本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，涉及一種電化學(xué)控制脫保護(hù)的方法及其應(yīng)用，尤其涉及一種在酶促ssdna合成循環(huán)中電化學(xué)控制脫保護(hù)的方法及其在陣列化酶促ssdna合成中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、酶促脫氧核糖核酸單鏈（ssdna）合成是一種基于末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal?deoxynucleotidyl?transferase，tdt酶）的新一代dna合成技術(shù)。相對(duì)于傳統(tǒng)的化學(xué)dna合成方法，酶促ssdna合成因?yàn)樗迷噭┒际巧锟山到饫没蛱烊淮嬖诘某煞?，故而更加綠色環(huán)保。且酶促ssdna合成反應(yīng)全程無(wú)需使用強(qiáng)酸性試劑，不會(huì)發(fā)生脫嘌呤等副反應(yīng)，故而具有合成更長(zhǎng)ssdna分子的潛力。

2、類似于傳統(tǒng)的化學(xué)dna合成技術(shù)，近年來(lái)所發(fā)展的酶促ssdna合成也采用了固相合成的策略以方便每一步反應(yīng)后除去可溶性雜質(zhì)，但比起化學(xué)合成所需的偶合-蓋帽-氧化-脫保護(hù)的四步反應(yīng)，一般酶促ssdna合成簡(jiǎn)化至操作更加簡(jiǎn)便的兩步反應(yīng)：1.偶合反應(yīng)：利用tdt酶將單個(gè)有終止合成功能的堿基連接于引發(fā)鏈的3’端以實(shí)現(xiàn)單堿基的偶合；2.脫保護(hù)反應(yīng)：也即3’端有終止合成功能的堿基的活化。如此兩步循環(huán)，最終完成酶促ssdna合成。如cn117126903a公開(kāi)一種酶促ssdna合成方法，所述酶促ssdna合成方法包括：將引發(fā)鏈偶聯(lián)到金屬電極表面得到固相載體；利用所述固相載體進(jìn)行合成反應(yīng)和電化學(xué)脫保護(hù)反應(yīng)；不斷重復(fù)進(jìn)行所述合成反應(yīng)與所述電化學(xué)脫保護(hù)反應(yīng)循環(huán)，合成目標(biāo)序列。

3、相比于化學(xué)合成中所用各類原料都可以利用成熟的化學(xué)工業(yè)大規(guī)模合成，酶促合成中所用的酶只能通過(guò)生物工程發(fā)酵、提取，因而合成單個(gè)堿基的偶合成本居高不下。為此，高通量的固相合成就十分必要：將成千上萬(wàn)條不同的待合成序列中有同樣堿基偶合需求的位置一起反應(yīng)，那么成本就可均攤在所有序列中，實(shí)現(xiàn)合成成本成千上萬(wàn)倍的下降，但技術(shù)難點(diǎn)在于如何同時(shí)控制活化所有有共同堿基偶合需求的序列，而且不干擾其他無(wú)需求序列的終止基團(tuán)。然而，現(xiàn)有的酶促ssdna合成技術(shù)中，（如文獻(xiàn)acs?catalysis?2022?vol.12?issue?5?pages?2988-2997中所述）脫保護(hù)一步的實(shí)現(xiàn)是通過(guò)將ssdna浸泡于含有亞硝酸鈉的酸性溶液，也即亞硝酸（hno2）溶液中，通過(guò)式（1）中的化學(xué)反應(yīng)將ssdna?3’端的氨氧基轉(zhuǎn)化為羥基，但此操作無(wú)法實(shí)現(xiàn)選擇性地脫去某一特殊序列的氨氧基保護(hù)，因而也就無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量的酶促ssdna合成。

4、???式（1）。

5、綜上所述，如何實(shí)現(xiàn)高通量酶促ssdna合成是目前亟需解決的問(wèn)題之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足和實(shí)際需求，本發(fā)明提供一種電化學(xué)控制脫保護(hù)的方法及其應(yīng)用，對(duì)脫保護(hù)反應(yīng)在時(shí)間和空間上進(jìn)行精確控制，使得ssdna鏈的延伸在且僅在指定電極附近發(fā)生，以期實(shí)現(xiàn)電化學(xué)控制的高通量酶促ssdna合成。

2、為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種電化學(xué)控制脫保護(hù)的方法，所述電化學(xué)控制脫保護(hù)的方法包括：

4、將3’端修飾有氨氧基（-onh2）的ssdna置于脫保護(hù)溶液中進(jìn)行電化學(xué)處理，通過(guò)電極反應(yīng)使所述脫保護(hù)溶液生成脫保護(hù)物質(zhì)，使ssdna3’端發(fā)生脫保護(hù)；所述脫保護(hù)溶液含有羥胺、羥胺鹽或羥胺衍生物中至少一種。

