專利名稱：治療b型肝炎病毒和非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒的l-核苷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療B型肝炎病毒(也可表示為“HBV”)和非洲細(xì)胞瘤病毒(表示為“EBV”)的方法，其中包括使用一個(gè)或多個(gè)有效量的本發(fā)明公開的活性化合物，或其藥學(xué)上可接受的衍生物或前體藥物。
背景技術(shù)：
B型肝炎病毒已在世界范圍內(nèi)流行。在宿主無感覺的二到六個(gè)月的潛伏期后，HBV感染可導(dǎo)致急性肝炎并造成肝臟損傷，這將引起腹痛，黃疸，并升高血液中某些酶的水平。HBV可引起暴發(fā)性肝炎，迅速地發(fā)展，最終常形成破壞大部分肝臟的疾病?；颊咭话憧蓮募毙圆《拘愿窝字锌祻?fù)。但是，對于某些患者，血液中病毒抗原的高水平經(jīng)過延長的，或不確定的時(shí)期，導(dǎo)致慢性感染。慢性感染可導(dǎo)致慢性持久性肝炎。感染慢性持久性HBV的患者最常見于發(fā)展中國家。到1991年中期，僅在亞洲就大約有225000000慢性HBV攜帶者，而在世界上，幾乎有300000000攜帶者。慢性持久性肝炎可引起疲勞，肝硬度，和肝細(xì)胞癌，一種主要的肝癌。
在西方工業(yè)化國家，HBV的高危人群包括接觸HBV攜帶者或其血液樣品的人。事實(shí)上HBV流行與獲得性免疫缺陷綜合征的流行非常相似，這也就說明了HBV感染在AIDS或與HIV有關(guān)的感染的患者中常見的原因。不過，HBV比HIV更易接觸感染。
HBV僅次于煙草，為人類癌癥的第二大原因。HBV引起癌癥的機(jī)理尚不清楚，有人假設(shè)它可直接激發(fā)腫瘤的產(chǎn)生，或通過慢性炎癥，硬變，和與感染有關(guān)的細(xì)胞再生間接地激發(fā)腫瘤的產(chǎn)生。
非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒(EBV)為Lymphocryptovirus屬的一種，屬于gammaherpesvirine亞科。它顯然是親淋巴的。EBV具有典型的皰疹病毒的結(jié)構(gòu)，也就是說，它的雙鏈DNA基因組含于二十五面體(icosapentahedral)病毒粒子中，換句話說，它被布滿病毒糖蛋白的脂質(zhì)膜包圍。一種無定形的被體蛋白占據(jù)了膜和病毒粒子之間的空間。
某種程度上所有人類皰疹病毒都感染淋巴細(xì)胞并在其中復(fù)制，但EBV的作用極強(qiáng)。更重要地，EBV感染的發(fā)病機(jī)理及宿主反應(yīng)比其他人類皰疹病毒更明顯地取決于淋巴細(xì)胞的感染。
EBV現(xiàn)在被認(rèn)為是B-細(xì)胞淋巴組織增生疾病的起因，并與各種其他嚴(yán)重的及慢性的疾病，包括AIDS患者罕見的進(jìn)行性的單核細(xì)胞增多樣綜合癥以及口腔毛狀粘膜白斑病有關(guān)。那種EBV為導(dǎo)致慢性疲勞的主要原因的說法已經(jīng)不起仔細(xì)推敲。
盡管某些感染通過輸血傳播，但EBV主要通過唾液傳播。超過85％的患者在傳染性單核細(xì)胞增多癥的急性期分泌EBV。
已證明EBV與癌癥有關(guān)。至少兩組患者受到與EBV有關(guān)的淋巴組織瘤的威脅，那些在免疫抑制法治療下接受過腎臟、心臟、骨髓、肝臟、或胸腺移植的患者，以及AIDS患者。與EBV有關(guān)的癌癥包括Burkitt′sLymphoma和Nasopharyngeal Carcinoma。
由于B型肝炎病毒和非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒對被感染的患者具有嚴(yán)重的，并且常常是災(zāi)難性的影響這一事實(shí)，因而急需提供對宿主低毒性的新的有效的藥劑治療人類的此類感染。
因此，本發(fā)明的目的是提供治療B型肝炎病毒感染的化合物，組合物和方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供治療非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒感染的化合物，組合物和方法。
發(fā)明概要本發(fā)明提供一種治療宿主、特別是人類HBV或EBV感染的方法，其中包括使用治療HBV或EBV感染有效量的下式L-核苷 其中R為嘌呤或嘧啶堿基，作為優(yōu)選的方案，所提供的核苷為指出的對映體并實(shí)際上不含它的相應(yīng)另一個(gè)對映體(即，對映體濃度高的形式，包括對映純的形式)。
作為一個(gè)優(yōu)選的方案，活性化合物為2′-氟-5-甲基-β-L-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶核苷(也表示為L-FMAU)。該化合物為有效的抗HBV和EBV的抗病毒劑，并具有低細(xì)胞毒性。活性化合物的其他特例包括N1-(2′-脫氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-乙基尿嘧啶，N1-(2′-脫氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘胞嘧啶。和N1-(2′-脫氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基-5-碘尿嘧啶。
作為另一個(gè)方案，如

圖1所示，含有2′-阿拉伯糖基-羥基的L-核苷，例如，L-阿拉伯糖基胸苷，L-氟達(dá)拉濱，L-阿拉伯糖基鳥苷，和L-阿拉伯糖基肌苷被用來治療HBV和EBV感染。
這里公開的L-核苷及其藥學(xué)上可接受的衍生物或含有這些化合物的藥學(xué)上可接受的劑型可用來預(yù)防和治療HBV感染及其他與此相關(guān)的疾病如抗HBV抗體陰性和HBV陰性，由HBV引起的慢性肝炎，肝硬變，急性肝炎，暴發(fā)性肝炎，慢性持久性肝炎，和疲勞。該化合物也可用來治療與EBV有關(guān)的疾病。這些化合物或劑型也可用來預(yù)防或阻止抗HBV或抗EBV抗體或HBV-或EBV-抗原陽性的人或已經(jīng)接觸到HBV或EBV的人的臨床病癥的發(fā)展。
作為另一個(gè)方案，可將活性化合物或其衍生物或鹽與包括上面所列出的其他抗HBV劑或抗EBV劑，或者抗HIV劑聯(lián)合或交替使用。交替治療期間，通常連續(xù)地使用有效量的各個(gè)藥劑，而在聯(lián)合治療期間，通常同時(shí)使用兩種或兩種以上的有效量的藥劑。劑量取決于吸收，滅活，和藥物的排泄以及其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的因素。顯然劑量值也隨被治療的疾病的嚴(yán)重程度變化。另外顯然應(yīng)該根據(jù)個(gè)體的需要和對使用或監(jiān)督使用藥物的人的職業(yè)性的判斷來調(diào)整特定的病人用藥期的特別的劑量制度和時(shí)間表。
可用來與本申請公開的化合物聯(lián)合用藥的抗病毒劑的非限制性特例包括2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧雜硫醇烷(oxathiolane)的(-)對映體(FTC)；2-羥甲基-5-(胞嘧啶-1-基)-1，3-氧雜硫醇烷(oxathiolane)的(-)對映體(3TC)；carbovir，阿昔洛韋，干擾素，AZT，DDI(2，′3′-二脫氧肌苷)，DDC(2′，3′-二脫氧胞苷)，L-DDC，L-5-F-DDC和D4T。
附圖的簡要說明圖1表示選自本發(fā)明范圍內(nèi)的L-核苷；L-FMAU(2′-氟-5-甲基-β-L-呋喃阿拉伯糖基尿苷)，L-FIAU(2′-氟-5-碘-β-L-呋喃阿拉伯糖基尿苷)，L-FC(2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基胞嘧啶)，L-FIAC(2′-氟-5-碘-β-L-呋喃阿拉伯糖基胞嘧啶)，L-2-Cl-2′-F-2′-脫氧腺嘌呤，L-FEAU(2′-氟-5-乙基-β-L-呋喃阿拉伯糖基尿苷)，L-阿拉伯糖基胸苷，L-氟達(dá)拉濱，L-阿拉伯糖基鳥苷，和L-阿拉伯糖基肌苷。
圖2為存活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)與H1細(xì)胞中L-FMAU藥物濃度的關(guān)系曲線圖。
圖3為制備1-O-乙?；?2，3，5-三-O-苯甲?；?β-L-呋喃核糖(化合物10)的示意圖。
圖4為可供選擇的制備1-O-乙?；?2，3，5-三-O-苯甲?；?β-L-呋喃核糖(化合物10)的另一種方法的示意圖。
圖5為制備1，3，5-三-O-苯甲?；?2-脫氧-2-氟-α-L-呋喃阿拉伯糖(化合物13)的方法的示意圖。
圖6為制備N9-[3′，5′-二-O-苯甲?；?2′-脫氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基]-2，6-二氯嘌呤(化合物15)和N9-[2′-脫氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基]-2，6-二氯嘌呤(化合物16)的方法的示意圖。
圖7為制備某些2′-脫氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基]-嘧啶(化合物17-24)的方法的示意圖。
圖8為制備N1-(2′-脫氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基]-5-碘胞嘧啶(化合物22)的方法的示意圖。
圖9為制備9-β-L-呋喃阿拉伯糖基腺嘌呤的方法的示意圖。
圖10為由1，2-二-O-異亞丙基-α-L-呋喃木糖(化合物3)制備1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲?；?β-L-呋喃核糖(化合物10)的可供選擇的另一種途徑的示意圖。
圖11為口服給藥一段時(shí)間后小鼠血漿中L-(-)-FMAU濃度的曲線(十字，以10mg/kg的劑量bid(每天二次)給藥29天來進(jìn)行藥物動力學(xué)研究，然后在第三十天以相同的濃度給藥進(jìn)行研究；黑點(diǎn)，以50mg/kg的劑量bid給藥29天，然后在第三十天以相同的濃度給藥，進(jìn)行研究；圓圈，以50mg/kg的劑量，在第一天首次給藥，進(jìn)行研究)。
圖12為口服給藥一段時(shí)間后小鼠肝臟中L-(-)-FMAU濃度的曲線(十字，以10mg/kg的劑量bid(每天兩次)給藥30天來進(jìn)行藥物動力學(xué)的研究，然后在第三十一天以相同的濃度給藥進(jìn)行研究；黑點(diǎn)，以50mg/kg的劑量bid給藥30天，然后在第三十一天以相同的濃度給藥，進(jìn)行研究；圓圈，以50mg/kg的劑量，在第一天首次給藥，進(jìn)行研究)。
