腔部位施予放射線70至74Gy(2Gy/次，5次/周)。如果腫瘤已侵犯到病人的頭頸部淋巴結(jié)者，則于頭頸部淋巴結(jié)部位施予放射線65至74Gy；在原發(fā)部位復(fù)發(fā)者，則施予外圍性放射治療(externalBeam Irradiation)；如果腫瘤已侵犯到病人的遠(yuǎn)端器官者，則施予包含cisplatin與5-fluorouracil的化學(xué)治療[Chi，J Clin Oncol 132620，1995]。治療后，所有病人都按照常規(guī)復(fù)診、追蹤。酵素聯(lián)結(jié)免疫吸附法、免疫墨漬法、原位雜交法(ISH)及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)等方法的使用皆采用單盲的研究步驟[Chow，Cancer Epidemiol Biomarkers & Prev 6363，1977]。原發(fā)部位復(fù)發(fā)者的診察是以鼻腔鏡檢查、鼻咽腔部位采生檢體使用原位雜交法檢測(cè)EB病毒基因EBER在癌細(xì)胞中的表現(xiàn)。如果懷疑腫瘤已侵犯到病人的遠(yuǎn)端器官，如肝、肺，則采用超聲波掃描及X光片等方法確診。如果懷疑腫瘤已侵犯到病人的骨髓，則采生檢體使用原位雜交法檢測(cè)EB病毒基因EBER在癌細(xì)胞中的表現(xiàn)[Chao，Cancer 7824，1996]。鼻咽癌病人治療前的臨床癥狀、特征等列于表一。
表一、鼻咽癌病人治療前的臨床癥狀腫瘤大小 淋巴轉(zhuǎn)換情況腫瘤期別aT1 11.1％(35)bN0 26.8％(84) I 7.3％(23)T2 26.8％(84) N1 8.0％(25)II 12.7％(4O)T3 23.2％(73) N2 24.8％(78) III 20.1％(63)T4 38.8％(122) N3 40.4％(127) IV 58.9％(188)a侵犯淋巴者 73.2％(230)b括弧內(nèi)的數(shù)目代表病人的數(shù)目。
侵犯肝臟或肺臟者 1.6％(5) 全部受分析的病人數(shù)目是314。
侵犯頭部神經(jīng)者 3.8％(12)侵犯骨骼者 17.8％(56)男性病人的平均年齡是51.6±12.9歲(n＝251)，而女性病人的平均年齡是43.2±13.1歲(n＝63)。除了73位患者在放射治療之后仍有殘余病灶之外，其他241位病人都達(dá)完全緩解。兩年的局部復(fù)發(fā)率大約是20.3％。放射治療之后，五年的存活率則與疾病的期別與被侵犯的淋巴結(jié)數(shù)目成反比(期別I，100％；期別II，71.2％；期別III，42.0％；期別IV，29.5％及N0，68.％；N1，50.7％；N2，43.8％；和N3，31.2％)。
實(shí)施例2質(zhì)體的制備與EB病毒特異抗原的純化質(zhì)體的制備與EB病毒特異抗原的純化是按照以前的說(shuō)明方法施行[Chow，Cancer EpidemiolBiomarkers & Prev 6363，1997]。簡(jiǎn)言之，個(gè)別的EB病毒基因是使用一對(duì)特異的引子由cDNA(從P3HR1細(xì)胞)或是由EB病毒的基因庫(kù)(從B95-8細(xì)胞)以聚合酶鏈反應(yīng)的方法復(fù)制出來(lái)的[Chow，Cancer EpidemiolBiomarkers & Prev 6363，1997]。然后將復(fù)制出來(lái)的DNA片段接到表現(xiàn)載體pET3C(Novagen，Madison，WI)或是pET3CP內(nèi)。重組的蛋白質(zhì)則以分子重量的方法、部分胺基酸序列分析法或是酵素活性法確認(rèn)。重組的EB病毒抗原是由細(xì)菌溶解液逐步的使用離子交換(ion exchange)、凝膠過(guò)濾(gelfiltration)與凝膠電泳(gel electrophoresis)待方法純化出來(lái)的。
實(shí)施例3酵素聯(lián)結(jié)免疫吸附法純化的EB病毒抗原則用來(lái)敏感化酵素聯(lián)結(jié)免疫吸附法所使用塑膠盤(pán)。病人血清以1∶200稀釋于血清緩沖液中[5％奶粉、20％E.coli溶解液、0.1％Tween(吐溫)20、150mM NaCl及50mM Tris(pH7.5)]。然后，將塑膠盤(pán)置于37℃反應(yīng)60分鐘；以蒸餾水十次洗凈稀釋血清后，則以聯(lián)結(jié)過(guò)氧化酶的羊抗人IgA的抗體(1∶12000稀釋)于37℃反應(yīng)30分鐘。陽(yáng)性反應(yīng)的辨識(shí)是以3，3’，5，5’-四甲基苯顯色十五分鐘后，在光譜儀判讀分析A450nm的吸收值。