5、本發(fā)明中，設(shè)計(jì)全新的脫保護(hù)方法，通過(guò)電化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)羥胺類化合物的氧化反應(yīng)在工作電極附近產(chǎn)生脫保護(hù)物質(zhì)包括亞硝酸或氮氧正離子，再使生成的亞硝酸與電極附近的ssdna的3’端堿基上-onh2反應(yīng)生成一氧化二氮與羥基，完成脫保護(hù)反應(yīng)。與此同時(shí)，擴(kuò)散到工作電極區(qū)域以外的亞硝酸被溶液中的羥胺類化合物淬滅，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)脫保護(hù)反應(yīng)在時(shí)間和空間上進(jìn)行精確控制。

6、可以理解，本發(fā)明中基于羥胺的電化學(xué)氧化產(chǎn)生脫保護(hù)物質(zhì)，具有類似功能的羥胺相關(guān)化合物均適用于本發(fā)明。

7、可選地，所述羥胺鹽包括以nh3oh+作為正離子的離子型化合物等。

8、可選地，所述以nh3oh+作為正離子的離子型化合物包括鹽酸羥胺、硫酸羥胺、醋酸羥胺或磷酸羥胺等中至少一種。

9、可選地，所述羥胺衍生物包括甲基羥胺和/或甲基羥胺鹽等。

10、可選地，所述甲基羥胺鹽包括以menh2oh+作為正離子的離子型化合物等。

11、可選地，所述以menh2oh+作為正離子的離子型化合物包括甲基羥胺鹽酸鹽、甲基羥胺硫酸鹽、甲基羥胺磷酸鹽或甲基羥胺醋酸鹽等中至少一種。

12、可選地，所述脫保護(hù)溶液中羥胺、羥胺鹽或羥胺衍生物的濃度各自獨(dú)立為0.01~4mol/l（如0.02、0.03、0.1、0.3、0.5、1、1.5、2、2.5或3.5?mol/l等）。

13、可選地，所述脫保護(hù)溶液還含有保持溶液ph在1~5之間的緩沖成分，可以理解，本領(lǐng)域具有類似功能的緩沖成分均適用本發(fā)明，例如乙酸和硫酸鈉等。

14、可選地，所述脫保護(hù)溶液中乙酸的濃度為0~1?mol/l（例如可以是0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、0.6、0.8或0.9?mol/l等），硫酸鈉的濃度為0~1?mol/l（例如可以是0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、0.6、0.8或0.9?mol/l等）。

15、可選地，所述電化學(xué)處理的方法包括循環(huán)伏安法、方波伏安法、單電位階躍計(jì)時(shí)電流法或多步階躍電位掃描法中至少一種。

16、可選地，所述電化學(xué)處理的時(shí)間為0~120?min，但不為0，包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、20、50、80、90、100、110、115、118或119?min等。

17、可選地，所述電化學(xué)處理的電壓范圍為<2?v，包括但不限于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.1、1.2、1.5、1.8v等，優(yōu)選為0.9~1.3?v。

18、可選地，所述電化學(xué)處理在三電極體系下進(jìn)行，包括工作電極、對(duì)電極和參比電極。

19、可選地，所述工作電極和對(duì)電極各自獨(dú)立地選自鉑電極、金電極、銅電極、鈦電極、鎳電極或鈀電極中任意一種。

20、可選地，所述參比電極選自ag/agcl電極或飽和甘汞電極。

21、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述電化學(xué)控制脫保護(hù)的方法包括：

22、將3’端修飾有氨氧基的ssdna置于含有羥胺、羥胺鹽或羥胺衍生物中至少一種的脫保護(hù)溶液中，在三電極體系下進(jìn)行電化學(xué)處理，電壓范圍＜2?v，通過(guò)電極反應(yīng)使所述脫保護(hù)溶液中生成亞硝酸，使ssdna3’端發(fā)生脫保護(hù)。

23、第二方面，本發(fā)明提供第一方面所述的電化學(xué)控制脫保護(hù)的方法在酶促ssdna合成中的應(yīng)用。

24、第三方面，本發(fā)明提供一種酶促ssdna合成方法，所述酶促ssdna合成方法包括：

25、將引發(fā)鏈偶聯(lián)到固相載體表面，利用3’-onh2-dntp進(jìn)行合成反應(yīng)，利用第一方面所述的電化學(xué)控制脫保護(hù)的方法進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)，重復(fù)所述合成反應(yīng)和脫保護(hù)反應(yīng)，循環(huán)直至合成目標(biāo)序列。

26、可以理解，本發(fā)明關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)可控的脫保護(hù)過(guò)程，而具體的合成反應(yīng)過(guò)程可根據(jù)本領(lǐng)域通用方法進(jìn)行，無(wú)需特殊限制。

27、可選地，所述合成反應(yīng)具體包括：

28、將偶聯(lián)引發(fā)鏈的后的固相載體置于dna酶促合成反應(yīng)液中進(jìn)行反應(yīng)；所述dna酶促合成反應(yīng)液含有3’-onh2-dntp、tdt酶、鈷離子（co2+）、緩沖劑（如7＜ph＜8的緩沖溶液，包括pbs等）和水。