圖13a表示對照組BDF1雌性小鼠在三十天內(nèi)體重的變化。圖13b和13c表示以10mg/kg bid的劑量(13b)和50mg/kg的劑量(13c)使用L-(-)-FMAU后BDF1雌性小鼠在三十天內(nèi)體重的變化，所示體重是5至7個(gè)小鼠的平均體重和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖14-20提供了以10mg/kg(三只小鼠)或50mg/kg(三只小鼠)bid的劑量給藥三十天后小鼠血漿的臨床化學(xué)環(huán)境。圖14為以mg/dL表示的小鼠血漿中總膽紅素濃度的直方圖。圖15為以U/L表示的小鼠血漿中堿性磷酸酯酶的濃度的直方圖。圖16為以mg/dL表示的小鼠血漿中肌酸酐濃度的直方圖。圖17為以U/L表示小鼠血漿中AST(SGOT，血清谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶)的濃度的直方圖。圖18為以U/L表示的小鼠血漿中ALT(SGPT，血清谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶)濃度的直方圖。圖19為以mmol/L表示的小鼠血漿中乳酸濃度的直方圖。圖20為以U/L表示小鼠血漿中乳酸脫氫酶濃度的直方圖。
發(fā)明的詳細(xì)描述這里使用的術(shù)語“對映體濃度高的形式”指其中包括至少約95％，優(yōu)選約97％、98％、99％，或100％的核苷的某一對映體的核苷組合物。
這里使用的術(shù)語烷基特別地包括但不限于C1到C10烷基，包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、異丙基、異丁基、仲-丁基、叔-丁基、異戊基、戊基、叔-戊基、環(huán)戊基和環(huán)己基。
這里使用的術(shù)語酰基特別地包括但不限于乙?；⒈；⒍□；?、戊?；?、3-甲基丁酰基、琥珀酸氫酯、3-氯苯甲酸酯、苯甲?；⒁阴；?、新戊?；?、甲磺酸酯、丙?；?、戊?；⒓乎；⑿刘；?、癸?；?、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕櫚酰基、硬脂?；陀退狨；?。
這里使用的術(shù)語芳基，除非另外指出，指苯基。
這里使用的術(shù)語“被保護(hù)的”，除非另外指出，指在分子中另一部分的氧或氮原子反應(yīng)的過程中，加入一個(gè)基團(tuán)防止其他部分的氧或氮原子進(jìn)一步反應(yīng)，氧和氮保護(hù)基可任意地選自有機(jī)合成領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那些。
術(shù)語嘌呤或嘧啶堿基包括，但不限于，腺嘌呤基N6-烷基嘌呤基，N6-?；堰驶?其中酰基為C(O)(烷基、芳基、烷芳基、或芳烷基)，N6-芐基嘌呤基、N6-鹵代嘌呤基、N6-乙烯基嘌呤基、N6-炔基嘌呤基、N6-?；堰驶?、N6-羥烷基嘌呤基、N6-硫代烷基嘌呤基、胸腺嘧啶基、胞嘧啶基、6-氮雜嘧啶基、2-巰基嘧啶基、尿嘧啶基、N5-烷基嘧啶基、N5-芐基嘧啶基、N5-鹵代嘧啶基、N5-乙烯基嘧啶基、N5-炔基嘧啶基、N5-?；奏せ?、N5-羥烷基嘌呤基、N6-硫代烷基嘌呤基、5-氮雜胞苷基、5-氮雜尿嘧啶基、三唑異吡啶基、咪唑異吡啶基、吡咯異吡啶基、吡唑異嘧啶基。堿基上的功能性氧和氮基可按需要成要求保護(hù)。合適的保護(hù)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括三甲基甲硅烷基、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲游基甲基、烷基、?；缫阴；?、丙?；⒍』?、甲磺?；蚉-甲苯磺?；Ｌ貏e地包括5-甲基尿嘧啶(胸腺嘧啶)、5-碘尿嘧啶，胞嘧啶，和5-乙基尿嘧啶。
這里也公開本發(fā)明的治療HBV感染、EBV感染，及其他在人或其他宿主動物體內(nèi)以相似的方式復(fù)制的病毒如HIV感染的方法和組合物，該方法包括使用有效量的一種或一種以上的上面定義的L-核苷，或其生理上可接受的衍生物，或生理上可接受的鹽，非強(qiáng)制性地使用藥學(xué)上可接受的載體，本發(fā)明化合物既可具有抗HBV活性，抗EBV活性，也可被代謝成具有抗HBV或抗EBV活性的化合物。這里公開的化合物也可用于治療與HBV和EBV有關(guān)的疾病。
活性化合物可以任何衍生物的形式使用，根據(jù)對患者的使用方式，該衍生物可直接地或間接地提供母體化合物，或者該衍生物本身具有活性它的非限制性例子為藥學(xué)上可接受的鹽(選擇性地稱為“生理學(xué)上可接受的鹽”)，以及活性化合物5′和嘌呤或嘧啶被酰基化或烷基化的衍生物(選擇性地稱為“生理活性的衍生物”)。作為一個(gè)方案，酰基為羧酸酯類基團(tuán)(即，-C(O)R′)，其中非羰基部分(R′)選自直鏈，支鏈，或環(huán)狀C1到C10烷基，烷氧烷基包括甲氧甲基，芳烷基包括芐基，芳氧烷基如苯氧甲基，芳基包括非強(qiáng)制性地由鹵素，C1到C4烷基或C1到C4烷氧基取代的苯基，磺酸酯如烷基或芳烷基磺酰基包括甲磺?；瑔?，雙或三磷酸酯，三苯甲游基或單甲氧基三苯甲游基，取代的芐基，三烷基甲硅烷基(例如二甲基叔丁基甲硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。該酯中的芳基最適宜地包括苯基或芐基。烷基可為直鏈，支鏈，或環(huán)狀，最適宜地為C1到C10基團(tuán)。I.L-核苷的合成這里公開的L-核苷可按下面的詳細(xì)描述，或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法制備。
在下述合成方案中，其他標(biāo)準(zhǔn)試劑，包括等價(jià)的酸，堿，和溶劑可按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知知識代替這里所述的那些試劑?？墒褂煤軐挿秶难趸虻Ｗo(hù)基，它們公開于，例如，Greene等，“Protective Groupsin Organic Synthesis”，John Wiley and Sons，Second Edition，1991。合適的氧和氮的保護(hù)基包括，例如，三取代的硅烷基如三甲基甲硅烷基，二甲基己基甲硅烷基，叔丁基二甲基甲硅烷基，叔丁基二苯基甲硅烷基，三苯甲游基，烷基，?；缫阴；?，丙酰基，苯甲?；?，P-NO2苯甲酰基，芐基，或甲苯甲?；?，甲磺?；?，或P-甲苯磺?；?。雜環(huán)堿基上的功能性氧和氮應(yīng)在與糖縮合以前被保護(hù)起來。
合適的還原劑包括NaBH4，氫化二異丁基鋁(DIBAL-H)，硼氫化鋰(LiBH4)和氫化雙(2-甲氧乙氧基)鋁鈉(Red-Al)。合適的氧化劑包括含水酸性鉻酸(CrO3)，重鉻酸鈉(Na2Cr2O7)，氯鉻酸吡啶鎓(PCC)，重鉻酸吡啶鎓(PDC)，高錳酸鉀(KMnO4)，四醋酸鉛/吡啶，氧氣與鈀/碳催化劑，RnO4，RuO4/NaIO4，二甲亞砜/二環(huán)己基碳化二亞胺(DMSO/DCC)和質(zhì)子給體，碳酸銀，碳酸三苯基鉍，Oppenaner氧化劑(丙酮中的鋁的醇鹽)和二氧化錳(用于在其他醇中的烯丙基或芐醇的選擇性氧化)。
可用于縮合反應(yīng)的Friedel-Crafts催化劑(Lawis酸)包括SnCl4、ZnCl4、TiCl4、AlCl3、FeCl3、BF3-乙醚和BCl3。由于水的存在會降低催化劑的活性，因此這些催化劑需要無水條件。這些催化劑也在具有活性氫的有機(jī)溶劑。如醇和有機(jī)酸，存在下失活。這些催化劑典型地在溶劑如，二硫化碳、二氯甲烷、硝基甲烷、1，2-二氯乙烷、硝基苯、四氯乙烷，氯代苯、苯、甲苯、二甲基甲酰胺、四氫呋喃，二噁烷，或乙腈中使用。無水氯化鋁不溶于二硫化碳。Niedballa，et al.，J.Org.Chem.39，25(1974)。優(yōu)選的催化劑是SnCl4，優(yōu)選的溶劑是1，2-二氯乙烷。三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯可在與上述Friedel-Crafts催化劑相同的條件下使用。反應(yīng)進(jìn)行的溫度范圍為-10℃到200℃?？捎酶鞣N試劑，包括乙酸、三氟乙酸、氫氟酸、氟化四丁基銨、氟化鉀和吡啶鎓HCl進(jìn)行脫甲硅烷基化。
參見附圖3，由L-木糖(1a)開始，以20％的總產(chǎn)率合成關(guān)鍵的中間體1-O-乙?；?2，3，5-三-O-苯甲?；?β-L-呋喃核糖(10)(L.Vargha，Chem.Ber.，1954，87，1351；Holy.A.，et al.，Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry，VI，163-67)。如附圖4所示，化合物10也可由更昂貴的原料L-核糖合成(Holy，A.，et al.，Synthetic Procedures in Nucleic AcidChemistry，V1，163-67)。圖3說明化合物10的選擇性合成(產(chǎn)率53％)，隨后將其在C2氟化(J.Org.Chem.，1985，50，3644-47)得到1，3，5-三-O-苯甲?；?2-脫氧-2-氟-L-呋喃阿拉伯糖(13)，將其通過溴代糖與不同堿基縮合，得到各種產(chǎn)率的2′-脫氧-2′-氟-呋喃阿拉伯糖基核苷。
1，2-二-O-異丙烯基-α-L-呋喃木糖(3)在650ml無水丙酮中加入4ml濃硫酸，5g分子篩(4A)，80g無水硫酸銅和50g L-木糖，并將該混合物在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。將反應(yīng)混合物過濾并用丙酮充分洗滌，將合并后的濾液用氫氧化銨中和，然后蒸干。加入乙酸乙酯(200ml)。過濾并蒸發(fā)，將所得油狀物溶于250ml0.2％HCl溶液并在室溫?cái)嚢?.5小時(shí)。用sat NaHCO3將pH調(diào)至8，然后蒸干，用乙酸乙酯萃取殘留物。除去溶劑，得到黃色油狀化合物3(41.7g，82.3％)。
1H-NMR(CDCl3)δ5.979(d，J＝3.78Hz，1H，H-1)；4.519(d，J＝3.6Hz，1H，H-2)；4.308(bd，1H，H-3)；4.080(m，3H，H-4 and H-5)；1.321(s，3H，CH3)；1.253(s，3H，CH3).
1，2-二-O-異丙烯基-3，5-二-O-o-甲苯磺酰基-α-L-呋喃木糖(4)0℃下將化合物3(40g，210mmol)在500ml無水吡啶中攪拌，同時(shí)滴加TsCl(75g，393mmol)溶于100ml CHCl3形成的溶液。3小時(shí)后，按與上述相同的方式，加入另一部分TsCl(50g，262mmol)在50mlCHCl3中形成的溶液。將該混合物在r.t.攪拌24小時(shí)，然后冷卻至0℃，加入水(10ml)，然后在r.t.攪拌30分鐘。將反應(yīng)混合物倒入500ml冰水，用CHCl3(150ml×4)萃取。用1.5M H2SO4(150ml×4)，sat.NaHCO3(200ml×2)洗滌，干燥(MgSO4)。除去溶劑得到棕色糖漿狀物，將其用EtOH結(jié)晶，得到白色固體狀4(103.8g，99％)。
1H-NMR(CDCl3)δ7.282，7.836(m，8H，OTs)；5.849(d，J＝3.51Hz，1H，H-1)；4.661，4.779(m，2H，H-3和H-4)；4.193(dd，1H，H-2)；4.011(d，2H，H-5)；2.448，2.478(2s，6H，-OTs)；1.261，1.320(2s，6H，CH3).