每一個(gè)樣品都作三次重復(fù)。當(dāng)六種在不同感染時(shí)期所表現(xiàn)的EB病毒的特異抗原皆用來(lái)評(píng)估鼻咽癌病人的血清IgA濃度時(shí)，不同時(shí)期所代表的抗原相對(duì)的免疫反應(yīng)，可藉由病人血清中相對(duì)應(yīng)不同的IgA濃度來(lái)顯示。比較僅以EBNA-1及EA-D兩抗原的IgA濃度更具臨床意義。其中的差異將于以下實(shí)施例中說(shuō)明。
實(shí)施例四免疫墨漬分板以免疫墨漬分析病人血清的方法，以前曾描述過(guò)[Chow，CancerEpidemiol Biomarkers & Prev 6363，1997]。簡(jiǎn)言之，將六種純化的重組蛋白質(zhì)，DNA結(jié)合蛋白、早期擴(kuò)散性抗原、EB病毒一號(hào)核抗原、EB病毒特異性DNA聚合酶、胸腺嘧啶激活酶和EB病毒BZLF-1復(fù)制激活質(zhì)混合置入單槽SDS-PAGE中，以電泳的方式分開(kāi)，然后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，含有此六種純化重組蛋白質(zhì)的硝酸纖維膜則切成細(xì)條。每一個(gè)硝酸纖維膜細(xì)條則用來(lái)檢測(cè)一位病人的血清。陽(yáng)性反應(yīng)是以堿性磷酸酶連結(jié)的羊?qū)θ薎gA的抗體與硝化四佐琳藍(lán)和磷酸-五-溴化-四-氯化-三-吲哚辨識(shí)。陽(yáng)性反應(yīng)的每一個(gè)細(xì)條都仔細(xì)登記，列表，然后與以酵素聯(lián)結(jié)免疫吸附法所得的數(shù)據(jù)相比較。治療后，有八位本來(lái)血清呈陰性反應(yīng)的病人，仍屬陰性反應(yīng)；其他在診斷時(shí)呈陽(yáng)性反應(yīng)的病人，則繼續(xù)以含EBNA-1和EA-D的酵素聯(lián)結(jié)免疫吸附法追蹤病情，其結(jié)果列于表二。
在306位血清呈陽(yáng)性反應(yīng)的病人當(dāng)中，有169位(55.2％)的IgA濃度仍停留在定切值之上[Chow，Cancer Epidemiol Biomarkers & Prev 6363，1997]；100位病人的IgA濃度則逐漸降低；但是有37位病人的IgA濃度卻異常升高。大多數(shù)IgA濃度異常升高的病人，在短期內(nèi)都會(huì)有疾病提前復(fù)發(fā)、提前遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移或是提前死亡的現(xiàn)象。但是IgA的濃度變異，并不是在每一個(gè)病人身上都會(huì)造成相同的結(jié)果。有五位病人，雖然其IgA濃度逐漸降低，卻在第一年去逝；因?yàn)閼岩蛇@種結(jié)果與檢測(cè)人類免疫缺點(diǎn)病毒感染時(shí)的假陰性率類似，本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始使用含有六種純化的重組抗原的免疫墨漬法分析并追蹤病人的血清與病情。本實(shí)驗(yàn)特別注重32位IgA濃度具異常變化的病人，他們?cè)诘谝荒甑拇婊盥剩覀円蔡貏e追蹤十位IgA濃度有顯著升高，其存活卻超過(guò)五年者。
表二、鼻咽癌病人治療前后三個(gè)月，血清中對(duì)EBNA-1和EA-D IgA濃度變化的情況以及IgA濃度變化與病人存活時(shí)間長(zhǎng)短的關(guān)系。
存活時(shí)間 治療后血清中對(duì)EBNA-1和EA-D的LgA濃度降低不變 升高≤一年(n＝30) 16.7％(5)c50.0％(15)33.3％(10)一年至五年(n＝103)31.1％(32)52.4％(54)16.5％(17)＞五年(n＝173)36.4％(63)57.8％(100) 5.8％(10)c括弧內(nèi)的數(shù)目代表病人的數(shù)目，存活時(shí)間顯示于左欄。全部受分析的病人數(shù)目是306。x2＝21.39，P＜0.005。
