生產(chǎn)血小板的射流裝置的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于從巨核細(xì)胞或其片段的懸液生產(chǎn)血小板的射流裝置，其包含生產(chǎn)室，所述生產(chǎn)室包含至少一個通道，其中引導(dǎo)巨核細(xì)胞懸液從其進(jìn)口流至其出口；其中所述通道在其內(nèi)表面的至少一部分構(gòu)造成具有多個障礙物。本發(fā)明還涉及用如上定義的射流裝置從巨核細(xì)胞生產(chǎn)血小板的離體方法。
【專利說明】
生產(chǎn)血小板的射流裝置
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及從巨核細(xì)胞或其片段生產(chǎn)血小板的改進(jìn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 血小板是抑制出血關(guān)鍵的小的無核細(xì)胞。存在許多血小板生廣或功能雙損的臨床 疾病，且需要血小板輸液的患者越來越多。目前，解決辦法是進(jìn)行從供血者獲得的血小板的 輸液。用于治療學(xué)應(yīng)用的離體血小板生產(chǎn)是吸引人的選擇，但仍然是主要的技術(shù)挑戰(zhàn)。
[0003] 血小板來源于巨核細(xì)胞。巨核細(xì)胞分化是其特征在于順序步驟的連續(xù)過程。盡管 巨核細(xì)胞分化發(fā)生于骨髓中，血小板生產(chǎn)要求巨核細(xì)胞片段通入骨髓血管。已經(jīng)嘗試設(shè)計 尤其致力于血小板生產(chǎn)的生物反應(yīng)器。
[0004] 國際專利申請W0 2010/06382311公開了從成熟巨核細(xì)胞通過使成熟巨核細(xì)胞懸 液在涂有血管性血友病因子(VWF)的固相上經(jīng)歷剪切率為至少600S-1的流動而生產(chǎn)血小板 的離體方法。剪切率影響在Dunois-Lard自等的科學(xué)論文（"Exposure of human megakaryocytes to high shear rates accelerates platelet production''，Blood, vol. 114,n°9,p. 1875-1883,2009)中進(jìn)一步討論。然而，產(chǎn)量仍需要改善，W用于可能的治 療學(xué)應(yīng)用。
[0005] -些出版物提議使用設(shè)計為再生天然骨髓環(huán)境的3D系統(tǒng)（參見Pallotta等， "Three-Dimensional System for the In Vitro Study of Megakaryocytes and Functional Platelet Production Using Silk-Based Vascular Tubes",Tissue Engineering:化rt C,vol.17,n。12,p.1223-1232,2011,和Sullenbarger等，"Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds" .Experimental Hematology ,vol. 37,n° 1 ,p. 101-110,2009)。在運(yùn)些系統(tǒng)中，細(xì) 胞片段從其中植入細(xì)胞的支架通過孔隙或管自由遷移進(jìn)入流動通道。此外，Nakagawa等 ("Two differential flows in a bioreactor promoted platelet generation from human pluripotent stem cell-derived megakaryocytes".Experimental Hematology, 2013vol.41，n°8p742-748,2013)最近公開了兩種新的模擬微血管的用于血小板生產(chǎn)的生 物反應(yīng)器。它們包含能夠捕獲巨核細(xì)胞的多孔結(jié)構(gòu)或狹縫。施加壓力流W確保巨核細(xì)胞的 固定。此外，將主流垂直施加于壓力流或在壓流和主流之間具有60°的角度。所述主流將剪 切應(yīng)力施加于捕獲的巨核細(xì)胞。然而，主流仍然不含巨核細(xì)胞。巨核細(xì)胞片段經(jīng)歷主流且釋 放的血小板在主流出口處收集。Thon等（《Platelet bioreactor-on-a-chip》，Blood, vol 124，n°12pl857-1867,2014)描述了基于彼此平行、通過用狹縫刺穿的壁分離的進(jìn)料通道和 主通道流的另一種生物反應(yīng)器。當(dāng)進(jìn)料通道末端關(guān)閉時，巨核細(xì)胞被推過狹縫。在那里，它 們與主流接觸并經(jīng)歷剪切應(yīng)力。在運(yùn)種系統(tǒng)中，巨核細(xì)胞可獲得的位點(diǎn)數(shù)是有限的，且許多 細(xì)胞停留在儲庫中，而最初的巨核細(xì)胞伸長并釋放血小板。運(yùn)限制了血小板生產(chǎn)過程的速 度。運(yùn)些系統(tǒng)的幾何形狀對于快速大規(guī)模的生產(chǎn)效率不高。此外，獲得的產(chǎn)量仍不夠，運(yùn)是 使得血小板功能性表征變得困難的事實(shí)。此外，在幾小時或幾天內(nèi)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)具有很少評 估的內(nèi)在血小板脫落。
[0006] 已經(jīng)公開了具有具體結(jié)構(gòu)的微射流裝置用于不同的生物學(xué)應(yīng)用。例如，Stott等 ("Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chi護(hù)，PNAS，vol. 107，n° 43，p. 18392-18397，2010)描述了使用其內(nèi)表面涂有 抗體的微射流裝置來分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞。內(nèi)表面中形成凹槽，W便破壞通道內(nèi)的層流流線， 并增加抗體涂層裝置中細(xì)胞-表面相互作用的數(shù)目。類似地，Chang等（"Biomimetic technique for 曰dhesion-b曰sed collection 曰nd sep曰r曰tion of cells in 曰 microfluidic channel" ,Lab 化ip,vol.5,p.64-73,2005)教導(dǎo)了使用包含微柱陣列的微 射流通道來分離和收集細(xì)胞。然而，與本發(fā)明相反，運(yùn)種微射流裝置的目的不是引發(fā)血小板 從巨核細(xì)胞脫落。
[0007] 因此本發(fā)明的一個目的是提供用于從包含巨核細(xì)胞或其片段的細(xì)胞懸液生產(chǎn)血 小板的射流裝置，尤其適用于高產(chǎn)量生產(chǎn)，同時保持新產(chǎn)生的血小板的功能質(zhì)量。本發(fā)明的 另一個目的是提供適于大規(guī)模生產(chǎn)高質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化的血小板的用于生產(chǎn)血小板的方法。 [000引發(fā)明簡述
[0009] 在一個方面，本發(fā)明設(shè)及用于從巨核細(xì)胞懸液(5)生產(chǎn)血小板的射流裝置（1)，包 含：
[0010] -生產(chǎn)室(3)，包含至少一個通道(8)，其中可W引導(dǎo)包含巨核細(xì)胞或其片段的細(xì)胞 懸液從其進(jìn)口（ 9)流至其出口（ 10);
[0011 ]-任選的流速控制器(7)，用于控審幡道(8)中所述懸液的流動；
[0012] -任選的巨核細(xì)胞分煉器和/或混合器(2)，用于富集含巨核細(xì)胞的懸液并均質(zhì)化 所述巨核細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度，其位于生產(chǎn)室(3)的上游；
[0013] -生產(chǎn)室（3)下游的任選的血小板分煉器(4)，用于通過從巨核細(xì)胞或其他細(xì)胞殘 余物分煉血小板來純化流出懸液(6);
[0014] 其中至少一部分(11)所述通道(8)的壁的內(nèi)表面構(gòu)造成具有多個障礙物。
[0015] 在相關(guān)方面，本發(fā)明設(shè)及用于從包含巨核細(xì)胞或其片段的細(xì)胞懸液生產(chǎn)血小板的 射流裝置，包含：
[0016] -生產(chǎn)室（3)，包含通過非多孔壁定界的至少一個通道(8)和在通道的一端的至少 一個進(jìn)口孔(9)和在通道的另一端的至少一個出口孔（10)，其中可W將包含巨核細(xì)胞或其 片段的懸液引入進(jìn)口孔(9)，和其中可W在出口孔(10)收集血小板；
[0017]-任選的流速控制器(7)，用于控審幡道(8)中所述懸液的流動；
[0018] -任選的巨核細(xì)胞分煉器和/或混合器(2)，用于富集含巨核細(xì)胞的懸液并均質(zhì)化 所述巨核細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度，其位于生產(chǎn)室(3)的上游；
[0019] -生產(chǎn)室（3)下游的任選的血小板分煉器(4)，用于通過從巨核細(xì)胞或其他細(xì)胞殘 余物分煉血小板來純化流出懸液(6);
[0020] 其中至少一部分(11)所述通道(8)的壁的內(nèi)表面構(gòu)造成具有多個障礙物。
[0021] 在具體的實(shí)施方式中，所述多個障礙物分布在二維空間表面，從而形成障礙物的 Ξ維陣列。