29、可選地，將引發(fā)鏈偶聯(lián)到固相載體表面進(jìn)一步包括對(duì)所述固相載體進(jìn)行活化處理后進(jìn)行引發(fā)鏈偶聯(lián)。所述活化處理包括用活化化合物對(duì)所述固相進(jìn)行處理，可以理解，本領(lǐng)域通用的活化處理方法以及偶聯(lián)方法均適用于本發(fā)明。

30、可選地，所述活化化合物包括羧基活化偶聯(lián)物以及碳二亞胺類羧基活化劑中的至少一種。可選地，所述羧基活化偶聯(lián)物包括n-羥基硫代琥珀酰亞胺鈉鹽和n-羥基琥珀酰亞胺中的至少一種?？蛇x地，所述碳二亞胺類羧基活化劑包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和二環(huán)己基碳二亞胺中的至少一種?？蛇x地，所述偶聯(lián)包括令經(jīng)過(guò)活化處理的固相載體在鏈霉親和素偶聯(lián)液中浸泡，而后再在引發(fā)鏈偶聯(lián)液中浸泡，得到偶聯(lián)后固相載體?？蛇x地，所述鏈霉親和素偶聯(lián)液包括濃度為0.5~1?mg/ml的鏈霉親和素?？蛇x地，所述引發(fā)鏈偶聯(lián)液包括濃度為的1~4?nmol/ml的引發(fā)鏈。

31、可選地，所述引發(fā)鏈包括5’端生物素標(biāo)記的dna序列。

32、可選地，所述酶促ssdna合成方法還包括對(duì)經(jīng)所述合成反應(yīng)和脫保護(hù)反應(yīng)循環(huán)后的固相載體進(jìn)行解離反應(yīng)，得到解離產(chǎn)物。

33、可選地，所述酶促ssdna合成方法還包括以所述解離產(chǎn)物為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目標(biāo)電泳條帶并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析。

34、進(jìn)一步地，在進(jìn)行所述解離反應(yīng)之前，進(jìn)一步包括：將經(jīng)所述合成反應(yīng)與電化學(xué)脫保護(hù)反應(yīng)循環(huán)后的固相載體進(jìn)行末端切割，并浸入到polya合成反應(yīng)液中進(jìn)行polya合成反應(yīng)，以令引發(fā)鏈的3’端合成polya片段；更進(jìn)一步地，所述polya合成反應(yīng)液包括無(wú)保護(hù)的datp單體、tdt酶、緩沖液以及水。

35、可選地，所述解離反應(yīng)包括：將所述合成反應(yīng)與所述脫保護(hù)反應(yīng)循環(huán)后的所述固相載體浸入到純水中，在80℃~100℃的溫度條件下反應(yīng)得到解離產(chǎn)物。

36、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

37、（1）本發(fā)明設(shè)計(jì)末端堿基脫保護(hù)方法，采用電化學(xué)控制脫保護(hù)的步驟，僅通過(guò)通/斷電即可實(shí)現(xiàn)在且僅在工作電極附近將羥胺或其衍生物氧化為亞硝酸，實(shí)現(xiàn)對(duì)堿基保護(hù)基的脫保護(hù)，使得在時(shí)間和空間上精確控制脫保護(hù)反應(yīng)簡(jiǎn)單易行；

38、（2）本發(fā)明的末端堿基脫保護(hù)方法，在進(jìn)行羥胺或其衍生物的電化學(xué)氧化為亞硝酸時(shí)，所生成的亞硝酸可以被電解液本體中大量的羥胺類化合物淬滅生成一氧化二氮，此淬滅反應(yīng)可以有效抑制脫保護(hù)活性物質(zhì)（亞硝酸）的擴(kuò)散，確保電化學(xué)控制的脫保護(hù)僅于工作電極加電期間、在工作電極附近有較高亞硝酸濃度的區(qū)域發(fā)生，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)脫保護(hù)反應(yīng)在時(shí)間和空間上的精確控制，使得dna鏈的延伸在且僅在指定電極附近發(fā)生；

39、（3）本發(fā)明通過(guò)控制加電方式、加電時(shí)間、脫保護(hù)試劑及其濃度，能夠有效抑制電化學(xué)生成亞硝酸過(guò)程中的副反應(yīng)（如ph升/降以及生成一氧化氮、二氧化氮、硝酸根等），提高電化學(xué)脫保護(hù)的效率；

40、（4）本發(fā)明可將工作電極由單一電極轉(zhuǎn)換為在二維平面或三維空間排布的電極陣列，通過(guò)選擇性控制各電極開(kāi)關(guān)，即能實(shí)現(xiàn)僅在導(dǎo)通電極附近對(duì)dna鏈延伸，也即實(shí)現(xiàn)高通量的酶促ssdna合成。