1，2-二-O-乙?；?3，5-O-p-甲苯磺?；?α，β-呋喃木糖(5)將化合物4(70g，140.5mmol)溶于700ml冰AcOH和100ml Ac2OH中，在0℃滴加50ml濃硫酸。將所得溶液在r.t.攪拌過夜，然后倒入1L冰水中，用CHCl3(200ml×4)萃取，用sat.NaHCO3洗滌，干燥(MgSO4)。真空除去溶劑后，得到糖漿狀5(84.2g，粗產(chǎn)率110％)。
甲基-3，5-二-O-p-甲苯磺酰基-α，β-呋喃木糖(6)在r.t.下將粗產(chǎn)物5(80g)在500ml 1％HCl/CH3OH中攪拌30小時(shí)。減壓除去溶劑，將殘留物溶于300ml CHCl3，用sat.NaHCO3洗滌，干燥(MgSO4)。除去溶劑得到糖漿狀6(60g，90％由4計(jì)算)。
甲基-2-O-苯甲?；?3，5-二-O-p-甲苯磺酰基-α，β-呋喃木糖(7)將糖漿狀物6(60g，127mmol)溶于200ml吡啶并在0℃攪拌，同時(shí)滴加苯甲酰氯(40ml，345mmol)，將所得溶液在r.t.攪拌17小時(shí)。將其濃縮至約50ml，然后倒入300ml冰水中，用CHCl3萃取，用3NH2SO4和sat.NaHCO3洗滌，干燥(MgSO4)。蒸發(fā)溶劑后，得到糖漿狀7(71g，97％)。
甲基2，3，5-三-O-苯甲?；?α-β-呋喃核糖(9)
將糖漿狀物7(70g)和苯甲酸鈉(100g，694mmol)懸浮于1200mlDMF中并在回流下機(jī)械攪拌16小時(shí)。將其冷卻至r.t.，然后倒入1L冰水，用乙醚萃取，干燥(MgSO4)。蒸發(fā)溶劑得到糖漿狀物(50g，8a和8b)，將其溶于180ml吡啶并在r.m.苯甲?；?BzCl，20ml，172mmol)17小時(shí)。處理后，得到棕色糖漿狀9(48g，83％由7計(jì)算)。
1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲?；?β-L-呋喃核糖(10)將化合物9(26g，54.6mmol)在0℃到r.t.下用275ml冰醋酸，55ml乙酸酐和16ml濃硫酸處理17小時(shí)。然后倒入1L冰水中，用氯仿(200ml×4)萃取。將合并的萃取液用sat.NaHCO3洗滌并干燥(MgSO4)。除去溶劑得到棕色糖漿狀物，將其用乙醇處理得到白色固體狀10。(8.8g，3.2％)。m.p.124.7℃，lit.129-130℃，D型130-131℃[α]D＝-45.613(c1.0)，CHCl3，D型[α]D＝+44.2。
1H-NMR(CDCl3)δ7.317，8.134(m，15H，OBz)；6.437(s，1H，H-1)；5.835(m，2H，H-2和H-3)；4.649(m，3H，H-4和H-5)；2.003(s，3H，CH3COO-).
1-O-乙?；?2，3，5-三-O-苯甲?；?β-L-呋喃核糖(由L-核糖制備)將L-核糖(5g，33.3mmol)懸浮在120ml 1％HCl/MeOH中并在r.t.攪拌3小時(shí)，得到透明溶液。加入30ml無水吡啶猝滅反應(yīng)，然后減壓蒸發(fā)。將所得糖漿狀物與吡啶(30ml×2)共蒸，然后溶于80ml無水吡啶，并在0℃攪拌，同時(shí)滴加苯甲酰氯(20ml，172mmol)。在r.t.攪拌17小時(shí)后，反應(yīng)完全。加入水(10ml)并將該混合物在r.t.攪拌0.5小時(shí)，然后濃縮至約50ml，倒入150ml冰水中，用氯仿(50ml×4)萃取，用3N H2SO4(30ml×2)，sat.NaHCO3(30ml×3)連續(xù)洗滌，并干燥(MgSO4)。除去溶劑得到13g糖漿狀9。
將粗品9溶于80ml HBr/AcOH(45％，w/v)并在r.t.攪拌1.5小時(shí)。在該混合物中加入冰醋酸(50ml)并將所得溶液在0℃攪拌，緩慢加入34ml水以保持溫度低于7℃。然后將其在r.t.攪拌1小時(shí)，倒入200ml冰水中，用氯仿(50ml×5)萃取。將合并的萃取液用sat.NaHCO3洗滌，干燥(MgSO4)。除去溶劑得到糖漿狀物(13g)，將其溶于40ml無水吡啶，在0℃攪拌。然后滴加乙酸酐(14ml，148.4mmol)。反應(yīng)完全后，將其倒入150ml冰水中，用氯仿(50ml×4)萃取。用3N H2SO4(30ml×2)，sat.NaHCO3(50ml×2)連續(xù)地洗滌，并干燥(MgSO4)。除去溶劑并用甲醇處理得到白色固體狀10(9.2g，53.7％由L-核糖計(jì)算)。
1，3，5-三-O-苯甲酰基-α-L-呋喃核糖(11)在0℃下將化合物10(9g，17.84mmol)在100ml CH2Cl2中攪拌，同時(shí)一次加入含HBr(3.2g，30.5mmol)的70ml CH2Cl2。將該混合物在0℃攪拌3.5小時(shí)，加入水(55ml)并將該混合物在r.t.攪拌18小時(shí)。將有機(jī)層分出，用sat.NaHCO3洗滌，干燥(MgSO4)。蒸發(fā)溶劑后，得到泡沫狀物，用CH2Cl2和n-己烷重結(jié)晶，得到白色固體狀11。(6.2g，75.5％)。m.p.137-138℃，lit.140-141℃，[α]D＝-81.960(c0.55，CHCl3；D型[α]D＝+83.71.
1H-NMR(CDCl3)δ7.312，8.187(m，15H，OBz)；6.691(d，J＝4.59Hz，H-1)； 5.593(dd，J4-3＝6.66Hz；J2-3＝1.8Hz，1H，H-30；4.637，4.796(m，4H，H-2，H-4和H-5)；2.3(b，OH).
1，3，5-三-O-苯甲?；?2-O-咪唑磺?；?α-L-呋喃核糖(12)在-15℃下(干冰-CCl4)將化合物11(5.94g，12.84mmol)在50ml無水CH2Cl2中攪拌。連續(xù)地加入無水DMF(15ml)和磺酰氯(3.2ml，3.98mmol)。將該溶液在-15℃攪拌30分鐘，然后在r.t.下放置4小時(shí)。在冰浴冷卻下，在反應(yīng)混合物中分三份加入咪唑(8.7g，12.78mmol)。然后將其在r.t.攪拌17小時(shí)。將該混合物倒入150ml冰水中，用CH2Cl2(50ml×3)萃取水相。將合并的有機(jī)層用水洗滌，干燥(MgSO4)通過柱層析(己烷∶EtOAc/5∶1-1∶1)純化，得到白色固體狀12(3.7g，49％)。m.p.124.5-125.5℃，lit129℃；[α]D＝-68.976；D型+66.154.
1H-NMR(CDCl3)δ6.9，8.2(m，18H，Ar-H)；6.67(d，J＝4.4Hz，1H，H-1)；5.59(dd，1H，H-3)，5.21(dd，1H，H-2)；4.5，4.8(m，3H，H-4和H-5).
1，3，5-三-O-苯甲?；?2-脫氧-2-氟-α-L-呋喃阿拉伯糖(13)。
氬氣下攪拌12(3.33g，5.62mmol)，KHF2(1.76g，22.56mmol)在30ml 2，3-丁二醇中的懸浮液。將其加熱至180℃，同時(shí)加入1ml HF/H2O(48％，27.6mmol)并將該混合物在160℃攪拌1.5小時(shí)。加入冰鹽水猝滅反應(yīng)，然后用二氯甲烷(50ml×4)萃取該溶液。將合并的萃取液用鹽水，水，sat.NaHCO3洗滌，用無水硫酸鎂和活性碳(Darco-60)干燥。將其置于硅膠短柱(5cm×5cm)上，先用二氯甲烷，后用EtOAc洗脫，得到糖漿狀物，在95％EtOH中結(jié)晶，得到13(1.3g，49.8％)。m.p.77-78℃；lit82℃。
1H-NMR(CDCl3)δ7.314，8.146(m，15H，OBz)；6.757(d，J＝9.1Hz，1H，H-1)；5.38(d，J＝48.5Hz，1H，H-2)；5.630(dd，J＝22.5Hz，1H，H-3)；4.768(m，3H，H-4和H-5).
N9-[3′，5′-二-O-苯甲酰基-2′-脫氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基]-2，6-二氯嘌呤(15)將化合物13(464mg，1mmol)溶于10ml二氯甲烷，加入1.4mlHBr/AcOH(45％，w/v)，將該溶液在r.t.攪拌24小時(shí)，然后蒸干。將殘留物溶于20ml二氯甲烷中，用水，sat.NaHCO3洗滌，干燥(MgSO4)。過濾，蒸發(fā)得到溴基糖14(100％，根據(jù)TLC)。
同時(shí)，將2，6-二-氯嘌呤(378mg，2mmol)懸浮在15ml HMDS和2mg硫酸銨中，然后回流2小時(shí)。高真空N2下蒸去HMDS得到白色甲硅烷化的堿。
將溴基糖14溶于25ml無水1，2-二氯乙烷。N2下將所得溶液加入甲硅烷化的堿中。將該混合物攪拌回流2天。加入氯仿(30ml)，然后用水(20ml×2)，sat.NaHCO3(20ml×2)，sat.NaCl溶液(20ml×2)連續(xù)洗滌，干燥(MgSO4)。以CHCl3中結(jié)晶，得到化合物15(105mg，19.7％)。m.p.158℃；D型158℃。UV(甲醇)λmax238.50nm，273.0nm。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.82(d，J＝1.5Hz，1H，H-8)；7.49，8.33(m，10H，OBz)；6.767(dd，JH-H＝4Hz，KF-H＝13.8Hz，1H，H-1′)；5.854(dq，J＝67.4Hz，1H，H-2′)； 5.910(m，1H，H-3′)；4.751(m，3H，H-4′和H-5′).
N9[2′-脫氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基]-2，6-二氯嘌呤(16)在密封的鋼罐中將化合物15(70mg，0.13mmol)溶于25ml sat.NH3/CH3OH中，并在90℃加熱6小時(shí)。減壓除去溶劑得到黃色半固體。將其通過制備TLC(9∶1/CHCl3∶CH3OH)純化。從水和1，4-二噁烷中冷凍干燥，得到白色粉末狀16(30mg，75％)。UV(H2O)pH2，λmax212.00nm，263.50nm(ε6711)；pH7，λmax213.50nm，263.00nm(ε7590)；pH11，λmax213.5nm，263.00nm(ε5468).
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.279(d，J＝1.5Hz，1H，H-8)；7.908(bs，2H，NH2)；6.321(dd，JH-H＝4.4Hz，JF-H＝13.8Hz，1H，H-1′)； 5.986(t，1H，5′-OH)；5.230(dt，JF-H＝52.6Hz，1H，H-2′)； 5.115(d，1H，3′-OH)；4.425(dq，JF-H＝19Hz，1H，H＝3′)；3.841(m，1H，H-4′)；3.636(d，2H，H-5′).
N1-(2′-脫氧-2′-氟-3′，5′-二-O-芐基-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-胸腺嘧啶(17)在13(400mg，0.86mmol)溶于無水CH2Cl2(10ml)形成的溶液中加入醋酸中的溴化氫(45％ w/v，1.5ml)，并將所得溶液在r.t.攪拌17小時(shí)。蒸發(fā)溶劑并用甲苯共蒸后，得到化合物14。
同時(shí)，將胸腺嘧啶(215mg，1.72mmol)在HMDS(25ml)中在氮?dú)夥障禄亓?7小時(shí)，得到均相溶液。蒸去溶劑得到甲硅烷化的胸腺嘧啶。
將14的二氯乙烷(50ml)溶液加入甲硅烷化的胸腺嘧啶，并將所得溶液在氮?dú)庀禄亓?天。加入水，然后用CHCl3萃取。將有機(jī)層用水，鹽水洗滌并干燥(MgSO4)。蒸發(fā)溶劑得到粗產(chǎn)物，將其經(jīng)制備TLC純化，用2％MeOH/CHCl3展開，得到17(235mg，58％)。m.p.99-101℃.UV(Methanol)230，264nm[α]D＝+22.397.