[0022] 另一方面，本發(fā)明設(shè)及從巨核細(xì)胞或其片段生產(chǎn)血小板的離體方法，所述方法包 含：
[0023] -將包含巨核細(xì)胞或其片段的細(xì)胞懸液引入如上定義的射流裝置；
[0024] -在生產(chǎn)室的通道中使所述懸液在適于巨核細(xì)胞的延伸、破碎和血小板釋放的剪 切率下流動;和
[00巧]-收集通道出口處的血小板。
[00%] 發(fā)明詳述
[0027] 現(xiàn)在將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。在W下描述中，應(yīng)理解表達(dá)是指所確定的值的范 圍，包括下限和上限。
[0028] 本發(fā)明設(shè)及從巨核細(xì)胞或其片段的懸液生產(chǎn)血小板的射流裝置。
[0029] 如本文所使用，術(shù)語"血小板"是指導(dǎo)致血塊形成的初期止血的細(xì)胞機(jī)理中設(shè)及的 無核細(xì)胞。
[0030] 如本文所使用，術(shù)語"前血小板"是指巨核細(xì)胞或其片段的任何結(jié)構(gòu)形式，例如可 導(dǎo)致血小板形成的細(xì)胞質(zhì)連接的血小板樣顆粒。所述結(jié)構(gòu)形式包括但不限于具有長的細(xì)胞 質(zhì)延伸、突出或偽足的細(xì)胞，所述延伸、突出或偽足包含涵蓋各形成階段的血小板體的膨 脹，例如節(jié)結(jié)、珠子等。
[0031] 如本文所使用，術(shù)語"巨核細(xì)胞"是指負(fù)責(zé)生產(chǎn)正常止血所需的血小板的骨髓細(xì) 胞。巨核細(xì)胞來源于局限于巨核細(xì)胞譜系的造血祖細(xì)胞。巨核細(xì)胞生產(chǎn)的初始信號是促血 小板生成素或TPOdTPO是誘導(dǎo)骨髓中祖細(xì)胞分化成最終巨核細(xì)胞表型所必需的。巨核細(xì)胞 分化的其他分子信號包括例如GM-CSF、比-3、化-6、比-11、Flt-3配體和SCF。巨核細(xì)胞祖細(xì) 胞可W通過體外培養(yǎng)獲得。
[0032] 通常，巨核細(xì)胞懸液包含懸浮于適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)基中的巨核細(xì)胞群。在一個實(shí)施 方式中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基是補(bǔ)充有BIT血清替代物、α-單硫代甘油和脂質(zhì)體的Iscove's Modified Dulbecco's Medi皿(IMDM)。懸液可W進(jìn)一步包含巨核細(xì)胞片段或前血小板。
[0033] 在一個具體的實(shí)施方式中，成熟巨核細(xì)胞懸液優(yōu)選通過W下步驟獲得：
[0034] (i)提供巨核細(xì)胞祖細(xì)胞；
[0035] (ii)培養(yǎng)擴(kuò)增所述巨核細(xì)胞祖細(xì)胞；
[0036] (i i i)將所述擴(kuò)增的細(xì)胞分化成巨核細(xì)胞。
[0037] 巨核細(xì)胞祖細(xì)胞例如選自造血干細(xì)胞(例如，來自廝帶、外周血或骨髓）、或選自胚 胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的干細(xì)胞。
[0038] 在一些實(shí)施方式中，盡管懸液中的大多數(shù)細(xì)胞可能是巨核細(xì)胞，可W在運(yùn)種懸液 中發(fā)現(xiàn)少量其他細(xì)胞或細(xì)胞殘余物，包括但不限于，巨核細(xì)胞祖細(xì)胞、細(xì)胞質(zhì)片段和前血小 板。因此，在一個實(shí)施方式中，用于根據(jù)本發(fā)明的裝置或方法的包含巨核細(xì)胞的細(xì)胞懸液進(jìn) 一步包含巨核細(xì)胞片段，尤其是前血小板或血小板。例如，大多數(shù)包含巨核細(xì)胞的細(xì)胞可W 在它們的膜上表達(dá)CD41和CD42b抗原。
[0039] 從祖細(xì)胞或干細(xì)胞生產(chǎn)巨核細(xì)胞的細(xì)節(jié)可見于例如"Balduini A，Pallotta I， Malara A,Lova P,Pecci A,Viarengo G,Balduini CL,Torti M.Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes.J Thromb Haemost.2008:6:1900-7."或叮akayama N,Nishimura S,Nakamura S, Shimizu T,Ohnishi R,Endo H,Yamaguchi T,0tsu M,Nishimura K, Nakanishi M,Sawaguchi A,Nagai R,Takahashi K,Yamanaka S,Nakauchi H,Eto Κ.Transient activation of c-MYC expression is critical for efficient platelet generation from human induced pluripotent stem cells .The Journal of Experimental Medicine · 2010; 207:2817-30，' D
[0040] 在一個實(shí)施方式中，引入所述裝置流動的巨核細(xì)胞懸液W103-108個/mL，優(yōu)選lO 5- 5.106個/mL的細(xì)胞濃度存在。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明的射流裝置包含至少一個生產(chǎn)室，所述生產(chǎn)室包含至少一個具有至少 兩個孔的通道，所述孔可進(jìn)一步描述為通道的進(jìn)口和出口。通道使得巨核細(xì)胞或其片段的 懸液可W從其進(jìn)口流到其出口。優(yōu)選地，通道具有一個進(jìn)口和一個出口且可將主流施加于 巨核細(xì)胞懸液W從所述進(jìn)口流到所述出口。
[0042] 在具體的實(shí)施方式中，可W進(jìn)一步將生產(chǎn)室分成若干個平行通道，它們中的每一 個通過非多孔壁定界，其中可W在室的一端的至少一個進(jìn)口孔(9)引入包含巨核細(xì)胞的細(xì) 胞懸液，和可W在室的另一端的至少一個出口孔（10)收集血小板，所述通道形成從其進(jìn)口 到其出口的單一流。
[0043] 如本發(fā)明所使用，術(shù)語"非多孔"是指巨核細(xì)胞或其片段(包括血小板或前血小板） 不能跨越壁，因此留在通道進(jìn)口到出口的主流中。
[0044] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，為了 W高產(chǎn)率生產(chǎn)血小板，射流裝置的通道必須在其至少一部分的 內(nèi)表面，即在至少一部分旨在與巨核細(xì)胞懸液接觸的通道壁的表面上構(gòu)造紋理。所述紋理 通過多個障礙物產(chǎn)生。優(yōu)選地，所述障礙物分布于通道的至少一個2維表面上，從而形成障 礙物的3維陣列。由于所述障礙物，通道內(nèi)表面不光滑。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流過具有紋理的通道 時，巨核細(xì)胞在具有紋理的表面上的捕獲和其脫落成血小板得到改進(jìn)。通常，所述通道的至 少一部分內(nèi)表面構(gòu)造成具有至少一個障礙物的Ξ維陣列，其中所述障礙物分布在通道的至 少一個表面上W改變相鄰流線之間的距離，從而允許在障礙物表面上和/或通道的內(nèi)表面 上捕獲流動的巨核細(xì)胞并將它們暴露于剪切，W誘導(dǎo)血小板脫落。將巨核細(xì)胞暴露于通過 具有紋理的通道的流而產(chǎn)生的血小板表現(xiàn)出類似于循環(huán)血小板的一些功能性的方面。在微 射流裝置中產(chǎn)生的血小板可能不同于血小板樣顆粒。運(yùn)些血小板樣顆?？蒞不通過微射流 忍片形成且不完全是功能性的。尤其是，在具體的實(shí)施方式中，在本發(fā)明裝置中產(chǎn)生的血小 板可W被激活，如天然血小板或循環(huán)血小板，運(yùn)與不能激活的血小板樣顆粒相反。
[0045] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，通道內(nèi)表面具有紋理的部分可進(jìn)一步涂有對巨核細(xì) 胞具有結(jié)合親合力的配體，例如血管性血友病因子(VWF)或其功能性變體。運(yùn)種配體可對血 小板和/或巨核細(xì)胞或其特異性受體具有特異性親合力，或?qū)ρ“搴?或巨核細(xì)胞具有非 特異性親合力。運(yùn)種涂層增加細(xì)胞對通道內(nèi)壁或障礙物的粘附。
[0046] 如本文所使用，術(shù)語"血管性血友病因子"或"VWF"是指設(shè)及止血的由若干單體組 成的多聚體蛋白。人血管性血友病因子的示例性氨基酸序列可在GenPept數(shù)據(jù)庫W登錄號 AAB59458找到。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的血管性血友病因子是哺乳動物血管性血友病因子，更 優(yōu)選是鼠因子或靈長類動物因子，甚至更優(yōu)選人血管性血友病因子。術(shù)語"VWF"涵蓋任何哺 乳動物來源的VWF，例如靈長類動物VWF，優(yōu)選人VWF。根據(jù)本發(fā)明，VWF因子可W是重組VWF或 天然VWF。在其天然形式，其可W被純化或可W包含于包含其他組分的組合物中（例如在胞 外基質(zhì)中）。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可W根據(jù)本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)容易地生產(chǎn)運(yùn)種重組VWF，例如利 用能生產(chǎn)所述重組VWF或其功能性變體的轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。