其中以五個(gè)病人為代表的例子顯示于圖1。因此，圖1是一個(gè)代表所有以西方墨漬去檢測(cè)分析鼻咽癌病人在治療前后血清中IgA濃度變化的反應(yīng)圖；每一條硝酸纖維膜上皆含有六種EB病毒的特異抗原，其個(gè)別含量如右所列EDP，0.25μg；DBP，0.25μg；TK，0.25μg；EA-D，0.25μg；EBNA-1，0.1μg；及ZEBRA，0.25μg。第一道至第三道的血清(A例)是由一位以酵素聯(lián)結(jié)免疫吸附法檢測(cè)時(shí)，IgA濃度逐漸升高的病人；當(dāng)我們比較血清IgA濃度與免疫墨漬分析的數(shù)據(jù)時(shí)，雖然EBNA-1/IgA有升高的趨勢(shì)，從第一道至第三道的特異蛋白量看，大致上，IgA對(duì)EB病毒其他特異抗原的濃度是呈降低的傾向，而降低的特異抗原主要是和EB病毒復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)，例如EDP，DBP，TK和ZEBRA等。在B例上看時(shí)，則以酵素聯(lián)結(jié)免疫吸附法檢測(cè)或是以免疫墨漬法分析數(shù)據(jù)時(shí)，其結(jié)果都有升高的趨勢(shì)(免疫墨漬法結(jié)果，第四道至第六道)。有趣的是升高的IgA濃度也是和EB病毒復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)，例如EDP，DBP，TK和EA-D等(請(qǐng)比較第四道和第五道及第六道的結(jié)果)。在EB病毒特異抗原之間的其他斑紋可能是重組的EB病毒抗原純化時(shí)所殘余的細(xì)菌蛋白質(zhì)，但為病人的IgA所辨認(rèn)出來(lái)。
以含EBNA-1和EA-D的酵素聯(lián)結(jié)免疫吸附法檢測(cè)血清時(shí)，IgA濃度不變，但是以免疫墨漬法分析時(shí)卻有降低的傾向者，則以C例為代表(圖1，第七至第十道)；此例，不但在第七至第十道中偵測(cè)不到EA-D/IgA，對(duì)于其他和EB病毒復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)，如DBP，TK和ZEBRA等，其IgA濃度也逐漸減低。D例則代表IgA濃度不論是以酵素聯(lián)結(jié)免疫吸附法檢測(cè)或是以免疫墨漬法檢測(cè)時(shí)，其結(jié)果皆居高不下的病人(圖1，第十五與第十二道)。E例則代表以酵素聯(lián)結(jié)免疫吸附法檢測(cè)時(shí)，IgA濃度下降；但是以免疫墨漬法檢測(cè)時(shí)，IgA對(duì)和EB病毒復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)，如DBP和ZEBRA，卻有升高的趨勢(shì)(圖1，第十三與第十四道)；值得注意的是，在本例中以免疫墨漬法檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)不到第十四道的EBNA-1。以上的結(jié)果顯示，使用免疫墨漬法檢測(cè)病人血清時(shí)，不但能分析病人血清對(duì)個(gè)別EB病毒抗原的免疫反應(yīng)度，也能同時(shí)觀察到IgA濃度的變化。當(dāng)比較使用免疫墨漬法檢測(cè)病人血清所得的結(jié)果與病人的病情時(shí)，IgA濃度居高不下的病人或是IgA濃度突常升高者，尤其是對(duì)和EB病毒復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)，如DBP，EA-D，EDP，TK和ZEBRA等，有升高趨勢(shì)的病人，其預(yù)后較差，通常在短期內(nèi)會(huì)有疾病復(fù)發(fā)或是遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象發(fā)生。
相類似于免疫墨漬法但分別將前述的抗原以吸附或鍵結(jié)于固態(tài)載體上并依相同程序來(lái)檢測(cè)病人血清，不但可免除電泳分離的步驟同時(shí)得到的相同結(jié)果。
本發(fā)明所揭露的方法可應(yīng)用于鼻咽癌患者治療前后或病情發(fā)展?fàn)顩r的檢驗(yàn)分析以提供醫(yī)師診斷用藥的參考。以往文獻(xiàn)并無(wú)相類似的闡述，具有新穎性；本發(fā)明能夠分析患者治療狀況及病情發(fā)展，比較目前所有鼻咽癌相關(guān)檢驗(yàn)試劑及方法卻無(wú)此功能，具有進(jìn)步性；本發(fā)明所揭示的方法可實(shí)際應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)，具有產(chǎn)業(yè)應(yīng)用性。