1H-NMR(CDCl3)δ7.343-8.389(m，12H，Ar-H，NH)；6.34(dd，JH-H＝2.97Hz，JF-H＝28.32Hz，1H，H-1′)；5.383(dd，JH-H＝2.7Hz，JF-H＝63.27Hz，1H，H-2′)；5.565(dd，1H，H-3′)；4.812(d，2H，H-5′)；4.466(m，1H，H-4′)；1.775(s，3H，CH3).Anal.(C24H2lN2O7F)，C61.01；H，4.57；N5.73；F3.92.
N1-(2′-脫氧-2′-氧-β-L-呋喃阿拉伯糖基)胸腺嘧啶(18)在r.t.將化合物17(145mg，0.309mmol)用NH3/CH3OH處理18小時(shí)，蒸發(fā)溶劑，經(jīng)制備TLC(15％MeOH/CHCl3)純化，得到18(70mg，87.5％)。m.p.174-175℃.UV264nm，[α]D＝-104.36.
H-NMR(DMSO-d6)δ11.401(s，1H，NH)；7.575(s，1H，H-6)；6.093(dd，JH-H＝4.41Hz，JF-H＝15.6Hz，H-1′)；5.844(d，1H，3′-OH)；5.019(dt，JF-H＝53.3Hz，1H，H-2′)；5.087(t，1H，5′-OH)；4.194(dq，1H，H-3′)；3.647(m，3H，H-4′and H-5′)；1.781(s，3H，CH3).Anal.(C10H13N2FO5)，C44.80；H4.97；N10.04；F7.03.
N1-(2′-脫氧-2′-氟-3′，5′-二-O-苯甲?；?β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-乙基尿嘧啶(19)在13溶于無水二氯甲烷(10ml)形成的溶液中加入醋酸中的溴化氫(45％ w/v，0.97ml，5.385mmol)。將該溶液在r.t.攪拌18小時(shí)，蒸發(fā)溶劑并用甲苯共蒸后，得到14。
同時(shí)，將5-乙基尿嘧啶(0.75g，5.39mmol)懸浮在HMDS(10ml)與硫酸銨(5mg)中，并在氮?dú)夥障禄亓?小時(shí)，得到均相溶液。
在避免濕氣的情況下將甲硅烷化堿溶液蒸干。在所得糖漿狀物中加入14在無水1，2-二氯乙烷(10ml)中的溶液。氮?dú)夥障聦⒎磻?yīng)混合物在95℃攪拌20小時(shí)，然后真空蒸發(fā)至干，得到黃色固體，將其與5mlCH3OH/CHCl3(1∶11混合并過濾。蒸發(fā)濾液，殘留物經(jīng)硅膠柱層析(CH3OH/CHCl3，0-1％)，得到白色固體19(0.557g，100％)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ11.55(s，1H，NH)；7.51，8.08(m，10H，Ar-H)；7.32(s，1H，H-6)；6.29，6.37(dd，JH-H＝3.7Hz，JF-H＝20Hz，1H，H-1′)；5.68-5.75(dd，JF-H＝20Hz，1H，H-3′)，5.47-5.65(dd，JF-H＝54Hz，1H，H-2′)；4.62-4.83(m，3H，H-4′and H-5′)；2.01，2.09(q，2H，CH2-CH3)；0.85(t，3H，CH3).
N1-(2′-脫氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-乙基尿嘧啶(20)將化合物9(500mg)溶于甲醇胺(50ml)中并在r.t.攪拌44小時(shí)。將該溶液蒸于，得到白色固體。經(jīng)硅膠柱層析(CH3OH/CHCl3，0-5％)得到白色固體20(240mg，84％)。m.p.158-161℃。UV(MeOH)λmax260nm.
1H-NMR(DMSO-d6)δ11.42(s，1H，NH)；7.57(s，1H，H-6′)；6.10，6.17(dd，JH-H＝5.0Hz，JF-H＝14Hz，1H，H-1′)；5.88(bs，1H，3′-OH)；5.14，5.19(m，2H，H-2′and 5′-OH)；4.98(t，1H，H-3′)；4.22，4.28(m，1H，H-4′)；3.55，3.78(m，2H，H-5′)Anal.(C11H15N2O5F)C47.93；H5.56；N10.06；F6.68.
N1-(2′-脫氧-2′-氟-3′，5′-二-O-苯甲?；?β-L-呋喃阿拉伯糖基)-N4-苯甲?；?5-碘胞嘧啶(21)在13(150mg，0.323mmol)溶于無水二氯甲烷(5ml)形成的溶液中加入醋酸中的溴化氫(45％ w/v，0.29ml，1.615mmol)。將反應(yīng)混合物在r.t.攪拌9.5小時(shí)。蒸發(fā)溶劑并用甲苯共蒸后，得到黃色糖漿狀15。
同時(shí)，將N4-苯甲?；?5-碘胞嘧啶(550mg，1.615mmol)懸浮于HMDS(8ml)與硫酸銨(3mg)中并在氮?dú)夥障禄亓?小時(shí)，得到均相溶液。
在避免濕氣的情況下將甲硅烷化的堿溶液蒸干。在所得糖漿狀物中加入14在無水1，2-二氯乙烷(10ml)中的溶液。氮?dú)夥障聦⒎磻?yīng)混合物回流23小時(shí)，然后蒸干，得到棕色糖漿狀物，將其用氯仿(30ml)研制。將所得沉淀過濾除去并用氯仿洗滌，將濾液的洗液合并并蒸發(fā)，得到棕色糖漿狀物。通過硅膠柱層析(CH3OH/CHCl3，0-1％)分離混合產(chǎn)物，得到白色固體狀21(100mg，45％)。
1H-NMR(CDCl3)δ11.40(bs，1H，NH)7.26，8.20(m，17H，Ar-H，H-6 and NH)；6.36，6.44(dd，JHH＝2.8Hz，JF-H＝21Hz，1H，H-1′)；5.62，5.68(dd，1H，H-3′)；5.39，5.56(dd，1H，H-2′)；4.58，4.85(m，3H，H-4′和H-5′).
N1-(2′-脫氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘胞嘧啶(22)在r.t.下將化合物21(100mg，0.27mmol)用sat.NH3/MeOH(60ml)處理24小時(shí)。經(jīng)硅膠柱層析(0-10％CH3OH/CHCl3)得到白色固體狀化合物22(35mg，71％)。[α]D＝-65.4(c 0.34，CH3OH)；UV(MeOH)λmax＝293nm.
1H-NMR(DMSO-d6)；δ8.04(s，1H，H-6)；6.74，7.94(s，1H，NH)；6.01，6.08(dd，JH-H＝3.9Hz，JF-H＝16.6Hz，1H，H-1′)；5.85(d，1H，3′-OH)；5.17(t，1-H，5′-OH)；5.08(t，1H，H-2′)；4.89(t，1H，H-3′)；4.15-4.23(m，1H，H-4′)；3.63-3.79(m，2H，H-5′).
N1-(2′-脫氧-2′-氟-3′，5′-二-O-苯甲?；?β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶(23)在13(260mg，0.56mmol)溶于10ml無水CH2Cl2形成的溶液中加入HBr/AcOH(45％，w/v，0.5ml，2.8mmol)。將反應(yīng)混合物在r.t.攪拌36小時(shí)。然后蒸干。將殘留物溶于20ml CH2Cl2，用水(10ml)，sat.NaHCO3(10ml)洗滌，干燥(MgSO4)。過濾并蒸發(fā)得到糖漿狀溴基糖14。
同時(shí)，將5-碘尿嘧啶(270mg，1.12mmol)懸浮于10ml HMDS中并回流36小時(shí)，得到均相溶液。將其真空蒸干。在其中加入14在無水1，2-二氯甲烷中的溶液，并在N2下將所得溶液回流1.5天。加入CHCl3(20ml)，并將該溶液用水(10ml)、鹽水(10ml)和sat.NaHCO3(10ml)連續(xù)洗滌，然后干燥(MgSO4)。除去溶劑，將所得糖漿狀物用CH2Cl2結(jié)晶，得到黃色固體狀23(237mg，73％)。將其中一部分(70mg)用2-異丙醇重結(jié)晶，得到白色固體(67mg)。UV(Methanol)λmax230.0nm，276.0nm.
1H-NMR(CDCl3)δ8.4，7.3(m，12H，Ar-H)；6.29(dd，JH-H＝2.43Hz，JF-H＝21.6Hz 1H，H-1′)；5.377(dd，JH-H＝2.8Hz，JF-H＝61.3Hz，1H，H-2′)；5,55(dd，1H，H-3′)；4.865，4.793(d，2H，H-5′)；4.588，4.502(m，1H，H-4′).
N1-(2′-脫氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶(24)將化合物23(40mg，0.069mmol)溶于25ml sat.NH3/MeOH并在r.t.攪拌24小時(shí)，然后蒸干。將所得糖漿狀物經(jīng)制備TLC(5∶1/CHCl3∶MeOH)純化，得到固體狀24(19mg，74％)。UV(MeOH)λmax280.5nm.
1H-NMR(DMSO-d6)δ11.82(bs，CONH)；8.24(s，1H，H-6)；6.082(dd，JH-H＝4.45Hz，JF-H＝13.7Hz，1H，H-1′)；5.947(d，1H，3′-OH)；5.296(t，1H，5′-OH)；5.07(dt，JF-H＝53Hz，1H，H-2′)；4.24(bd，JF-H＝21Hz，1H，H-3′)；3.81，3.55(m，3H，H-4′，H-5′).
2，3，5-三-O-芐基-L-阿拉伯糖如附圖9所示，先將三十克(0.2mol)L-阿拉伯糖(5)粉末，再將0.4ml濃硫酸加入600ml(14.8moles)無水甲醇中。將此懸浮液攪拌并溫和地加熱回流2小時(shí)，得到透明的溶液。將反應(yīng)混合物用1.5g碳酸氫鈉中和，干燥，然后真空蒸發(fā)，得到重糖漿狀物6，將其用新純化的四氫呋喃(50ml)稀釋并再濃縮(35-40℃浴)以除去殘留的甲醇。加入新純化的四氫呋喃(400ml)，并用30g Drierite，156g(2.78mole)氫氧化鉀和200ml(1.74mole)芐基氯處理該混合物。將該混合物溫和地加熱回流過夜，冷卻，用一薄層硅藻土過濾，真空濃縮，然后使其處高真空和100°(浴)下。將粗品糖漿狀甲基2，3，5-三-O-芐基-L-阿拉伯糖甙(7)溶于400ml冰醋酸中。將此水解混合物在65-70℃加熱2小時(shí)，真空濃縮至三分之一體積，并倒入2.5L冰水混合物中。種晶后(晶種最初來自層析，用二氯甲烷洗脫)，使混合物保持5°過夜。將水層從部分結(jié)晶的塊中潷出，并將后者溶于200ml二氯甲烷。將該溶液用冷的碳酸氫鈉水溶液洗滌，干燥(Na2SO4)，用一薄層脫色碳過濾，真空濃縮成稀糖漿狀物，并將其溶于200ml環(huán)己烷。種晶之后，使該溶液在室溫下保持1小時(shí)并在5°下過夜。得到27.7g(33.2％)2，3，5-三-O-芐基-L-阿拉伯糖(8)，m.p68-73℃。[α]D25＝-1.69[c 2.01，9∶1(v/v p-二噁烷-水)]。UV(MeOH)λmax220；300-MHz 1HNMR(CDCl3)δ3.48-3.62(m，2H，H-5)，3.94-4.18(m，3H，H-2，3，4)，5.33(d，1H，J＝4.07，H-1)，5.29(s，H-1)，7.25-7.33(m，15，H-aromat).