[0047]如本文所使用，術(shù)語VWF的"功能性變體"是指VWF因子的天然或重組片段，或保留 結(jié)合GP扣，尤其是人GPIb的能力的VWF的同源物或類似物。
[004引 VWF的同源物是具有與人VWF氨基酸序列共有至少50 %同一性，優(yōu)選至少60 %、 70%、80%、90%和95%同一性的氨基酸序列的多膚。
[0049] 如本文所使用，兩個序列之間的百分比同一性是序列共有的相同位置數(shù)的函數(shù) (即，％同一性=相同位置#/位置總100)，考慮需要被引入W最佳比對兩個序列的空位 數(shù)和各空位長度。兩個序列之間的序列比較和百分比同一性的測度可W利用如下所述的數(shù) 學(xué)算法完成。
[0050] 兩個氨基酸序列之間的百分比同一性可W利用已并入ALIGN程序的E.Myers和 W.Miller的算法(Comput.Appl .Biosci .4:1 1-17,1988)來測定。此外，兩個氨基酸序列之 間的百分比同一性可W利用已并入GCG軟件包中的GAP程序的Need 1 eman和WunSch (J.Mol.Biol.48:443-453,1970)算法來測定。測定百分比同一性的又一個程序是化USTAL (Μ.Larkin等，Bioinformatics 23:2947-2948,2007;first described by D.Higgins and P.Sha巧，Gene 73 :237-244,1988)，其可作為單獨(dú)程序或經(jīng)由網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器獲得（參見< http://www.clustal.org/>)〇
[0051] 變體進(jìn)一步包括包含與異源多膚序列融合的VWF因子的片段的多膚或融合蛋白， 所述異源多膚序列不是天然連接至所述VWF。其他變體包括VWF結(jié)構(gòu)域的多聚體形式，其中 所述VWF結(jié)構(gòu)域是對GPIb具有親合力的那些VWF片段。
[0052] 如本發(fā)明所使用，術(shù)語"片段"包括給定多膚的至少5個、優(yōu)選至少10個或至少20個 連續(xù)氨基酸的天然或重組的部分氨基酸序列。
[0053] 可用于涂覆本發(fā)明裝置的VWF變體的實(shí)例包括但不限于，重組VWF-AU氨基酸 Q1238-P1471)多膚，其可在大腸桿菌中表達(dá)，或重組VWF-A1A2A3(氨基酸D1261-G1874)多 膚，其可在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)并如Mart in, C.，Morales，L.D.和Cruz, M.A. (2007)， Journal of Thrombosis and Haemostasis,5:1363-1370.doi:10.1111/j.1538- 7836.2007.02536. X之前所描述的純化。
[0054] 或者，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W選擇VWF類似物，即不與VWF-級氨基酸序列共有序列 同源性，但表現(xiàn)出與巨核細(xì)胞和/或血小板結(jié)合親合力類似性質(zhì)的蛋白或多膚。運(yùn)種類似物 可選自但不限于纖維蛋白原、纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原蛋白和肌腫蛋白。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明的射流裝置的通道可W通過其進(jìn)口和其出口之間的長度L來限定。通 道橫截面(優(yōu)選在通道的整個長度上相同）可W是圓形、卵形、長方形或正方形。如本文所使 用，通道高度Η是指通道截面中兩個相對的壁之間測量的最小距離。例如，在圓形截面中，通 道高度Η是通道圓形截面的直徑。根據(jù)一個優(yōu)選的實(shí)施方式，所述通道可具有基本上正方形 或長方形截面，其中底壁和頂壁決定通道高度Η，和側(cè)壁決定通道寬度W。通道優(yōu)選是直的且 直通道的軸限定通道的縱向。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，射流裝置是微射流裝置，即裝置的橫截面尺寸之一 小于1毫米。通道可W稱為微通道。
[0057] 關(guān)于通道尺寸，運(yùn)些可W根據(jù)可用于血小板生產(chǎn)的巨核細(xì)胞的平均尺寸來優(yōu)化。 貫穿說明書稱為化HS的運(yùn)種參數(shù)定義為用于本發(fā)明方法的懸液中巨核細(xì)胞的平均直徑，且 可W通過不同技術(shù)測量，如阻抗細(xì)胞計數(shù)檢測(例如美國專利2,656,508描述的庫爾特計數(shù) 器)或光學(xué)顯微術(shù)和隨后的圖像分析。
[005引取決于所使用的前體細(xì)胞來源和巨核細(xì)胞生產(chǎn)方法，化瞞通常為扣m-150皿，例如7 μπι-100μπι，和例如10-50μπι。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明裝置的化雕優(yōu)化的尺寸選自W下尺 寸：15μηι、20μηι、25μηι、30μηι、35μηι、40μηι 和 45μηι。
[0059] 在具體的實(shí)施方式中，通道的高度Η可W為路賄-1mm，優(yōu)選Da?-100ym。通道寬度W可 W為化碰-Im，優(yōu)選10址§碰-1cm。通道長度L可W為1mm-lOm，優(yōu)選lOmm-lm，更優(yōu)選lOcm-lm。
[0060] 本發(fā)明射流通道的生產(chǎn)室可W包含不同或相同的單個通道或多個通道。當(dāng)使用多 個通道時，平行化通道共有相同的流進(jìn)口（16)和流出口（17)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實(shí) 施方式，生產(chǎn)室可W包含多個平行化通道。生產(chǎn)室中通道數(shù)N可W為2-1，000,000,優(yōu)選2- 100,000。
[0061 ]當(dāng)使用平行化通道時，生產(chǎn)室優(yōu)選進(jìn)一步包含分配通道，其將進(jìn)口懸液分配到每 個通道。分配通道可為Ξ角形。有利地，分配通道的形狀使得它避免用過高剪切率破壞細(xì) 胞，例如通過使其高度高于平行化通道中所使用的高度。
[0062] 通道的內(nèi)表面在至少一部分具有紋理。所述通道的紋理部分的長度可W為通道長 度L的1 % -通道長度L的100 %，優(yōu)選為通道長度L的50 % -通道長度L的100 %。
[0063] 紋理通過多個障礙物產(chǎn)生?？蒞確定所述障礙物的密度、尺寸和形狀W便在障礙 物和/或通道內(nèi)壁的表面上捕獲巨核細(xì)胞，從而進(jìn)一步血小板脫落。
[0064] 如本文所使用，術(shù)語"捕獲"是指巨核細(xì)胞接觸障礙物和/或內(nèi)通道的表面并且較 之流動的平均速度大幅減速。接觸障礙物表面后，巨核細(xì)胞可能停止。
[0065] 障礙物例如可W具有桿形、柱形、束形、月牙形、刺穿的月牙形、星形、空腔形或金 字塔形。優(yōu)選地，障礙物是桿或束。桿形可優(yōu)選具有正方形或圓形或Ξ角形橫截面，且其可 W通過半徑r和高度h定義。如本文所使用，桿的"半徑"定義為桿橫截面的最大尺寸的一半。 束可W優(yōu)選具有長方形或正方形橫截面，且其可W通過長度1束=W、寬度W束二化和高度h定 義。
[0066] 關(guān)于桿的尺寸:桿的高度h可W優(yōu)選為0-H，更優(yōu)選為化雕/2至化-D細(xì)6/2)。桿的半徑 r可W優(yōu)選為化醜/100至100址細(xì)6,更優(yōu)選為化醜/10至10址細(xì)6。化雕通常為5-150μπι，桿的高度h 可W優(yōu)選為0-lmm。桿的半徑?？蒞優(yōu)選為50nm-15mm，更優(yōu)選為500nm-l. 5mm。
[0067] 關(guān)于束的尺寸:束的高度h可W優(yōu)選為0-H，更優(yōu)選為化雕/2至化-D細(xì)fi/2)。束的寬度 化可W優(yōu)選為化醜/10至100址細(xì)6,更優(yōu)選為化雕至10址細(xì)6。化雕通常為5-150皿，束的高度h可 W優(yōu)選為0-lmm。
[006引束的寬度化可W優(yōu)選為500nm-l 5mm，更優(yōu)選為如m-1.5mm。
[0069] 障礙物可W隨機(jī)放置于通道內(nèi)表面或根據(jù)具體的圖案放置。因此，紋理可W是不 規(guī)則或規(guī)則的。規(guī)則圖案可W通過一些特征來表征，如其周期性結(jié)構(gòu)、晶格間距和相對于通 道縱向的晶格方向的傾斜。如果圖案是不規(guī)則的，其可通過障礙物的密度或通過障礙物之 間的平均距離來表征。
[0070] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，障礙物可W布置在至少一部分通道的內(nèi)表面W形成 規(guī)則圖案。
[0071] 根據(jù)另一個實(shí)施方式，障礙物密度可W沿著通道改變。
[0072] 根據(jù)一個具體的實(shí)施方式，障礙物是具有半徑為r的基本上圓形截面桿，且所述桿 布置在至少一部分所述通道的內(nèi)表面上w形成具有六邊形的周期性結(jié)構(gòu)的規(guī)則圖案，例 如：