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)鼻咽癌病人在治療前后血清反應(yīng)的方法，是使用非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒的綜合抗原作為反應(yīng)因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒的綜合抗原以檢測(cè)鼻咽癌病人在治療前后血清反應(yīng)的方法，其中非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒綜合抗原是可刺激鼻咽癌病人血清中產(chǎn)生IgA者，特別是EB病毒所表現(xiàn)的特異蛋白，包括DNA結(jié)合蛋白(DBP)、早期擴(kuò)散性抗原(EA-D)、EB病毒一號(hào)核抗原(EBNA-1)、EB病毒特異性DNA聚合酶(EDP)、胸腺嘧啶激活酶(TK)及EB病毒BZLF-1復(fù)制激活質(zhì)(ZEBRA)。
3.如權(quán)利要求1所述的使用非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒的綜合抗原以檢測(cè)鼻咽癌病人在治療前后血清反應(yīng)的方法，其中非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒綜合抗原至少包含潛伏感染期及病毒復(fù)制期在內(nèi)的三種特異蛋白，它是為EB病毒一路核抗原(EBNA-1)、早期擴(kuò)散性抗原(EA-D)、DNA結(jié)合蛋白(DBP)、胸腺嘧啶激活酶(TK)及復(fù)制激活質(zhì)(ZEBRA)五種抗原或EB病毒一號(hào)核抗原(EBNA-1)、早期擴(kuò)散性抗原(EA-D)、DNA結(jié)合蛋白(DBP)、胸腺嘧啶激活酶(TK)、EB病毒特異性DNA聚合酶(EDP)及復(fù)制激活質(zhì)(ZEBRA)六種抗原之組合。
4.如權(quán)利要求1所述的使用非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒的綜合抗原以檢測(cè)鼻咽癌病人在治療前后血清反應(yīng)的方法，其中鼻咽癌病人在治療前后的血清反應(yīng)，是EB病毒抗原可引發(fā)鼻咽癌病人血清中產(chǎn)生IgA去辨認(rèn)者，包括DNA結(jié)合蛋白(DBP)、早期擴(kuò)散性抗原(EA-D)、EB病毒一號(hào)核抗原(EBNA-1)、EB病毒特異性DNA聚合酶(EDP)、胸腺嘧啶激活酶(TK)及EB病毒BZLF-1復(fù)制激活質(zhì)(ZEBRA)。
5.如權(quán)利要求2所述的使用非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒的綜合抗原以檢測(cè)鼻咽癌病人在治療前后血清反應(yīng)的方法，其中非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒綜合抗原是由基因工程細(xì)菌所產(chǎn)生的接合產(chǎn)物。
6.一種以西方墨漬法以檢測(cè)鼻咽癌病人在治療前后血清反應(yīng)的方法，是包括將病人血清與包含有非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒綜合抗原的硝酸纖維膜反應(yīng)；前述反應(yīng)是與病人血清中抗非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒綜合抗原的IgA抗體反應(yīng)；前述IgA抗體再與信號(hào)產(chǎn)生物連結(jié)的抗人類IgA抗體反應(yīng)；及偵測(cè)前述信號(hào)產(chǎn)生物的濃度以進(jìn)行檢測(cè)。
7.如權(quán)利要求6所述的以西方墨漬法以檢測(cè)鼻咽癌病人在治療前后血清反應(yīng)的方法，其中硝酸纖維膜是包含非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒綜合抗原是可刺激鼻咽癌病人血清中產(chǎn)生IgA者，特別是EB病毒所表現(xiàn)的特異蛋白，包括DNA結(jié)合蛋白(DBP)、早期擴(kuò)散性抗原(EA-D)、EB病毒一號(hào)核抗原(EBNA-1)、EB病毒特異性DNA聚合酶(EDP)、胸腺嘧啶激活酶(TK)及EB病毒BZLF-1復(fù)制激活質(zhì)(ZEBRA)，其中任何幾種所組合成的產(chǎn)物是使用單槽硫酸化十二脂酸鈉-聚丙烯酰胺膠電泳法分開(kāi)，然后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上。