2，3，5-三-O-芐基-1-O-(p-硝基苯甲酰基)-L-阿拉伯糖(9)將化合物8(附圖9)(2g，4.76mmole)溶于7.5ml二氯甲烷，并在此溶液中加入0.95g(5.1mmoles)p-硝基苯甲酰氯在5ml二氯甲烷和1.5ml吡啶的混合物中形成的溶液。將反應(yīng)混合物保持室溫過夜，然后用1N鹽酸(2×10ml)、碳酸氫鈉水溶液(2×10ml)和水(3×30ml)連續(xù)洗滌。用Na2SO4除濕，真空濃縮該溶液，得到2.67g(98.4％)化合物9的端基異構(gòu)體混合物。通過硅膠柱層析(己烷∶丙酮，8∶1)進(jìn)一步純化，產(chǎn)物mp89-93℃。[α]24D＝13.04(C6.8，CH2Cl2)，UV(MeOH)λmax215.5 and 258.5，250MHz 1NMR(CDCl3)δ3.54-3.69(m，2H，H-5)，4.06(m，1H；H-4′)，4.22(m，1H，H-3′)，4.33(m，1H，H-2′)，4.38-4.78(m，6H，benzyl CH2)，6.50(d，1H，J＝2.35，H-1)，7.23-7.36(m，15H，芐基上的芳香H)，8.01-8.25(m，4H，硝基苯甲酰基上的芳香H)。
10(2，3，5-三-O-芐基-β-L-阿拉伯糖基)胸腺嘧啶(12)將0.444g(3.52mmole)的胸腺嘧啶和硫酸銨(2mg)懸浮于10ml六甲基二硅氮烷中，在氬氣中回流(140℃)過夜得到一澄清溶液。在真空無水條件下除去過量的六甲基二硅氮烷得到糖漿狀物11。
將化合物9(1g，1.76mmole)0℃下加入17ml用無水氯化氫預(yù)飽和的二氯甲烷中。0℃保持2小時(shí)后，將沉淀對-硝基苯甲酸(0.25g)過濾除去，將濾液真空濃縮成稀糖漿狀物、然后室溫下在高真空泵中保持2小時(shí)得到氯化2，3，5-三-O-芐基-α-L-阿拉伯糖(10)。
將上述制備的化合物10溶于15ml無水二氯甲烷中，將溶液加入甲硅烷基化的胸腺嘧啶和3g 4A分子篩的混合物中。將反應(yīng)混合物在氬氣中室溫下攪拌18小時(shí)。將反應(yīng)混合物用50ml的二氯甲烷稀釋，并在劇烈攪拌下傾入2ml飽和NaHCO3水溶液中。將出現(xiàn)的白色沉淀(氫氧化亞錫)在硅藻土墊上濾出。將有機(jī)層從水中分離出來并用水洗滌(3×30ml)。水層用二氯甲烷萃取，合并二氯二烷層并用Na2SO4干燥，然后真空蒸發(fā)得到糖漿狀物并用硅膠柱層析純化(氯仿∶甲醇，100∶1)得到0.68g糖漿狀物12(73％)。25D＝-56.71(C 0.6，CH2Cl2).UV(MeOH)λmax218 and 265；300MHz 1HNMR(CDCl3)δ1.67(d，3H，J＝1.11，CH3)，3.66-3.70(m，2H，H-5′)4.06(m，1H，H-4′)，4.13(t，1H，J＝4.7，H-3′)，4.24(t，1H，J＝4.7，H-2′)，4.41，4.54，4.56(m，6H，benzyl CH2)，6.28(d，1H，J＝5.24，H-1′)，7.15-7.33(m，15H，芳香-H)，7.43(d，1H，J＝1.31，H-6).
1-β-2-阿拉伯呋喃胸腺嘧啶(13)將氯化鈀(680mg，3.85mmole)懸浮于100ml甲醇中，室溫下在氫氣中振搖還原。然后將450mg 12的25ml甲醇溶液加入酸性鈀黑懸浮液中。室溫下將反應(yīng)混合物于氫氣中振搖38小時(shí)。除去催化劑后，將溶液用Dowex(HCO3-)中和至pH7并且真空濃縮得到白色固體并用乙醇重結(jié)晶得到13(105mg，47.7％)m.p.244-249℃.[α]25D＝-91.48(0.25，H2O)；IR(KBr)1750，1600cm-1(CO)；UV(MeOH)λmax268；300MHz 1HNMR(DMSO-d6)δ1.76(s，3H，CH3)，3.62(t，2H，J＝4.56，H-5′)3.69(m，1H，H-4′)，3.90(t，1H，J＝3.88，H-3′)，3.99(t，1H，J＝4.10，H-2′)，5.08(brs，1H，C′5-OH，可互換的)，5.42(d，1H，J＝4.24，C′2-OH or C′3-OH，可互換的)，5.54(d，1H，J＝5.23，C′2-OH或C′3-OH，可互換的)，5.97(d，1H，J＝4.64，H-1′)，7.51(d，1H，J＝0.97，H-6)，11.26(s，1H，NH，可互換的)元素分析理論值C10H14N2O6；C，46.51；H，5.46；N，10.85；實(shí)測值C，46.67；H，5.63；N，10.56.
1-(2，3，5-三-O-芐基-β-L-阿位伯糖基)胞嘧啶(15)將0.61g(6mmole)胞嘧啶和硫酸銨(2mg)懸浮于15ml六甲基二硅氮烷中，在氮?dú)庵谢亓?140℃)2小時(shí)得到澄清溶液。在無水真空條件下將甲硅烷基化的胞嘧啶混合物蒸發(fā)至干得到糖漿狀物14。
將化合物9(2.82g，5mmole)0℃下加入47ml用無水氯化氫預(yù)飽和的無水二氯甲烷中。在0℃保持2小時(shí)后，將沉淀對-硝基苯甲酸(0.807g)過濾除去，將濾液真空濃縮得到糖漿狀的氯化2，3，5-三-O-芐基-α-L-阿拉伯糖(10)。
將上述制備的化合物10溶于28.5ml無水二氯甲烷中，將溶液加入甲硅烷基化的胞嘧啶(14)和8.3g的4A分子篩的混合物中。將反應(yīng)混合物在氮?dú)庵惺覝財(cái)嚢?天。然后將反應(yīng)混合物用50ml二氯甲烷和20ml水稀釋，并且在劇烈攪拌下傾倒入2ml飽和NaHCO3水溶液中。將出現(xiàn)的白色沉淀(氫氧化亞錫)在硅藻土墊上濾出。從水中分出有機(jī)層并用水洗滌(3×30ml)。水層用二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷層并用Na2SO4干燥，然后真空蒸發(fā)得到糖漿狀物，將其用硅膠柱層析(氯仿∶甲醇，96∶4)純化得到15為白色固體，用2-丙醇重結(jié)晶得到1.53g產(chǎn)物(60％)。m.p.146-148℃，[α]25D＝-105.2(Cl，CH2Cl2)，UV(MeOH)λmax211.5，λmin 272.5，pH1，pH7；λmax 211.5，λmin284，pH9. 300MHz 1HNMR(CDCl3)δ3.65(d，2H，J＝4.85，H-5′)，4.00(t，1H，J＝3.72，H-3′)，4.11(m，1H，H-4′)，4.28(m，1H，H-2′)，4.38-4.55(m，6H，芐基-CH2)，5.56(d，1H，J-7.5，H-5)，6.39(d，1H，J＝4.59，H-1′)，7.12-7.31(m，15H，芳香-H)，7.63(d，1H，J＝7.5，H-6).
通過催化氫化15得到1-β-L-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶鹽酸鹽(16)將氯化鈀(315mg，1.78mmole)懸浮在160ml甲醇中，室溫下在氫氣中振搖還原。然后在鈀黑的酸性懸浮液中加入300mg 15的54ml甲醇溶液。室溫下將反應(yīng)混合物在氫氣中振搖3小時(shí)。除去催化劑后，用Dowex(HCO3-)中和該溶液，真空濃縮然后用制備TLC(MeOH∶CHCl3，3∶5)得到糖漿狀物，將其溶于3ml甲醇中，加入1％的HCl甲醇溶液至pH1，濃縮至干并用2一丙醇研制得到36mg(22.1％)16。m.p.190-194℃，[α]25D＝-115.47(C 0.07，H2O)；UV(H2O)λmax275，DH7；λmax209.5，273，pH11；λmax280，pH1；300MHz1HNMR(DMSO-d6)；δ3.61(d，2H，H-5′)，3.82(m，1H，H-4′)，3.93(m，1H，H-2′or H-3′)，4.04(brs，1H，H-2′)or H-3′)，5.18(brs，1H，C5′-OH，可互換的)，5.61(brs，1H，C2′-OHor C3′OH，可互換的)，5.67(brs，1H，C2′-OH orC3′-OH，可互換的)，6.00(d，1H，J＝4.02，H-1′)，6.01(d，1H，J5.6＝7.8，H-5)7.92(d，1H，J5.6＝7.8，H-6)，8.49(brs，1H，NH，可互換的)，9.38(brs，1H，NH，可互換的).
用三氯化硼處理化合物15得到1-β-L-呋喃阿拉伯糖基胞嘧啶鹽酸鹽(16)將5ml 1M三氯化硼的二氯甲烷溶液冷卻至-72℃(干冰-丙酮)。將15(180mg，0.351mmole)的3ml二氯甲烷溶液緩慢地加入三氯化硼溶液中?？偡磻?yīng)時(shí)間達(dá)2.75小時(shí)后，除去冷卻浴并將溶劑和氣體真空除去。將殘余物溶于冷二氯甲烷(10ml)中并將溶液蒸發(fā)至干(3次，直到得到白色固體殘余物)，加入冷的飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)pH至6-7?；旌衔镉靡掖枷♂?，加熱至沸，用活性炭處理，并過濾。將濾液蒸發(fā)至干得到糖漿狀物并將其溶于3ml甲醇，加入1％的HCl甲醇溶液至pH1，濃縮至干并用2-丙醇研制得到16(66mg，78.4％)。
9-(2，3，5-三-O-芐基-β-L-阿拉伯糖基)腺嘌呤(18)將徹底干燥的化合物9(5g，8.8mmole)在0℃下加入82ml用無水氯化氫預(yù)飽和的二氯甲烷中。0℃反應(yīng)2小時(shí)后，將沉淀對-硝基苯甲酸(1.53g)過濾除去，將沉淀真空濃縮成糖漿狀物然后室溫保持全真空2小時(shí)。將如此制備的氯化2，3，5-三-O-芐基-α-L-阿拉伯糖(10)溶于50ml二氯甲烷中，并將溶液加入4.5g(18.8mmole)干燥N-苯甲酰腺嘌呤5(17)和14.5g 4A分子篩的混合物中。將反應(yīng)混合物室溫下攪拌1周，通過硅藻土墊過濾，真空濃縮成糖漿狀物，用己烷-丙酮(3∶1，Rf＝0.22)進(jìn)行硅膠色譜純化。分離產(chǎn)物并真空濃縮成糖漿狀物，再在不銹鋼高壓氣體貯罐中用甲醇化的氨(20ml)溶解并攪拌，在50-55℃加熱過夜。將溶液減壓濃縮得到半固體物并用熱異丙醇重結(jié)晶得到2.4g 18(50.7％)。m.p.128-129℃.[α]27D＝-20.04(1.04，CH2Cl2)；UV(CH2Cl2)λmax213，258.5；250MHz1HNMR(CDCl3)δ1.95(brs，1H，NH，可互換的)，3.69(d，2H，J＝4.82，H-5′)，4.18-4.30(m，6H，芐基CH2)，4.51-4.64(m，3H，H-2′，3′，4′)，5.73(brs，1H，NH，可互換的)，6.52(d，1H，J-4.00，H-1′)，6.89-6.93，7.17-7.37(m，15H，芐基上的芳香H)，8.17(s，1H，H-2 or H-8)，8.32(s，1H，H-2或H-8).