[0073] (i)兩個桿中屯、之間的最近距離P為至少等于2r，優(yōu)選（2r+D細(xì)胞/10)至（2" 100曲纖），更優(yōu)選（2r+D§碰)至（化+10曲纖）；
[0074] (ii)角度α，其是通過通道縱向和六邊形的周期性結(jié)構(gòu)的原始細(xì)胞的晶格矢量之 一來定義的最低角度例如是：
[0077] (iii)任選所述桿的高度h為如0<h《H，優(yōu)選化醜/2<h《化-化醜/2)，其中Η是通道高 度。
[0078] 在一個具體的實(shí)施方式中，障礙物是具有半徑為r的基本上圓形截面的桿（12)，且 所述桿布置在至少一部分所述通道的內(nèi)表面上W形成具有六邊形的周期性結(jié)構(gòu)的規(guī)則圖 案，例如：
[0079] (i)桿的半徑r優(yōu)選為50nm-15mm，更優(yōu)選500nm-l .5mm;
[0080] (ii)兩個桿中屯、之間的最近距離p為至少等于lOOnm，優(yōu)選100nm-50mm，更優(yōu)選 500nm-10mm，甚至更優(yōu)選如m-lmm;
[0081] (iii)角度α，其是通過通道(14)縱向和六邊形布拉維晶格的晶格矢量之一定義的 最低角度例如α為0-90°，優(yōu)選0-30%
[0082] (iv)任選所述桿的高度h為如0<h《H，其中Η是指通道截面中兩個相對的壁之間測 量的最小距離。
[0083] 射流裝置可優(yōu)選根據(jù)微射流系統(tǒng)的已知制造技術(shù)來制造，例如通過軟光刻技術(shù) (Xia等.1998."Soft lithography".Annual Review of Materials Science.vol.28,n°1, p.153-184)。
[0084] 具有至少部分帶紋理的通道的正突起(positive relief)的裝置的主體(master) 可通過常規(guī)方法制備：一種方法可W從包含通道設(shè)計的計算機(jī)輔助的設(shè)計文件產(chǎn)生透明 片。然后，運(yùn)些透明片可用作掩模將圖案轉(zhuǎn)移入負(fù)性光刻膠W形成主體。
[0085] 射流裝置可由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成并密封在載玻片上。該材料對于所述裝 置的視覺控制是有利的。然而，其他材料如娃、玻璃、聚苯乙締、聚碳酸醋、聚氯乙締、環(huán)狀締 控共聚物、聚（甲基丙締酸甲醋）、熱固性聚醋、聚氨醋甲基丙締酸醋、Norland光學(xué)粘合劑、 水凝膠(例如藻酸鹽、膠原蛋白、瓊膠糖、聚丙締酷胺、多糖)可用于制造射流裝置。
[0086] 有利地，射流裝置和更具體地生產(chǎn)室允許在無菌條件下工作。在優(yōu)選的實(shí)施方式 中，所述射流裝置是無菌的。生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明射流裝置的方法可W包含將裝置滅菌的步驟。 滅菌步驟可W發(fā)生在密封裝置之前或之后。
[0087] 此外，生產(chǎn)方法可W包含用對于巨核細(xì)胞具有結(jié)合親合力的配體，例如血管性血 友病因子(VWF)或其功能性變體涂覆通道內(nèi)表面的至少具有紋理的部分的步驟。在具體的 實(shí)施方式中，通道內(nèi)表面通過用血管性血友病因子或其功能性變體的溶液解育來涂覆。通 常用于涂覆固相的VWF的濃度為5-100yg/mL。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，VWF的濃度為20-4化g/ mL。在一個實(shí)施方式中，通道內(nèi)表面涂覆有選自下組的VWF的功能性變體:在大腸桿菌或在 哺乳動物細(xì)胞中W單體或二聚多膚表達(dá)的重組野生VWF或突變VWF多膚。
[0088] 除生產(chǎn)室之外，根據(jù)本發(fā)明的射流裝置可W包含任選的裝置例如：
[0089] -流速控制器，用于控制通道中所述懸液的流動；
[0090] -任選的巨核細(xì)胞分煉器和/或混合器，用于富集含巨核細(xì)胞的懸液并均質(zhì)化所述 巨核細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度，其位于生產(chǎn)室的上游；
[0091] -生產(chǎn)室下游的任選的血小板分煉器，用于通過從巨核細(xì)胞或其他細(xì)胞殘余物分 煉血小板來純化流出懸液；
[0092] 流速控制器可位于通道上W控制流速，優(yōu)選在通道進(jìn)口處或通道出口處。該裝置 可任選與累連接，所述累使得巨核細(xì)胞懸液流入射流裝置。
[0093] 生產(chǎn)室上游使用巨核細(xì)胞分煉器可W有利地獲得在細(xì)胞群方面均勻的懸液和為 血小板的工業(yè)生產(chǎn)獲得一致的產(chǎn)量和質(zhì)量。尤其是，巨核細(xì)胞分煉器包括將巨核細(xì)胞與血 小板和其他細(xì)胞殘余物分離的裝置?？墒褂萌缦滤鲇糜谘“寮?xì)胞分煉器的常規(guī)細(xì)胞分 煉器。尤其是，使用巨核細(xì)胞分煉器允許獲得巨核細(xì)胞富集的細(xì)胞懸液，即，懸液中至少 50%，優(yōu)選至少70%、80%、95%或約100%的細(xì)胞是巨核細(xì)胞。
[0094] 使用混合器可W進(jìn)一步有利地確保進(jìn)入射流裝置的生產(chǎn)室的懸液的良好均勻性， 尤其是如果生產(chǎn)室包含若干個通道。細(xì)胞混合器可W例如是Stroock等公開的類型 ("Chaotic Mixer for Microchannels",Science,νο?.295,n°5555,ρ.647-651,2002)。 [OOM]在生產(chǎn)室的出口，流出物包含所生產(chǎn)的血小板，但其可進(jìn)一步包含裸核和/或完整 的巨核細(xì)胞。因此將用于分離所生產(chǎn)的血小板的裝置有利地放置在生產(chǎn)室的下游?？蒞使 用常規(guī)的細(xì)胞分煉器裝置，例如適合于微射流技術(shù)或大體積如分離技術(shù)的那些。血小板分 煉器可選自交叉流過濾裝置、基于層流的細(xì)胞分煉器、介電電泳活化的細(xì)胞分煉器、基于光 學(xué)力的細(xì)胞分煉器、基于磁力的細(xì)胞分煉器、基于聲學(xué)力的細(xì)胞分煉器和基于慣性力的細(xì) 胞分煉器。在基于層流的細(xì)胞分煉器中，裝置可W是基于壓流分饋技術(shù)的細(xì)胞分煉器，如 Takagi等戶片公開（"Continuous particle separation in a microchannel having 曰symmetric曰lly 曰rr曰nged multiple br曰nches"，L曰b Chip,vol.5,n°7,p.778,2005)，或 基于確定性橫向位移的細(xì)胞分煉器，如L. R. Huang等所描述（"Continuous Particle Separation through Deterministic Lateral Displacement".Science,304,987,2004)。
[0096] 本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)及從巨核細(xì)胞或其片段生產(chǎn)血小板的離體方法。所述方法通過使 用根據(jù)W上公開的本發(fā)明射流裝置來進(jìn)行。因此上述公開的射流裝置的所有具體特征和實(shí) 施方式是方法的特征和實(shí)施方式。
[0097] 首先，方法包含將巨核細(xì)胞或其片段的懸液引入根據(jù)本發(fā)明的射流裝置的步驟。 所述懸液可產(chǎn)生并通過任選與流速控制器連接的累控制。通常，生產(chǎn)室的各通道定義單一 流，允許巨核細(xì)胞或其片段的懸液從其進(jìn)口流過生產(chǎn)室到其出口。因此，物流方向從通道進(jìn) 口到通道出口。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，將物流引入射流裝置是連續(xù)的。
[0098] 如上所公開，巨核細(xì)胞懸液可W是從供體分離或通過祖細(xì)胞分化獲得的懸液，所 述祖細(xì)胞例如選自造血干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。
[0099] 在射流裝置中，將巨核細(xì)胞或其片段的懸液引入生產(chǎn)室。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，在 進(jìn)入生產(chǎn)室之前，將所述懸液用細(xì)胞分煉器分煉和/或均質(zhì)化。均質(zhì)化可W在生產(chǎn)室上游的 混合器中進(jìn)行。然后，將巨核細(xì)胞或其片段的懸液引至生產(chǎn)室中的一個或多個通道的進(jìn)口 處。
[0100] 將其引入后，在生產(chǎn)室的通道中使巨核細(xì)胞或其片段的懸液在適于巨核細(xì)胞的延 伸、破碎和血小板釋放的剪切率下流動。
[0101] 如本文所使用，術(shù)語"壁剪切率'(ig是指用于表征物流與通道表面、障礙物或巨 核細(xì)胞的相互作用的參數(shù)
[0102] 壁剪切率iv在任何局部表面元件處定義。具體的表面元件可被定義為法向矢量S 和與表面相切的矢量為擬及局部方向中的流體速度妄，只要是平面直角坐標(biāo)系。然后 穿9? 通過一定義壁剪切率。剪切率的SI測量單位是S-1。 巧巧
[0103] 壁剪切率的值將由于障礙物的尺寸、形狀和位置而局部變化。因此，在根據(jù)本發(fā)明 的裝置的具有紋理部分的通道中，使巨核細(xì)胞或其片段的懸液在最小值和最大 之間改變的剪切率下家流動。