8.一種以固態(tài)載體分析法以檢測(cè)鼻咽癌病人在治療前后血清反應(yīng)的方法，是包括將病人血清與一固定有非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒綜合抗原的固態(tài)載體反應(yīng)；前述反應(yīng)是與病人血清中抗非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒綜合抗原的IgA抗體反應(yīng)；前述IgA抗體再與信號(hào)產(chǎn)生物連結(jié)的抗人類免疫球蛋白或特異性結(jié)合蛋白抗體反應(yīng)；及偵測(cè)前述信號(hào)產(chǎn)生物的濃度以進(jìn)行檢測(cè)。
9.一種固態(tài)相免疫層析法以檢測(cè)鼻咽癌病人在治療前后血清反應(yīng)的方法，是包括將非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒抗原或抗人類IgA抗體或結(jié)合蛋白固定于固態(tài)載體的一端；將信號(hào)產(chǎn)生物結(jié)合的對(duì)抗人類IgA抗體或結(jié)合蛋白或信號(hào)產(chǎn)生物結(jié)合的非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒抗原于前述固態(tài)載體的另一端；將病人血清置入前述固態(tài)載體；藉由病人血清濕潤(rùn)的同時(shí)，藉毛細(xì)現(xiàn)象將信號(hào)產(chǎn)生物及分析物攜帶至前述非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒抗原或抗人類IgA抗體或結(jié)合蛋白固著處反應(yīng)；及偵測(cè)前述信號(hào)產(chǎn)生物的濃度以進(jìn)行檢測(cè)。
10.如權(quán)利要求8或9所述的以固態(tài)載體分析法或固態(tài)相免疫層析法以檢測(cè)鼻咽癌病人在治療前后血清反應(yīng)的方法，其中固態(tài)載體包括表面修飾或未修飾的聚苯乙烯、玻璃纖維、纖維素、尼龍、交聯(lián)糊精、各式層析紙、金屬、硝基纖維素、磁珠。
11.如權(quán)利要求8或9所述的以固態(tài)載體分析法或固態(tài)相免疫層析法以檢測(cè)鼻咽癌病人在治療前后血清反應(yīng)的方法，其中信號(hào)產(chǎn)生物為一種可偵測(cè)的染料、放射性標(biāo)記、螢光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、電子旋轉(zhuǎn)共振物質(zhì)、磁性物質(zhì)、酵素或有色聚合物標(biāo)志。
全文摘要
本發(fā)明是屬于使用方法的范疇,有關(guān)應(yīng)用非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒,Epstein－Barr(簡(jiǎn)稱EB)病毒的綜合抗原以檢測(cè)鼻咽癌病人在治療前后的血清反應(yīng),特別是利用EB病毒所表現(xiàn)的特異蛋白,如DNA結(jié)合蛋白(DBP)、早期擴(kuò)散性抗原(EA－D)、EB病毒一號(hào)核抗原(EBNA－1)、EB病毒特異性DNA聚合酶(EDP)、胸腺嘧啶激活酶(TK)及EB病毒BZLF－1復(fù)制激活質(zhì)(ZEBRA)等,本發(fā)明使用EB病毒在不同感染時(shí)期所表現(xiàn)的特異抗原,包括潛伏感染期以及病毒復(fù)制期的六種不同抗原,以免疫分析法來(lái)檢測(cè)并評(píng)估鼻咽癌病人在治療前后,血清中對(duì)這六種不同抗原同時(shí)存在的IgA效價(jià)情況,從而提供了一種更好的檢測(cè)方法,以評(píng)估鼻咽癌病人的治療療效。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1331415SQ0010957
公開(kāi)日2002年1月16日 申請(qǐng)日期2000年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月5日
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