9-β-L-呋喃阿拉伯糖基腺嘌呤(19)將三氯化硼(1M 5ml)的二氯甲烷溶液冷卻至-72℃(干冰-丙酮)。將18(150mg，0.279mmole)的5ml二氯甲烷溶液緩緩加入三氯化硼溶液中?？偡磻?yīng)時(shí)間達(dá)3.5小時(shí)后，除去冷卻浴，真空除去溶劑和氣體。將殘余物溶于冷二氯甲烷(10ml)中并將溶液蒸發(fā)至干(6次，直至得到黃色固體殘余物)。加入冷飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)pH至7-8。將混合物用乙醇稀釋，加熱至沸，用硅藻土過濾懸浮液，濾液真空濃縮成糖漿狀物并用水重結(jié)晶。得到55mg(74％)19。
m.p.256-258℃，UV(H2O)λmax259；300MHz 1HNMR(DMSO-d6)δ3.62-3.66(m，2H，H-5′)，3.77(brs，1H，H-4′)，4.13(brs，2H，H-2′，3′)，5.12(t，1H，J＝5.4，C′5-OH，可互換的)，5.54(d，1H，J＝3.78，C′2-OH or C′3-OH，可互換的)，5.63(d，1H，J＝4.32，C′2-OH or C′3-OH，可互換的)，6.25(d，1H，J＝4.02，H-1′)，7.25(brs，2H，NH2，可互換的)，8.13(s，1H-H-2或H-8)，8.18(s，1H，H-2 or H-8).
圖10是改變路線由1，-二-O-異亞丙基-α-L-呋喃木糖(化合物3)制備1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲?；?β-L-呋喃核糖(化合物10)的圖解。
1，2-二-O-異亞丙基-α-L-呋喃木糖(3)在650ml無水丙酮中加入4ml濃硫酸，5g分子篩(4A)，80g無水硫酸酮及40g L-木糖。將混合物室溫?cái)嚢?6小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物過濾并用丙酮徹底洗滌，合并濾液并用氫氧化銨中和然后蒸發(fā)至干。加入乙酸乙酯(200ml)，然后過濾并蒸發(fā)，將所得油狀物溶于250ml0.2％的HCl中并將溶液室溫?cái)嚢?.5小時(shí)。用飽和NaHCO3調(diào)pH至8，然后蒸發(fā)至干。殘余物用乙酸乙酯萃取。除去溶劑得到黃色油狀物3(41.7g，82.3％)。1H-NMR(CDCl3)δ5.979(d，J＝3.78Hz，1H，H-1)；4.519(d，J＝3.6Hz，1H，H-2)；4.308(bd，1H，H-3)；4.080(m，3H，H-4 and H-5)；1.321(s，3H，CH3)；1.253(s，3H，CH3).
5-O-苯甲?；?1，2-二-O-異亞丙基-α-L-呋喃木糖(25)將化合物3(41g，215.6mmol)0℃下在吡啶(150ml)和CH2Cl2(150ml)中攪拌。滴加溶于30ml吡啶中的BzCl(27.5ml，237mmol)。30分鐘后，加入水(5ml)并將混合物蒸發(fā)至干，再溶于EtOAc中，用飽和NaHCO3洗滌，然后干燥(Na2SO4)。蒸發(fā)溶劑得到橙色糖漿再用Et2O結(jié)晶得到化合物20(36g)。將母液蒸發(fā)至干，殘余物用硅膠柱層析純化(1％CH3OH/CHCl3)得到另一批化合物25(12g，總收率76％)m.p.82-83℃.lit1D形式83.5-84.5℃.1H-NMR(CDCl3)δ7.43，8.07(m，5H，Ar-H)；5.97(d，1H，J＝3.6Hz，H-1)；4.80(q，1H，H-4)；4.60(d，1H，J＝3.6Hz，H-2)；4.40，4.20(m，3H，H-5，H-5′，H-3)；3.50(bs，1H，D2O可互換的，3OH)；1.51，1.32(2s，6H，2CH3).
5-O-苯甲?；?1，2-二-O-異亞丙基-α-L-赤-呋喃戊-3-酮糖(26)將化合物25(40g，136mmol)在450ml CH2Cl2中攪拌。在其中加入重鉻酸吡啶鎓鹽(PDC，30.7g，81.6mmol)和Ac2O(42.3ml，448.8mmol)。將混合物回流2.5小時(shí)。將溶液濃縮至原體積的1/5，然后加入乙酸乙酯(50ml)，并過濾。將濾液傾到在硅膠短柱(10cm×5cm)上，用EtOAc洗脫，合并洗脫液并濃縮，用甲苯共蒸發(fā)(50ml×2)。用己烷和EtOAc結(jié)晶得到21，為白色固體(38g，96％)。m.p91-93℃，[α]D-132°(c，1.0，CHCl3)；lit2D形式m.p.93-94.5℃，[α]D+135°(c，1.0，CHCl3)；IR(KBr)1773cm-(ArCO)，173°Cm-(CO).1H-NMR(CDCl3)δ7.97，7.42(m，5H，Ar-H)；6.14(d，1H，J＝4.4Hz，H-1)；4.74，4.68(m，2H，H-4，H-2)；4.50 4.44(m，2H，H-5，H-5′)；1.52，1.44(2s，6H，2CH3)。元素分析理論值(C15H16O6)C，61.64；H，5.52；實(shí)測值C，61.42；H，5.53.
5-O-苯甲?；?1，2-二-O-異亞丙基-α-L-赤-呋喃戊-3-酮糖(26)將化合物25(40g，136mmol)在450mlCH2Cl2中攪拌。在其中加入重鉻酸吡啶鎓鹽(PDC，30.7g，81.6mmol)和Ac2O(42.3ml，448.8mmol)。將混合物回流2.5小時(shí)。將其濃縮為原體積的1/5，然后加入乙酸乙酯(50ml)。將溶液過濾，并將濾液傾到在硅膠板(10cm×5cm)上，用EtOAc洗脫，合并洗脫液并濃縮，用甲苯共蒸發(fā)(50ml×2)。用己烷和EtOAc結(jié)晶得到26為白色固體(38g，96％)。m.p91-93℃，[α]D-132°(c，1.0，CHCl3)；lit2D形式m.p.93-94.5℃，[α]D+135°(c，1.0，CHCl3)；IR(KBr)1773cm-(ArCO)，173℃m-(CO).1H-NMR(CDCl3)δ7.97，7.42(m，5H，Ar-H)；6.14(d，1H，J＝4.4Hz，H-1)；4.74，4.68(m，2H，H-4，H-2)；4.50 4.44(m，2H，H-5，H-5′)；1.52，1.44(2s，6H，2CH3).元素分析理論值(C15H16O6)C，61.64 ；H，5.52；實(shí)測值C，61.42； H，5.53.
1，2-二-O-異亞丙基-α-L-呋喃核糖(27)將化合物26(37g，127mmol)在0℃溶于EtOH/H2O(400ml/100ml)中，并分批加入NaBH4(23.3g，612mmol)。將懸浮液室溫?cái)嚢?小時(shí)。過濾并將濾液蒸發(fā)至干再用甲醇共蒸發(fā)。硅膠柱層析(0-15％CH3OH/CH2Cl2)之后從EtOAc/己烷中結(jié)晶，得到27為白色針晶(19g，79％)。m.p.86-87℃；[α]D-31.5°(c，0.62，CHCl3)；lit3，D形式m.p.86-87℃，[α]D+37°(c，0.59，CHCl3)；IR(KBr)3356cm-(OH).1H-NMR(CDCl3)δ5.83(d，1H，J＝3.98Hz，H-1)；4.595(t，1H，H-2)；4.055，3.72(m，4H，H-3，H-4，H-5，H-5′)；2.38(d，1H，D2O交換，3-OH)；1.83(t，1H，D2O交換，5-OH)；1.58，1.38(2s，6H，2CH3).元素分析理論值(C8H14O5)C，50.50；H，7.42；實(shí)測值C，50.62；H，7.46.
3，5-二-O-苯甲酰基-1，2-二-O-異亞丙基-α-L-呋喃核糖(28)將化合物27(19g，100mmol)0℃下在300ml吡啶中攪拌，分批加入132cl(40ml，348mmol)然后在室溫?cái)嚢?小時(shí)。將溶劑蒸發(fā)至干。殘余物用EtOAc萃取，用飽和NaHCO3洗滌，干燥(Na2SO4)，蒸發(fā)溶劑并用乙醚結(jié)晶得到23為白色固體39g(98％)m.p.83-85℃.1H-NMR(CDCl3)δ8.07，7.36(m，10H，Ar-H)；5.94(d，1H，J＝3.6Hz，H-1)；5.05，5.00(m，1H，H-2)；4.73，4.63(m，3H，H-4，H-5，H-5′)；1.58，1.35(2s，6H，2CH3).元素分析理論值(C22H22O7)C，66.50；H，5.64；實(shí)測值C，66.32，H，5.57.