[0104] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，流速可W固定在能夠?qū)⒕哂屑y理部分的通道中的所 述巨核細(xì)胞經(jīng)歷0到最大值，優(yōu)選不超過30,000s^優(yōu)選ΙΟ,ΟΟΟεΛ更優(yōu)選8,000s^哺 甚至更優(yōu)選5, OOOs^的壁剪切率f。、的值的范圍內(nèi)。
[0105] 對于給定的通道幾何形態(tài)、懸液液相參數(shù)和流速，根據(jù)本發(fā)明的裝置的具有紋理 部分的通道中的剪切率可W利用有限元素法通過數(shù)字計算。
[0106] 比較起來，在人循環(huán)中，壁剪切率從最大靜脈中的30-40S-1至微循環(huán)中的5000S-1 變化。
[0107] 在通道出口，收集的懸液包含所生產(chǎn)的血小板。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，通道出口 收集的懸液可W進(jìn)一步包含裸核和/或完整的巨核細(xì)胞。因此，方法可進(jìn)一步包含從所述懸 液純化、富集或分離血小板的步驟。此外，可W在通道出口處分煉出所述血小板。分煉可W 用上文公開的生產(chǎn)室下游的細(xì)胞分煉器進(jìn)行。例如，分煉可通過選自W下的方法來進(jìn)行:交 叉流過濾、基于層流的分煉、基于介電電泳的分煉、基于光學(xué)力的分煉、基于磁力的分煉、基 于聲學(xué)力的分煉或基于慣性力的分煉。
[0108] 有利地，本發(fā)明射流裝置可高產(chǎn)量同時保持新產(chǎn)生血小板的功能質(zhì)量的方式 從巨核細(xì)胞懸液生產(chǎn)血小板。
[0109] 通過所述方法獲得的血小板可用于制備藥物組合物，例如用于治療血小板計數(shù)減 少病癥，尤其是血小板缺乏和血小板病。例如，可向患有血小板生產(chǎn)病癥的受試者輸注有效 量的通過本發(fā)明方法獲得的血小板。
[0110] 此外，本發(fā)明用于生產(chǎn)血小板的方法適于大規(guī)模生產(chǎn)高質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化的血小板。 因此，所生產(chǎn)的血小板可用于診斷目的。它們可用作血小板功能標(biāo)準(zhǔn)化的正常對照。事實(shí) 上，血小板功能檢測要求來自正常個體和感染個體的天然功能性條件下的新鮮血小板。血 小板功能檢測的標(biāo)準(zhǔn)化要求實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該對每批所進(jìn)行的血小板功能檢測進(jìn)行正常對照。然 而通過靜脈穿刺術(shù)連續(xù)定期的采血引起若干健康問題和倫理問題。有利地，通過本發(fā)明方 法獲得的血小板可用作測量血小板功能的體外診斷測試中的陽性對照。
【附圖說明】
[0111] 將根據(jù)僅W說明性目的提供的W下非限制性實(shí)施例連同附圖進(jìn)一步理解本發(fā)明， 其中：
[0112] 圖1是根據(jù)本發(fā)明血小板生產(chǎn)射流裝置的一個實(shí)施方式的流程圖。
[0113] 圖2闡明了本發(fā)明射流裝置的生產(chǎn)室的一個實(shí)施方式。
[0114] 圖3用示意圖表示具有桿形障礙物的具有紋理的表面。圖3.a是透視圖。圖3.b是頂 視圖。圖3. C是剖視圖。
[0115] 圖4用示意圖表示具有束形障礙物的具有紋理的表面。圖4.a是透視圖。圖4.b是頂 視圖。圖4. C是剖視圖。
[0116] 圖5表示實(shí)施例中使用的Ξ種不同的通道幾何形態(tài)：圖5.a的"通道幾何形態(tài)Γ、圖 5.b的"通道幾何形態(tài)2"和圖5. C的"通道幾何形態(tài)3"。
[0117] 圖6.a是實(shí)施例中所使用的平行化通道上游的細(xì)胞分配的頂視圖和圖6.b是實(shí)施 例中所使用的平行化通道上游的細(xì)胞分配的剖視圖。
[0118] 圖7是代表具有紋理的表面對捕獲巨核細(xì)胞的作用的圖?？胀?、圓對應(yīng)于非紋理通 道中粘附的巨核細(xì)胞的密度0,而實(shí)屯、圓對應(yīng)于虛線之間具有紋理的通道中粘附的巨核細(xì) 胞的密度0。紋理對應(yīng)于通過r=15μm、p = 85μm、H=34μm和h = 20皿定義的幾何形狀。X軸表 示從通道進(jìn)口的距離。該圖像在實(shí)驗(yàn)開始后50min記錄。
[0119] 圖8闡明了 VWF對捕獲細(xì)胞的作用。（a)用VWF(實(shí)屯、圓）和BSA(空屯、圓）表面涂覆通 道選擇性進(jìn)行的八個不同實(shí)驗(yàn)中粘附的巨核細(xì)胞的表面密度OdX軸表示從通道進(jìn)口的距 離。灌注50min后進(jìn)行各實(shí)驗(yàn)的計數(shù)?；疑珔^(qū)域表示微通道的紋理部分。（b)當(dāng)使用VWF涂覆 的微通道時灌注50min后表面的典型圖像。（C)當(dāng)使用BSA涂覆的微通道時灌注50min后表面 的典型圖像。比例尺是80皿。
[0120] 圖9是闡明塊密度(plot density)在幾何形狀1中對粘附的巨核細(xì)胞的表面密度 的作用的圖像，其中r等于15皿。不同的通道分別用P等于120皿、85μηι和60μηι形成圖案。最后 的通道是陰性測試。圖像在實(shí)驗(yàn)50min后拍攝。當(dāng)將Ρ降低到某一闊值時，我們觀察到巨核細(xì) 胞明顯的聚集，如P = 60]im的本實(shí)施例中的情況。比例尺是1 OOjim。
[0121] 圖10是闡明巨核細(xì)胞對桿陣列的不同性能的圖像。（a)在桿的平坦表面上從平流 到移位捕獲巨核細(xì)胞。順序顯示兩種不同的時標(biāo)和輸送性能。從0ms到3ms，巨核細(xì)胞通過流 動平流輸送，產(chǎn)生幾 mm.的速度。從14ms到1431ms，巨核細(xì)胞在桿的平坦表面上移位，產(chǎn)生 幾皿的速度。（b)在桿的圓形表面上捕獲巨核細(xì)胞。順序顯示兩種不同的輸送性能：從 0ms到3ms，巨核細(xì)胞平流輸送至桿，然后從7ms到1823ms在桿圓形表面上移位，最終從 2111msW平流釋放。（C)通過桿的平坦表面捕獲巨核細(xì)胞，并捕獲于其右側(cè)。我們觀察到從 4s到978s巨核細(xì)胞的延伸，形成像線上的珠的結(jié)構(gòu)。比例尺是30]im。
[0122] 圖11是闡明成熟巨核細(xì)胞的延伸和破碎的圖像。時間蒙太奇顯示捕獲的正在經(jīng)歷 延伸結(jié)構(gòu)的Ξ次破裂的具有像線上的珠的結(jié)構(gòu)的巨核細(xì)胞。各白色箭頭顯示將W平流釋放 的延伸的部分，因?yàn)樗谙旅鎴D像上消失。比例尺是30WI1。
[0123] 圖12是闡明血小板釋放細(xì)節(jié)的圖像。時間蒙太奇顯示捕獲的具有延伸的像線上的 珠方面的巨核細(xì)胞。破裂發(fā)生在8.5ms-9ms。巨核細(xì)胞仍然是捕獲的（左側(cè))和釋放的前血小 板被流動牽引。比例尺是20]im。
[0124] 圖13a和b是闡明從延伸的巨核細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)血小板的實(shí)施例的圖像，所述巨核 細(xì)胞同時被捕獲于大量桿上。圖像闡明使得血小板從成熟巨核細(xì)胞脫落過程的二維平行化 的單一通道的細(xì)節(jié)，所述巨核細(xì)胞源自（a)廝帶血造血干細(xì)胞和(b)外周血造血干細(xì)胞。注 意較長的延伸覆蓋在后一種情況中的整個觀察視野。比例尺是100μπι。圖13c和d表示微射流 裝置中血小板生產(chǎn)的定量評價。微射流裝置VS對照中在2小時期間從源自（C)廝帶血造血干 細(xì)胞和(d)外周血造血干細(xì)胞的成熟巨核細(xì)胞生產(chǎn)血小板的比較。在該實(shí)驗(yàn)中，巨核細(xì)胞懸 液在閉環(huán)循環(huán)中通過管道循環(huán)入五個平行的微射流忍片(微射流裝置）。對照巨核細(xì)胞在沒 有微射流忍片的閉環(huán)循環(huán)中通過管道循環(huán)(對照）。血小板濃度通過在血細(xì)胞計數(shù)器中計數(shù) 而獲得。（C)提供微射流裝置(黑條)vs對照(淡灰條)在實(shí)驗(yàn)開始時(普通條，t = 0min)和在 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時（陰影線條，t=120min)的平均值±SEM(n = 5)。利用Student t檢測對微射流裝 置VS對照中血小板濃度的成對樣品進(jìn)行統(tǒng)計分析，t = 120min時獲得的P值表示顯著差異 (***p<0.005)"(d).提供微射流裝置(黑條)vs對照(n = l)(淡灰條)在實(shí)驗(yàn)開始時(普通條， t = 0min)和在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時（陰影線條，t = 120min)的平均值±561(11 = 3)。
[0125] 圖14是微射流裝置中生產(chǎn)的血小板與缺少微射流忍片的對照系統(tǒng)中獲得的那些 相比的流式細(xì)胞儀分析的圖像，如圖13的圖例中詳細(xì)描寫。
[0126] (a)血小板受體的單一顏色流式細(xì)胞儀分析，表明微射流裝置(黑條)vs對照(淡灰 條）中生產(chǎn)的血小板表面上CD61、CD42b和CD49b受體的數(shù)目。提供平均值±SEM(n = 3)，利用 S化dent t檢測對微射流裝置VS對照中不成對樣品進(jìn)行統(tǒng)計分析比較受體數(shù)目。CD4化柱狀 圖的星號表示顯著差異(P<〇.05)。
[0127] (b)血小板受體的兩種顏色流式細(xì)胞儀分析，表明微射流裝置中生產(chǎn)的CD41 + CD42b+血小板群體VS對照中的背景值。
[0128] (C和d)血小板受體的兩種顏色流式細(xì)胞儀分析，其中用或不用刺激人PAR-1凝血 酶受體(TRAP)的激動劑膚S化LR腳舌化CD41 /CD61受體。在圖14. C中，柱狀圖表明了在血小板 和CD42b+口內(nèi)，在微射流裝置(黑條)和對照（淡灰條）中生產(chǎn)的血小板在TRAP活化之前(普 通條)或之后（陰影線條）的PAC-1陽性單元％。提供平均值±SEM(n = 6)，利用Student t檢 測對不成對樣品進(jìn)行統(tǒng)計分析比較非刺激血小板vs TRAP-刺激的血小板。P值的星號表示 在微射流裝置中，但并非在對照中生產(chǎn)的血小板在TRAP活化之前或之后PAC-1陽性單元％ 之間的顯著差異(P<〇.05)。圖14.d顯示血小板口內(nèi)的相應(yīng)點(diǎn)圖，表明在微射流裝置（左圖） 和對照（右圖）中生產(chǎn)的非刺激(上圖）和TRAP-刺激樣品（下圖）中的PACrCD4化+血小板群。 注意在缺少對照的微射流裝置中生產(chǎn)的TRAP-刺激的血小板中PACrCD4化+群的移動。
[0129] 圖15是顯示在微射流裝置中生產(chǎn)的血小板與在缺少微射流忍片的對照系統(tǒng)中獲 得的那些相比的粘附和聚集的顯微圖像，如圖13.C的圖例中詳細(xì)描寫。
[0130] (a)在不存在(頂圖）或存在凝血酶(底圖）的情況下在通過射流裝置(左圖）或?qū)φ?(右圖）生產(chǎn)的樣品中用抗微管蛋白抗體間接免疫巧光標(biāo)記（用第二AlexaFluor488抗小鼠 抗體顯影和AlexaFluor546鬼筆環(huán)膚進(jìn)行F-肌動蛋白染色）。用Axio Observer顯微鏡 (26133)^40^.6-倍放大率用91(：1^4斗-化1?-12數(shù)字〇：0照相機(jī)(9成像)獲取圖像。在射流 裝置出口處收集的樣品中觀察到表示未活化的血小板的特征的環(huán)狀微管蛋白染色(上左）， 而從對照收集的樣品中回收不含環(huán)狀微管蛋白染色的較大片段(上右）。在射流裝置出口處 收集的樣品中觀察到表示活化的血小板的特征的肌動蛋白應(yīng)力纖維(下左），而從對照收集 的樣品中回收不含組織化應(yīng)力纖維染色的較大元件(下右）。比例尺是如m。
[0131] (b)在不存在(上圖）或存在（下圖）通過模擬人PAR-1凝血酶受體TRAP-1的激動劑 膚S化LR腳舌化的情況下在射流裝置(上左）出口處和從對照（右）收集的樣品中回收的血小 板或元件的掃描電子顯微圖像。各條件包括粘附牛血清白蛋白或纖維蛋白原。比例尺是扣 m"(c)在纖維蛋白原和化C12存在下的聚集。用模擬人PAR-1凝血酶受體TRAP-1的激動劑膚 S化LR腳舌化之前(上圖）或之后（下圖）觀察到血小板聚集。在射流裝置出口處收集的樣品中 可見大的聚集體(下左圖）。在對照樣品中回收的片段在激動劑膚的存在下沒有聚集(下右 圖）。比例尺是10皿。
[0132] 圖16包括顯示引入微射流混合器的成熟巨核細(xì)胞懸液的圖像。（a)在微混合器進(jìn) 口處拍攝的400副圖像的重疊。細(xì)胞W平流方式從左至右流過X方向且相對于y軸聚焦。（b) 在微混合器出口處拍攝的400副圖像的重疊。細(xì)胞流在y方向是均質(zhì)的。（C)混合器中成熟巨 核細(xì)胞的軌跡。間隔為1ms的200副連續(xù)圖像的重疊。比例尺是1 OOwii。
[0133] 圖17顯示細(xì)胞分煉器的兩個實(shí)施例。圖17. a是顯示通過壓流分饋法分煉血小板的 圖像。進(jìn)口細(xì)胞懸液由固定血小板和DAMI細(xì)胞組成。將混合物引入通道（1)。將不含細(xì)胞的 緩沖液引入通道(2)。從通道(3)中回收血小板和從通道(4)中回收DAMI細(xì)胞。圖像是間隔為 1ms的30副連續(xù)圖象的重疊，W顯示不同的細(xì)胞軌跡。比例尺是200μηι。圖17.b是顯示通過確 定性橫向位移分煉血小板的圖像。進(jìn)口細(xì)胞懸液由固定血小板和DAMI細(xì)胞組成。將混合物 從進(jìn)口處引入并在出口處分煉(顯示于圖像上）：將DAMI細(xì)胞偏離并在中央出口巧）中分煉， 而血小板不偏離并在側(cè)向出口（6)上分煉。圖像是間隔為0.3ms的485副連續(xù)圖像的重疊 ，W 顯示不同的細(xì)胞軌跡。比例尺是lOOwn。
[0134] 在圖1中，射流裝置1用示意圖表示。射流裝置1由側(cè)向細(xì)胞混合器2、生產(chǎn)室3和細(xì) 胞分煉器4串聯(lián)組成。將巨核細(xì)胞懸液5引入射流裝置1。收集流出懸液6。在流入懸液5和流 出懸液6之間實(shí)施流速控制器7。流速可W通過壓差或流速源，例如開放系統(tǒng)中的注射器累、 閉合環(huán)路系統(tǒng)中的蠕動累(未顯示)來施加。
[0135] 圖2更更詳細(xì)地展示射流裝置的生產(chǎn)室3。生產(chǎn)室3包含具有兩個孔9、10的一個通 道8:用于引入巨核細(xì)胞懸液5的一個進(jìn)口 9和用于收集流出懸液6的一個出口 10。通道的縱 向用箭頭14表示。通道8具有長度L、寬度W和高度H。根據(jù)本發(fā)明，通道8在其內(nèi)表面的至少一 部分11處具有紋理。
[0136] 表面的紋理通過多個置于至少一部分通道的內(nèi)表面的障礙物產(chǎn)生。
[0137] 根據(jù)一個優(yōu)選的實(shí)施方式，障礙物是桿且如圖3所示安排。桿12位于一個通道壁13 的內(nèi)表面。各桿12具有半徑為r的基本上圓形的截面，和布置所述桿W形成具有六邊形的周 期性結(jié)構(gòu)的規(guī)則圖案。兩個桿中屯、之間的最近距離用P表示。角度α是通道的縱向14和六邊 形的周期性結(jié)構(gòu)的原始細(xì)胞的晶格矢量之一定義的最低角度。桿的高度用h表示，其例如是 0<h《H，其中Η是通道高度。
[0138] 根據(jù)另一個優(yōu)選的實(shí)施方式，障礙物是束且如圖4所示安排。束15位于一個通道壁 13的內(nèi)表面。各束15具有高度為h和寬度為化的基本上長方形的截面。束的長度等于通道寬 度W的長度。束放置為垂直于通道的縱向14。兩個束中屯、之間的最近距離用P表示。束的高度 用h表示，其例如是0<h《H，其中Η是通道高度。
【具體實(shí)施方式】
[0139] 材料和方法
[0140] CD34+細(xì)胞的培養(yǎng)和分化
[0141 ] 將CD34+細(xì)胞通過之前報告的免疫磁性技術(shù)(Miltenyi Biotec，Paris，F(xiàn)rance)從 人月齊帶血（UCB)或外周血分離（參見？0；[則111古-如33 33(3等/前0古(311/061古3431容1131；!_打容 inhibits human megakaryocytic terminal differentiation，'，Blood，vol.116，η°25， p. 5670-5678,2010)。根據(jù)Helsinki聲明在知情同意和經(jīng)我們的學(xué)會倫理委員會批準(zhǔn)后獲 得這些血樣D將CD34+細(xì)胞在37"C下在5%C02中在由Iscove modified Dulbecco medium (IMDM;G;LbcoInvitrogen，Saint-Aubin，F(xiàn)rance)組成的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基補(bǔ) 充有15%BIT 9500血清替代物（Stem Cells Technologies,Grenoble,化31106)、0-單硫代 甘油（Sigma-Al虹ich，Saint-QuentinFallavier，F(xiàn)'rance)和脂質(zhì)體（5葬脂醜基-膽堿、膽固 醇和油酸；SigmaAldi'ich)。在第0天將人重組干細(xì)胞因子（SCF, lOng/mL;Miltenyi Biotec) 和促血小板生成素版激動劑AF13948(TP0,50nM)(參見Dunois-Lard旨等，"E邱osureof human megakaryocytes to high shear rates accelerates platelet production，，， 6100(1，￥01.114，11°9,9.1875-1883,2009)添加至培養(yǎng)基，然后在第7天添加不含5〔尸的20禮 TPO。將培養(yǎng)12-14天后獲得的成熟UCB巨核細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中稀釋至0.7-1.2xl06mL的濃 度，因此比之前報告的實(shí)驗(yàn)少濃縮大約10倍。發(fā)現(xiàn)測量的平均直徑化HS是12.5+/-1.7皿。就 在暴露于剪切之前去除培養(yǎng)期間形成的血小板的通過BSA梯度根據(jù)(Robert A，Codin V， Gamier A,Pineault N.Megakaryocyte and platelet production from human cord blood stem cells.Methods Mol Biol.2012;788:219-47)報告的方法來進(jìn)行。然后將濃度 調(diào)節(jié)至200 000個巨核細(xì)胞/mL。除非另有說明，結(jié)果為源自UCB CD34+的巨核細(xì)胞。