1-O-乙?；?2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-L-呋喃核糖(31)將化合物28(38g，95mmol)在300ml 1％的HCl/CH3OH中室溫?cái)嚢?0小時(shí)。加入吡啶(20ml)然后將溶液蒸發(fā)至干。殘余物用吡啶共蒸發(fā)(30ml×2)，然后在0℃將其溶于100ml無水吡啶同時(shí)分滴加入BzCl(17ml，146mmol)，再于室溫?cái)嚢?小時(shí)。蒸發(fā)溶劑，將殘余物溶于EtOAc中，依次用0.5N HCl和飽和NaHCO3洗滌，然后干燥(Na2SO4)。蒸發(fā)溶劑得粗產(chǎn)物30為糖漿狀物。
將粗產(chǎn)物30在冰醛酸(400ml)中攪拌，然后在0℃加入Ac2O(100ml)同時(shí)分批加入濃H2SO4(10ml)將該溶液室溫下攪拌過夜。將混合物傾入冰水中，用CHCl3萃取，用飽和NaHCO3中和，然后干燥(Na2SO4)。將溶劑蒸發(fā)之后，得到淺黃色糖漿狀物，用甲醇結(jié)晶得到31為白色固體23.89g(49.6％，從28-31)。
m.p.124.7℃，[α]D＝45.613(c1.0，CHCl3)；lit4，m.p.129-130℃，[α]D＝-43.6(c 1.0，CHCl3).1H-NMR(CDCl3)δ7.317，8.134(m，15H，OBz)；6.437(s，1H，H-1)；5.835(m，2H，H-2 and H-3)；4.649(m，3H，H-4 and H-5)；2.003(s，3H，CH3COO-)II.生物活性本發(fā)明公開的化合物可以用下面詳細(xì)公開的方法，或用其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法評價(jià)其抗HBV和EBV活性。
實(shí)施例1 抗HBV生物活性用攜帶HBV的人肝細(xì)胞(2.2.15細(xì)胞)測定。該細(xì)胞在含10％的牛胎血清的最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長至匯集。每隔3天換一次培養(yǎng)液。在匯集層上開始給藥然后再繼續(xù)培養(yǎng)3天。將培養(yǎng)液從培養(yǎng)物上除去之后再在原處加相同濃度的藥并將培養(yǎng)物再繼續(xù)保持3天。在給藥6天后收集培養(yǎng)基并用聚乙二醇法沉淀病毒粒。隨后消化病毒粒并進(jìn)行Son thern分析。將印跡與特異性HBV探針雜交測定病毒DNA數(shù)量并比較未給藥培養(yǎng)物的DNA水平?；蚪MDNA用HindIII消化并進(jìn)行Southern分析。游離型DNA水平的測定與整合型HBV的DNA相關(guān)。計(jì)算與對照組相比DNA 50％抑制率(ID50)的藥物濃度。結(jié)果概括于表I中。
表1通過L-核苷的HBV抑制率化合物 ID50(μM) MT2 CEM CD50(μM)抗-HBV活性 CD50(μM) CD50(HI cells)L-FMAU0.1 100 ＞100 1000D-FMAU2.0 8-910 50D-FEAU5.0 10090 2000L-FEAU ＞5.0 100 ＞100 900實(shí)施例2抗EBV的生物學(xué)活性將給藥后的H1細(xì)胞保持在對數(shù)期生長2天。將細(xì)胞在室溫下600g離心10分鐘而將其從含有原有病毒粒的培養(yǎng)基中分離。將H1細(xì)胞接種在密度為1×105細(xì)胞/孔的24孔盤上，該盤為2ml含或不含藥的新配培養(yǎng)基，于37℃保溫5天。收集含有病毒粒子的培養(yǎng)基用于通過生物測定來評價(jià)藥物對病毒生成和傳染力的抑制作用。將病毒粒子從不含細(xì)胞培養(yǎng)基中通過SW-50 Ti轉(zhuǎn)頭(Beckman)在45000rpm離心90分鐘沉淀將病毒粒子再懸浮于1ml生長液中并用于傳染1×106Raji細(xì)胞48小時(shí)。由于重復(fù)傳染后的Raji細(xì)胞中的EBV DP活性水平與所加病毒粒子的數(shù)量成正比，所以EBV特異性DP活性的降低便可測定。藥物的抑制作用便可通過與多次稀釋的對照組的EBV DP活性相比計(jì)算出來。沒有發(fā)現(xiàn)用1mML-FMAU處理6天后H1細(xì)胞線粒體DNA的抑制。
狹縫印跡測定-線粒體DNA的數(shù)量用狹縫印跡法測定(2)。2×105給藥和未給藥的HI細(xì)胞在200μl 10mM的Tris、HCl(pH7.5)溶液中用凍/融法裂解。細(xì)胞裂解液用10μg/ml的RNase A37℃處理30分鐘，然后用蛋白酶K(100μg/ml)在55℃處理2小時(shí)，在每個(gè)細(xì)胞裂解液中加入等量的20×SSC緩沖液。煮沸10分鐘后，將樣品滴到尼龍膜上(Hybond-N，Amersham Corp)。用放射標(biāo)記的人線粒體DNA碎片作DNA雜交的探針。在除去線粒體DNA探針后的膜上再用人Alu DNA探測。給藥和未給藥的線粒體DNA的量可用光密度法確定(LKB Ulfroscan XL)結(jié)果列于表2。
表2藥物 CD50(μM) ID90(μM) 治療指數(shù)(CD50/ID90)PFA 1200±10075±5 16DHPG 75±6 5±1 15ACV 1000±75 50±8 20PCV 500±55 20±2 25L-FMAU 1000±80 5±0.8 200D-FMAU 50±100.1±0.02 50L-FEAU900±70 60±1115D-FEAU 2000±80 1±0.05 2000L-FIAC400±35 ＜10 ＞40D-FIAC125±15 5±0.5 25L-FIAU240±20 20±4 12D-FIAU 20±4 0.5±0.05 40化合物對EBV的抑制作用CD50通過將在培養(yǎng)基中37℃正常生長72小時(shí)的Hl細(xì)胞暴露于不同濃度的化合物中來表征；然后將細(xì)胞計(jì)數(shù)并與對照組比較。Hl細(xì)胞給藥5天后用生物測定法測定ID90。實(shí)施例3 L-(-)-FMAU從血漿和肝中的清除率測定L-(-)-FMAU在口服給藥的鼠血漿和肝中的清除率。給鼠接種用氚標(biāo)記(放射特性為9.3μmol/μCi)的L-(-)-FMAU。
圖11是小鼠在口服給藥超時(shí)后的L-(-)-FMAU血漿濃度圖，圖12是在口服給藥超時(shí)后鼠肝中的L-(-)-FMAU濃度圖(十字形，每天兩次10mg/kg給藥30天先做藥代動力學(xué)研究再在第31天給相同濃度的藥黑圈；每天兩次50mg/kg給藥30天先做研究再在第31天給相同濃度的藥；開口圈在研究的第一天第一次給50mg/kg的藥)。
在指定的時(shí)間(見圖10和11用肝素化的毛細(xì)管從鼠后眼竇放血。血漿用三氯乙酸萃取并用氟利昂/三辛胺中和。上清液直接計(jì)數(shù)并計(jì)算其濃度。
正如圖10和11所指出的，血漿和肝中的L-(-)-FMAU的峰濃度出現(xiàn)在大約1小時(shí)。4小時(shí)后血漿和肝中的化合物徹底被清除。實(shí)施例4 L-(-)-FMAU在BDFI雌鼠中的毒性圖13a是對照組BDFI雌鼠30天后的體重變化。圖13b和13c是BDFI雌鼠分別給10mg/kg(13b)和50mg/kg(13c)每天兩次L-(-)-FMAU30天后的體重變化。所示體重是5到7個(gè)鼠的平均體重和標(biāo)準(zhǔn)偏差。從圖13b和13c可看出，L-(-)-FMAU在超過30天后并未對鼠體重產(chǎn)生顯著的影響，這說明化合物有很好的耐受性。實(shí)施例5 L-(-)-FMAU給藥后鼠血漿臨床化學(xué)圖14-20是以10mg/kg(3個(gè)鼠)或50mg/kg(3個(gè)鼠)每天兩次給L-(-)-FMAU30天后鼠血漿的臨床化學(xué)。
圖14是鼠血漿中總膽紅素濃度用mg/dL表示的直方圖。圖15是鼠血漿中堿性磷酸酶濃度用U/L表示的直方圖?？偰懠t素和堿性磷酶是肝功能的指標(biāo)。鼠膽紅素值處在正常人范圍(少于1.2mg/dL)，而堿性磷酸酶值略高于正常人水平(30-114U/L)圖16鼠血漿中肌酸酐濃度用mg/dL表示的直方圖。肌酸酐是腎功能的指標(biāo)。除了鼠50-2之外，給藥組鼠的肌酸酐水平與對照組鼠的肌酸酐水平?jīng)]有差異。
圖17是鼠血漿中AST(SGOT血清谷草轉(zhuǎn)氨酶濃度用U/L表示的直方圖。圖18是鼠血漿中ALT(SGPT血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶)濃度用U/L表示的直方圖。SGOT和SGPT是肝功能的指標(biāo)。除了50-2鼠SGOT和SGPT均存在差異及10-2鼠只存在SGOT的差別外，給藥組鼠的酶水平與對照組的沒有差異。
圖19是鼠血漿中乳酸濃度用mmol/L表示的直方圖。圖20是鼠血漿中乳酸脫氫酶(LDH)濃度用U/L表示的直方圖。乳酸在肌肉進(jìn)行糖酯解過程中形成。乳酸脫氫酶(LDH)在不同的組織中的以不同的異構(gòu)體形式存在。乳酸脫氫酶釋放進(jìn)入而漿有可能是組織損傷的一種表現(xiàn)。給藥組鼠的乳酸和乳酸脫氫酶水平與對照組的相比沒有顯著差異。III.寡核苷酸目標(biāo)寡核苷酸序列可以通過用一種或幾種本發(fā)明公開的L-核苷酸取代寡核苷酸序列中的一種核苷酸進(jìn)行修飾。優(yōu)選的實(shí)施方案是把L-核苷酸放在寡核苷酸的一個(gè)末端上。這種修飾的寡核苷酸序列可以用于很多技術(shù)，例如反義技術(shù)。
反義技術(shù)一般指基因表達(dá)的修飾，即將一個(gè)合成的寡核苷酸與一個(gè)互補(bǔ)核酸序列進(jìn)行雜交而抑制基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制(靶序列是DNA時(shí))；翻譯(靶序列是RNA)或抑制加工過程(如果靶序列是前-RNA)。細(xì)胞的各種活性可以通過這種技術(shù)來調(diào)節(jié)。一個(gè)簡單的例子就是將反義寡核苷酸結(jié)合到信使RNA上后抑制了蛋白質(zhì)的生物合成。在另外一個(gè)方案中，我們將一個(gè)合成的寡核苷酸與雙鏈DNA上一段特定的基因序列雜交，形成的三鏈復(fù)合物能夠抑制這段特定基因序列的表達(dá)。反義寡核苷酸同時(shí)也能用于激活基因表達(dá)，這種激活作用是通過間接抑制一種天然抑制劑的生物合成來實(shí)現(xiàn)的。AOT可用于抑制致病基因的表達(dá)。比如那些加速病毒復(fù)制的基因。這些病毒包括人類免疫缺陷病毒(HIV)、B型肝炎病毒(HBV)、皰疹病毒、癌癥、特別是實(shí)體腫瘤比如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌和黑色素瘤。
一種選擇出來的寡核苷酸對于核酸酶的穩(wěn)定性是體外應(yīng)用時(shí)的一個(gè)重要因素。我們已經(jīng)知道3′-核酸外切酶的活性是降解血清中大多數(shù)未修飾的反義寡核苷酸的庫因(Vlassov，V.V.，Yakubov，L.A.，in Prospecls for Anfisense Nucleic Acid Therapy ofCancers and AIDS，1991，243-266，Wiley-Liss，Inc.，New York；Nucleis Acids Res.，1993，21，145)在我們實(shí)驗(yàn)中，這里公開的L-核苷酸能將3′-核酸外切酶對反義寡核苷酸的降解作用降至最小。
本發(fā)明的能與多聚核糖核酸或多聚脫氧核糖核酸結(jié)合的寡核苷酸能夠以常規(guī)的反義試劑同樣的作用方式用作反義試劑。一般參見AntisenseMolecular Biology and S-oligos，Synthesis 1(Oct.1988)(Synthecell Corp.，Rockville，Md.出版)；2 Discoveries inAntisense Nucleic Acids(C.Brakel and R.Fraley eds.1989)；Uhlmann et.al.，“Antisense OligonucleotidesA New TherapeuticTechnique，”Chem.Rev.90(4)，1990；and Milligan J.F.，Matteucci M.D.，Martin，J.C.，J.Med.Chem.，1993，36，1923-1937。本發(fā)明的反義試劑也許可用來構(gòu)建一種新的反義試劑，這樣的反義試劑能選擇性地與預(yù)先已確定的一段多聚脫氧核糖核酸序列或多聚核糖核酸序列或者含有這些序列的一種細(xì)胞結(jié)合(例如把反義試劑加入含有此種細(xì)胞的培養(yǎng)基中)這樣反義試劑能被細(xì)胞吸收；與預(yù)先已確定的序列結(jié)合，因此阻斷其轉(zhuǎn)錄、翻譯或有復(fù)制。選擇性地與反義試劑結(jié)合的必要條件是已知的(例如選擇性地與從類基因組結(jié)合的一段長為17個(gè)堿基的核苷酸序列)。IV.藥物組合物的制備本發(fā)明公開的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽、前藥和衍生物可用于預(yù)防和治療HBV和EBV病毒感染和其它相關(guān)的疾病例如呈抗HBV或抗EBV抗體陽性反應(yīng)的疾病及HBV或EBV陽性反應(yīng)疾病、HBV引起的慢性肝炎、肝硬化、急性肝炎、突發(fā)性肝炎、慢性持久性肝炎、疲勞等疾病。這些藥劑或化合物對于那些抗HBV、抗EBV抗體陽性反應(yīng)或HBV、EBV抗原陽性反應(yīng)的臨床病人以及有可能傳染上HBV或EBV的人們起到預(yù)防或延緩病情惡化的作用。