[01創(chuàng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)
[0143] 將成熟巨核細(xì)胞懸液引入固定于W至少3(K)rpm旋轉(zhuǎn)的軌道混合器（IKA MS3基本 型)上的25cm2燒瓶(Corning，USA)中。軌道混合器用于保持懸液中細(xì)胞濃度的均勻性。燒瓶 中巨核細(xì)胞濃度范圍為至少lOOmL-i且不能超過10xl06mL-i。
[0144] 可通過不同組分用許多方法控制物流:例如差壓控制器、注射累和蠕動累。當(dāng)使用 差壓控制器時，將氣壓進(jìn)口和懸液出口密封插入燒瓶軟木塞。通過壓力控制器(MFCS-4C, Fluigent S.A. ,France)將氣壓施加于燒瓶。將燒瓶與具有聚酸酬酸(P邸K)管（Upchurch Scientific，USA)的微射流忍片的進(jìn)口連接。可使用其他管(Tygon R-1000，Saint-Gobain， France,PT陽 tubing,Saint Gobain,France for instance)。在出口收集懸液。當(dāng)使用蠕 動累(Reglojsmatec, Switzerland)時，進(jìn)口和出口管到達(dá)同一個旋轉(zhuǎn)的燒瓶。可在微射流 元件的上游或下游塞住蠕動累。還可W通過注射累(P皿2000,化rvard apparatus, US)引 入巨核細(xì)胞懸液。
[0145] Ξ個微射流元件串聯(lián)實(shí)施：巨核細(xì)胞分煉器和/或上游側(cè)向細(xì)胞混合器、血小板生 產(chǎn)通道和下游細(xì)胞分煉器，如圖1所示。細(xì)胞混合器和細(xì)胞分煉器是任選的。
[01W 裝置制造
[0147]微射流元件根據(jù)軟光刻技術(shù)快速成型制造 (Xia等.1998. "Soft lithography" ? Annual Review of Materials Science.vol.28,n°l,p.153-184)。首先，從包含微通道設(shè) 計的計算機(jī)輔助設(shè)計文件制造透明片。運(yùn)些透明片用作掩模通過常規(guī)的照相平版印刷術(shù)將 圖案轉(zhuǎn)移入負(fù)性光刻膠(SU-8 2000和3000系列，Microchem，US)，產(chǎn)生具有微通道正突起的 主體。兩個通道均由模制的聚二甲基硅氧烷(PDMS, Sy 1 gard, Dow Corning, USA)制成，密封 于載玻片上?；旌螾DMS預(yù)聚物和固化劑并脫氣。將混合物倒在主體上，在70°C固化化，切成 單個忍片，打進(jìn)口和出口孔。用異丙醇清潔載玻片并干燥。PDMS單個結(jié)構(gòu)和載玻片均在氧等 離子體烘箱中處理，然后密封。
[014引血小板生產(chǎn)通道
[0149] 具有紋理的表面通過通道壁(玻璃或PDMS)上的3D圖案來定義。運(yùn)里我們提出運(yùn)些 可能的圖案的兩個實(shí)例：（〇xy)平面上的六角形圓盤陣列和(Ox)方向上的1D束陣列。那些圖 案的幾何形狀描述于圖3和圖4。桿陣列的設(shè)計通過Ξ個參數(shù)定義：圓盤半徑r、兩個圓盤中 屯、之間的距離P W及進(jìn)口的物流方向和通過兩個柱中屯、定義的方向之間的角度α。在本文我 們用于實(shí)驗(yàn)的幾何形狀中，α通過W下標(biāo)準(zhǔn)定義：sina = r/p。該標(biāo)準(zhǔn)幾何上暗示著，一旦投 影在垂直于初始物流方向的軸上，兩個相鄰的圓盤中屯、通過一個半徑分離。用實(shí)驗(yàn)方法，r 為15皿-20皿和P為60μηι-120皿。圖3. C和圖4. C顯示(0巧)平面上的障礙物(束或桿）。通道的 高度和障礙物的高度分別通過Η和h來定義。用實(shí)驗(yàn)方法，參數(shù)h/H為0.22(小桿)和1(完整的 柱)。
[0150] Ξ種不同的通道幾何形態(tài)用于該實(shí)施例，闡明于圖5. a、圖5. b和圖5. C:
[0151] -第一個，所謂的"通道幾何形態(tài)Γ，用于測量通道紋理對于巨核細(xì)胞捕獲的影響。 它由8個平行通道組成：6個具有紋理的通道和兩個光滑通道。從x = 0mm(進(jìn)口）到x = 20mm (部分1)所有通道是光滑的。圖案遵循參數(shù)r = 15皿、H= 36皿、h/H = 0.55?？趯τ诓煌木哂?紋理的通道是變化的：ρ = 60μπι(2個通道）、ρ = 85μπι(2個通道)和ρ = 120μπι(2個通道）。通過 改變不同Ρ參數(shù)的具有紋理的長度使得所有的流體阻力相等。對于ρ = 8扣m，在通道的20- 22mm之間構(gòu)造紋理且在22-40mm之間保持光滑。
[0152] -第二個，所謂的"通道幾何形態(tài)2"，用于測量蛋白質(zhì)表面涂層效應(yīng)和紋理效應(yīng)。它 由8個平行通道組成。所有通道的長度均為四厘米且僅在第一和第Ξ厘米之間構(gòu)造紋理。通 道幾何形態(tài)2用參數(shù)r = 15皿、H=36皿、h/H=0.55和p = 85皿組成圖案。
[0153] -第Ξ個，所謂的"通道幾何形態(tài)3"，用于利用障礙物效果使血小板生產(chǎn)過程平行 化。它由8個蛇形平行通道組成（顯示為圖5.C中的塊狀物）。所有通道的長度均為17.3cm且 在通道的直線部分(代表77%的總長度)上構(gòu)造紋理。通道幾何形態(tài)3用參數(shù)r=15ym、H=52 4111、11/^=巧化=8541]1組成圖案。
[0154] 剪切率
[0155] 我們在通道壁上定義了表面元件，不管在玻璃或PDMS(包括PDMS障礙物)上。在該 表面元件上，我們通過垂直于它的矢量寇定義平面的單位矢量。測定與表面相切且在流體 速度V的局部方向的單位矢量品W使得(某滯)是平面直角坐標(biāo)系。然后通過^定義壁 涅巧. 剪切率(S-1)。壁剪切率通過裝置中的流速和裝置的幾何形狀來控制。整個射流系統(tǒng)的水動 阻力通過在進(jìn)口和出口之間施加壓差、借助于壓力控制器和通過測量由此產(chǎn)生的流速來表 征（Flowell,Fluigent,France)。 郵]影像顯微鏡系統(tǒng)
[0157] 將微射流忍片設(shè)置在倒置顯微鏡（DMI6000B，Leica Microsystems GmbH, Germany)平臺上。用計算機(jī)輔助的機(jī)動化平臺控制器記錄沿著通道長度的位置。我們記錄 了觀測視野位置和隨著實(shí)驗(yàn)時間它們之間的交替錄像。用微分干設(shè)差鏡頭記錄10X-40X之 間的影片和圖像。用CMOS高速照相機(jī)(化steam SA3,陸otron,USA)W〇.5到1500化的頻率記 錄圖像。
[0158] 從記錄的通道圖像人工計數(shù)表面粘附細(xì)胞，當(dāng)樣品成塊時，用血細(xì)胞計數(shù)器和庫 爾特計數(shù)器(Scepter II，Mi 11 ipore，US)計數(shù)懸液中的細(xì)胞。
[0159] 蛋白質(zhì)表面處理
[0160] 血管性血友病因子（VWF)是Laboratoirel·化n^aisdu fractionnement et des Biotechnologies的禮物。將它W40yg.mL-i稀釋于不含巧離子和儀離子的憐酸鹽緩沖鹽水 (PBSKLonza，Belgium)，并灌注于密封的微通道中。我們僅在血小板生產(chǎn)通道中使用該表 面涂層。
[0161] 將牛血清白蛋白（Sigma-Al化ich La ￥6巧;[116'63,化曰]1。6)^4〇4邑.111[1稀釋于憐 酸鹽緩沖鹽水(PBS)中并灌注于微通道中。
[0162] 對于兩種蛋白質(zhì)處理，忍片的進(jìn)口和出口通過蓋玻片覆蓋。將忍片在4°C解育過夜 并在實(shí)驗(yàn)前用PBS洗涂。玻璃和PDMS上的VWF吸附通過巧光標(biāo)記來證實(shí)，所述巧光標(biāo)記使用 第一多克隆兔抗VWF抗體(Dako，10yg.mL-i)和第二Alexa fluor 546多克隆山羊抗兔抗體。 [01創(chuàng)細(xì)胞混合器
[0164] 混合器的設(shè)計直接產(chǎn)生自Stroock等公開的微通道的無序混合器的人字形結(jié)構(gòu) ("Chaotic Mixer for Microchannels",Science,νο?.295,n°5555,ρ.647-651,2002)?？?慮到Stroock等的參數(shù)，細(xì)胞混合器設(shè)計Wh = 50ym、w = 300ym、a = 1、p = 2/3或1/3和q = 0.63μηι制備。
[01化]血小板生產(chǎn)通道的平行化
[0166] 期望流入裝置的巨核細(xì)胞流速高W增加血小板生產(chǎn)數(shù)。對于給定的障礙物圖案和 通道高度，可通過增加通道寬度來增加細(xì)胞流速。PDMS通道的機(jī)械限制利用最大的寬度與 高度之比W避免通道塌陷，我們平行化通道W增加有效寬度。
[0167] 通過管將巨核細(xì)胞引入血小板生產(chǎn)通道。將細(xì)胞通過Ξ角形進(jìn)口分配到平行通道 中，所述進(jìn)口使細(xì)胞到達(dá)每個通道（圖6)。對于給定的通道高度，壁剪切率與通道寬度成反 比。因此，壁剪切率在靠近進(jìn)口壁處比在平行化通道進(jìn)口之前高得多。
[0168] 為避免施加可能破壞細(xì)胞的壁剪切率，用高于平行化剪切通道中使用的高度制造 分配通道。運(yùn)兩個高度之比通常為2-20。
[01~]血小板分煉