治療患了上述疾病中任何一種的病人，可以給他們服一定劑量的本發(fā)明所描述的、對HBV或EBV有效的一種或數(shù)種活性化合物，或者其藥學(xué)上可接受的衍生物及其鹽。使用這些藥時(shí)可隨意選擇或介質(zhì)或稀釋劑。這些活性物質(zhì)可以以任何適當(dāng)途徑服用，比如以液體或固體形式口服、消化道以外的途徑服用、靜脈注射、皮內(nèi)注射、皮下注射、表面應(yīng)用等。
這種活性化合物包含在藥學(xué)上可接受的介質(zhì)或稀釋劑里，其劑量足以在施與病人后還能起到有效的治療作用，并且對病人沒有嚴(yán)重的毒副作用。
治療上述提到的所有疾病的活性化合物優(yōu)選的劑量范圍為每天1-60mg/kg體重、1-20mg/kg更優(yōu)選。大體上給病人的劑量范圍在每天0.1到大約100mg/kg體重。藥學(xué)上可接受的衍生物的有效劑量范圍可以根據(jù)傳遞的原始核苷酸分子量來估計(jì)。如果衍生物本身就有活性，其有效劑量可以根據(jù)上述方法用衍生物分子量來估計(jì)、或者通過已知的其它方法來估計(jì)。具體用藥時(shí)，活性化合物可按照產(chǎn)品說明書或者內(nèi)科醫(yī)生用藥參考中對HIV適應(yīng)所用的3′-疊氮基-3′-脫氧胸苷(AZT)、2′，3′-雙脫氧肌苷(DDI)、2′，3′-雙脫氧胞苷(DDC)或者2′，3′-雙脫氧-2′，3′-雙脫氫胸苷(D4T)的說明來應(yīng)用。
活性化合物適合以任何劑量形態(tài)單位來應(yīng)用，包括但又并不局限在7-3000mg這一劑量范圍，優(yōu)選的是每單位劑量的活性成份是70-1400mg。通常優(yōu)選的口服劑量是50-1000mg。
理想情況應(yīng)該是用藥后活性化合物在血漿中的濃度達(dá)到一個(gè)峰值，大約是0.2-70μM，當(dāng)然1.0-10μM左右更好。這一濃度峰值可以通過比如靜脈注射0.1-5％活性成份溶液來達(dá)到，可以任意選擇含鹽的注射液，或者把活性成份做成藥丸來應(yīng)用。
活性化合物以藥學(xué)上可接受的鹽的形式提供。這里我們所用的這種鹽或混合物指的是核苷的鹽或混合物，它們能保留我們所需要的母體化合物的生物活性而且存在最小的毒理作用。這些鹽非限制性例子為(a)無機(jī)酸形成的酸加成鹽(例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等等)，還有有機(jī)酸形成的鹽，比如醋酸、乙二酸、酒石酸、丁二酸、羥基丁二酸、抗壞血酸、苯甲酸、單寧酸、雙羥萘酸、藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸以及多聚半乳糖醛酸；(b)陽離子形成的堿性鹽例如，鈉離子、鉀離子、鋅離子、鈣離子、鉍離子、鋇離子、鎂離子、鋁離子、銅離子、鈷離子、鎳離子、鎘離子、鈉離子、鉀離子等等，以及從N，N-二苯基乙二胺、氨或者乙二胺形成的有機(jī)陽離子或者(c)由(a)和(b)結(jié)合產(chǎn)生的化合物，比如單寧酸鋅鹽等等。
活性化合物的修飾，尤其是在N6位置或N4位置以及5′-O位置的修飾可以影響活性成份的生物有效性和代謝率，因此可以通過上述修飾來調(diào)節(jié)活性成份的傳送。
藥物成份中活性化合物濃度依賴于藥物的吸收、鈍化和排泄速度以及其它一些常見因素。需要特別指出的是劑量值隨要減輕的疾病的嚴(yán)重程度而不同，對于任何特殊的受治療者，要進(jìn)一步認(rèn)識到特定的劑量范圍應(yīng)根據(jù)個(gè)體需要和給藥者或監(jiān)督者的職業(yè)判斷，隨時(shí)間做調(diào)整。這里所確定的濃度范圍僅僅是一個(gè)例子，我們的目的不是想要限定所需成份的范圍?；钚猿煞菘梢砸淮?，或者在不同時(shí)間間隔分成小劑量多次給與。
口服活性化合物是一種優(yōu)選的服藥方式?？诜煞菀话惆ㄒ环N惰性稀釋劑或者一種可食用的介質(zhì)。它們可以被包容在膠囊里或者壓縮成片劑。為達(dá)到口服治療的目的，活性化合物里摻入賦形劑，做成片劑、錠劑或膠囊來使用，藥學(xué)上可接受的粘合劑或者一些輔助物質(zhì)也可以作為藥物成份的一部分。
片劑、藥丸、膠囊、錠劑等等可以包含下述成份或者具有一種與之相似特點(diǎn)的化合物的任何一種一種粘合劑比如微晶纖維素、黃蓍膠或者明膠；一種賦形劑比如淀粉、乳糖；一種分裂劑如藻酸、伯凝膠或玉蜀黍淀粉；一種潤滑劑如硬酯酸鎂或硬酯酸鹽；一種滑動劑如膠態(tài)二氧化硅；一種甜味劑如蔗糖或者糖精；或者包含一種香料如薄荷、水楊酸甲酯、或者橙色香料。當(dāng)劑量單位形態(tài)是膠囊時(shí)，除了上述種種試劑外還可以包含一種液體介質(zhì)。如脂肪族油。此外，劑量單位形態(tài)還可以包含各種其他物質(zhì)，如糖衣、蟲膠制劑或其它腸溶衣試劑，這些物質(zhì)可以修飾劑量單位的物理形態(tài)。
活性化合物或藥學(xué)上可接受的鹽及其衍生物可用作酏劑、懸浮液、糖漿、粘劑、咀嚼劑等等藥物的一個(gè)成份。除活性化合物外，糖漿還可以包含蔗糖這樣的甜味劑以及某些防腐劑、染料、顏料和香料。
活性化合物，或者藥學(xué)上可接受的衍生物及其鹽也可以和其它活性物質(zhì)混合，這些物質(zhì)必須不含削弱活性化合物的活性；或者與一些能補(bǔ)充其活性的物質(zhì)混合，例如抗生素、抗真菌藥、消炎藥，或者其它抗病毒藥，包括抗HBV、抗EBV、抗巨細(xì)胞病毒，或者抗HIV或抗EBA試劑。
經(jīng)非腸道途徑、皮內(nèi)、皮下或者表面應(yīng)用的溶液或懸浮液可以包含下述成份用于注射的無菌稀釋劑比如水、鹽溶液、凝固的油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細(xì)菌試劑如苯甲醇或羥苯甲醇甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖液如乙酸，檸檬酸或磷酸緩沖液以及一些增強(qiáng)體質(zhì)的試劑如氯化鈉或葡萄糖。含活性化合物的原始制劑可以裝在安瓿瓶里，一次性注射器或者各種各樣玻璃或塑料劑量瓶里。
如果是靜脈注射，優(yōu)選的介質(zhì)是生理鹽水或磷酸鹽緩沖液。一個(gè)更優(yōu)選的具體方案是活性化合物與介質(zhì)一起制備，這樣可以防止化合物迅速從體內(nèi)排除，比如采取一種有控制的釋放系統(tǒng)，包括植入法和包在微膠囊內(nèi)的傳送系統(tǒng)。這些介質(zhì)可以是生物可降解的又具有生物相容性的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐類，聚乙二醇酸，膠原蛋白，多聚原酸酯以及多聚乳酸。這些聚合物的制備方法對于那些內(nèi)行人來說是很普通的。這些物質(zhì)同樣也可從Alza Corporalion和Nova PharmaceulicolsInc購買。
脂質(zhì)體(包括把帶有抗病毒抗原的單克隆抗體的感染細(xì)胞作為靶向的脂質(zhì)體)懸浮液作為藥學(xué)上可接受的介質(zhì)也是比較可取的。脂質(zhì)體懸浮液可用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的方法來制備，例如美國專利號4,522,811中描述的方法(這里所引用的完全參考此專利的方法)。例如，把適當(dāng)?shù)闹?如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰卵磷脂、二十四烯酰卵磷脂，以及膽固醇)溶解在無機(jī)溶劑里，然后蒸發(fā)，容器表面留下一薄層干的脂類，將活性化合物或者衍生物的一磷酸鹽、二磷酸鹽或三磷酸鹽的水溶液加入到容器中，用手搖至脂類從表面脫離，在溶液中分散成均勻的脂質(zhì)體懸浮液。
關(guān)于本發(fā)明的優(yōu)選方案已作了敘述。對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，根據(jù)前面對本發(fā)明的詳細(xì)敘述而作出的對本發(fā)明的改變和修飾都是顯而易見的。需要指出的是所有這些改變和修飾都包括在所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.下式所示的L-核苷化合物 其中R為嘌呤或嘧啶堿基而R″為氫、酰基、烷基、單磷酸酯基、雙磷酸酯基，或三磷酸酯基。
2.權(quán)利要求1的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療EBV或HBV感染藥物中的應(yīng)用。
3.應(yīng)用于制備治療EBV或HBV感染藥物中的權(quán)利要求1的L-核苷及其藥學(xué)上可接受的鹽。
4.治療人類HBV或EBV感染的方法，其中包括施用治療HBV或EBV有效量的下式所示L-核苷 其中R為嘌呤或嘧啶堿基而R″為氫、?；?、烷基、單磷酸酯基、雙磷酸酯基，或三磷酸酯基。
5.權(quán)利要求4的方法，其中L-核苷為2′-氟-5-甲基-β-L-呋喃阿拉伯糖基尿苷。
6.權(quán)利要求1的L-核苷，為2′-氟-5-甲基-β-L-呋喃阿拉伯糖基尿苷。
7.權(quán)利要求1或3的L-核苷，選自N1-(2′-脫氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-乙基尿嘧啶，N1-(2′-脫氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘胞嘧啶，和N-(2′-脫氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶。
8.權(quán)利要求1或3的L-核苷，其中堿基選自5-甲基尿嘧啶(胸腺嘧啶)，5-碘尿嘧啶，胞嘧啶，和5-乙基尿嘧啶。
9.權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中L-核苷為2′-氟-5-甲基-β-L-呋喃阿拉伯糖基尿苷。
10.權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中L-核苷選自N1-(2′-脫氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-乙基尿嘧啶，N1-(2′-脫氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘胞嘧啶，和N1-(2′-脫氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶。
11.權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中堿基選自5-甲基尿嘧啶(胸腺嘧啶)，5-碘尿嘧啶，胞嘧啶，和5-基尿嘧啶。
12.權(quán)利要求4的方法，其中L-核苷選自N1-(2′-脫氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-乙基尿嘧啶，N1-(2′-脫氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘胞嘧啶，和N1-(2′-脫氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶。
13.權(quán)利要求4的方法，其中堿基選自5-甲基尿嘧啶(胸腺嘧啶)，5-碘尿嘧啶，胞嘧啶，和5-乙基尿嘧啶。
全文摘要
一種治療宿主，特別是人，HBV或EBV感染的方法，其中包括施用治療HBV或EBV感染有效量的式(I)L-核苷，其中R為嘌呤或嘧啶堿基。作為一個(gè)優(yōu)選方案，活性化合物為2′-氟-5-甲基-β-L-呋喃阿拉伯糖基尿苷(也稱為L-FMAU)。該化合物為低毒高效的抗HBV和EBV的抗病毒劑。其他活性化合物的特例包括N
文檔編號C07H19/19GK1143966SQ95191415
公開日1997年2月26日 申請日期1995年1月30日 優(yōu)先權(quán)日1994年1月28日
發(fā)明者C·K·朱, Y·C·程, B·S·派, G·Q·姚 申請人:佐治亞州大學(xué)研究基金會有限公司, 耶魯大學(xué)