[0170]可W通過從血小板生產(chǎn)通道中串聯(lián)分煉流出懸液來將裸核和完整的巨核細(xì)胞從 血小板中去除，如圖1所示。運(yùn)可W用微射流技術(shù)進(jìn)行。大體積也可考慮析離技術(shù)。我們提供 使用壓流分饋技術(shù)（Τ曰k曰邑i等，（'Continuous p曰rticle sep曰ration in曰microch曰nnel having asymmetrically arranged multiple branches"，Lab Chip,vol.5,n°7,p.778, 2005)和確定性橫向位移化.R.Huang等."Continuous Particle Separation through Deterministic Lateral Displacement" ,Science,304,987,2004)分煉血小板的兩個實(shí)施 例。對于壓流分饋技術(shù)，用寬度為50μπι的壓段來制造裝置(圖17)。細(xì)胞懸液由多聚甲醒固定 的血小板（來自全血）和DAMI細(xì)胞（巨核細(xì)胞細(xì)胞系，Greenberg等.1988. ('Characterization of a new megakaryocytic cell line: the Dami cell，'.Blood.72: 1968-1977)組成。圖17.a顯示可利用該技術(shù)將DAMI細(xì)胞和血小板在不同的出口分支中分 饋。確定性橫向位移(DLD)是基于通過微米級障礙物的周期陣列的層流的被動的結(jié)構(gòu)依賴 性粒徑分離方法。DAMI細(xì)胞和固定的血小板的混合物基于最初由L.R.化ang等.（Science, 304,987(2004))描述和由K丄outherback等.（AIP Advances 2,042107(2012))開發(fā)的裝置 來分煉。該裝置由一個進(jìn)口、球形的桿陣列和兩個出口（中央和側(cè)向的）組成。在圖17.b上， 裝置長度為5cm，寬度為3mm和高度為40皿。桿直徑為85皿且桿之間的距離為15皿。桿行移位 形成0.05弧度的角度。表面涂覆有BSA涂層。將DAMI細(xì)胞偏離并在中央出口（6)中分煉，而血 小板不偏離并在側(cè)向出口（5)上分煉。裝置提供100%的血小板純度和80%的血小板回收 率。圖像是通過0.3ms分離的485副連續(xù)圖像的重疊，W顯示不同的細(xì)胞軌跡。比例尺是10化 ΓΠ 〇
[0171] 收集的血小板的表征
[0172] 將幾何形狀3的微射流裝置中的血小板生產(chǎn)與由不存在微射流忍片的管道組成的 對照樣品相比。用流式細(xì)胞儀抓巧光激活的細(xì)胞分煉器(FACS)Calibur(BD Biosciences， Le化nt de Claix，F(xiàn)rance)表征CD41和CD42抗原的表達(dá)。用異硫氯酸巧光素(FITC)-結(jié)合 的抗人CD41(aIIb)和R-藻紅蛋白（PE)-結(jié)合的抗人CD42b(GPIba)(兩者均來自Beckman Coulter, Villepinte ,France)和FITC-結(jié)合的抗人活化的日1化63(808;[03。16]1。6 3)在22"€ 解育血小板 15分鐘。用FITC小鼠 IgGi(Beckman Coulter)、陽小鼠 IgGi(Beckman Coulter)進(jìn) 行對照。用GP篩選分析(Bio巧tex,Marseille ,France)進(jìn)行血小板受體的單色流式細(xì)胞儀 分析?；谛?zhǔn)的珠標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過將巧光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為每個血小板結(jié)合的單克隆抗體的相 應(yīng)數(shù)目來測定抗原性位點(diǎn)數(shù)。如在上文引用的Dunois-Lard自的出版物中之前報告的進(jìn)行纖 維蛋白原粘附分析和外巧光表征，除了活化是在凝血酶或PAR-1凝血酶受體的激動劑膚存 在的情況下獲得。用高分辨率生物成像平臺化MCCD MGi Plus Qimaging Rolera camera, Roper Scientific,Ενιτ,France)分析在494nm和522nm(分別為吸收和發(fā)射）的外巧光。通 過在涂有2%BSA或纖維蛋白原(0.2mg/ml)的載玻片上添加血小板來進(jìn)行30min的掃描電子 顯微術(shù)。之后，將一滴包含肥陽8 5〇1111化(：1、135111]\1化2+、2111]\1?。42%和戊二醒4%的溶液添 加到載玻片上用于血小板固定，然后將載玻片在包含相同溶液的浴中解育過夜。次日，將樣 品洗涂并用25%、50%、75%、95%和最后是100%的乙醇脫水，然后通過真空干燥機(jī)干燥。 用雙重通道全血/光學(xué)Lumi-聚集度計(Model 700化ronolog Co巧oration)進(jìn)行聚集。 陶]巨核細(xì)胞混合
[0174]人字形凹槽在通道的(Oyz)平面產(chǎn)生無序微縱滿，導(dǎo)致細(xì)胞的橫向位移（圖16)。它 們還使得細(xì)胞打破其軌跡，進(jìn)入相對于物流軌跡旋轉(zhuǎn)45Γ的小道，然后退出小道并在主通 道中繼續(xù)。那些無序的位移導(dǎo)致均質(zhì)的側(cè)向細(xì)胞流速，如圖16b.所描述。
[01巧]巨核細(xì)胞捕獲
[0176]我們通過獨(dú)立于其移位速度(包括非移動細(xì)胞）的表面粘附的巨核細(xì)胞定義捕獲 的巨核細(xì)胞。我們根據(jù)束或桿（圖3和圖4定義）的不同幾何形狀評估了巨核細(xì)胞捕獲。結(jié)果 顯示于圖7。沿著非紋理的第一部分通道，粘附的巨核細(xì)胞的密度非常低(cKlOOmnf2)。相反， 沿著具有紋理的一部分通道，密度高得多(〇〉750mnf2)。作為對照，光滑通道顯示巨核細(xì)胞的 表面密度不可檢測。也證實(shí)了桿間距離p = 60μηι、ρ = 85μηι和p = 120]im的捕獲增強(qiáng)。
[0177]沿著接著紋理部分且缺乏障礙物的最后部分，我們觀察到具有紋理的通道（ο~ 250mm-2)和不具有紋理的通道(曰<10mm-2)之間的明顯密度差。運(yùn)是與巨核細(xì)胞的移位速度 聯(lián)合的部分2中發(fā)生的捕獲的直接后果(移位速度的分布從Ομπι. S-1擴(kuò)大至200μπι. S-1)。
[017引蛋白質(zhì)表面涂層的影響
[0179] 在血管內(nèi)皮細(xì)胞上，當(dāng)通過結(jié)合其GPIb受體經(jīng)受高剪切率(〉1000s^)時，VWF允許 循環(huán)血小板的移位化 uizinga 等，Shuctures of Glycoprotein ]；baand Its complex with von Willebrand Factor AlDomain", Science ,vol.297,n°5584,p.1176-1179, 2002)。在體外，VWF的吸附允許巨核細(xì)胞、血小板和前血小板移位到PDMS和玻璃表面上 (Dunois-Lard有等，"Exposure of human megakaryocytes to high shear rates accelerates platelet production" ,Blood,vol. 114,n° 9 ,p. 1875-1883,2009)。我們比較 了 VWF和BSA涂層對通道壁上巨核細(xì)胞的粘附的影響。
[0180] 我們用涂有VWF的通道幾何形態(tài)2進(jìn)行四次實(shí)驗(yàn)，用涂有BSA的通道幾何形態(tài)2進(jìn)行 四次實(shí)驗(yàn)。我們比較了 t = 50min時巨核細(xì)胞的表面密度。
[0181] 結(jié)果顯示于圖8。當(dāng)涂有VW即寸，通道光滑部分的平均巨核細(xì)胞密度為54mnf2,通道 紋理部分的平均巨核細(xì)胞密度為275mm 2。當(dāng)涂有BSA時，通道光滑部分的平均巨核細(xì)胞密度 為4mnf2,通道紋理部分的平均巨核細(xì)胞密度為39mnf2。運(yùn)證實(shí)了兩種涂層均發(fā)生了之前段 落中描述的捕獲效應(yīng)。此外，VWF明顯增加了通道中粘附細(xì)胞的密度。
[0182] 用纖維蛋白原涂層進(jìn)行第Ξ組實(shí)驗(yàn)。盡管已知纖維蛋白原W低剪切率結(jié)合巨核細(xì) 胞，但是在用于促進(jìn)巨核細(xì)胞延伸的高剪切率下不可能觀察到巨核細(xì)胞捕獲。
[0183] 那些結(jié)果沒有詳細(xì)描述表面上細(xì)胞的性能。我們定性地觀察到不具有紋理的通道 內(nèi)沿著X軸的距離，0明顯降低。在具有紋理的通道中，我們觀察到沿著紋理長度，〇先略微增 加，隨后降低。運(yùn)些結(jié)果是瞬時的，并由巨核細(xì)胞的不同輸送機(jī)制產(chǎn)生。
[0184] 巨核細(xì)胞和血小板輸送
[0185] 細(xì)胞具有兩種不同的輸送方式:平流，產(chǎn)生幾 mm. 的速度，和移位，產(chǎn)生幾 μπι. 的速度。圖10提出了細(xì)胞和壁之間不同的可能相互作用。使用桿陣列，可W通過Dunois- Lardg等（ibid.)描述的通道壁捕獲細(xì)胞，也可W通過在桿的頂部或在桿的垂直側(cè)上移位來 捕獲細(xì)胞。當(dāng)通過桿捕獲時，細(xì)胞在通道壁上跟隨其移位，或W平流釋放（圖10.b)，否則停 止移位（圖10.C)并在桿后被捕獲。那些單細(xì)胞事件闡明了之前兩段中描述的較大規(guī)模的性 能。
[01化]巨核細(xì)胞破裂和血小板釋放
[0187] 我們觀察到血小板從表面粘附的巨核細(xì)胞脫落。當(dāng)巨核細(xì)胞移位到通道壁上時， 它們與壁表面上的VWF建立了瞬時相互作用，其逐漸導(dǎo)致形態(tài)變化直到血小板從巨核細(xì)胞 脫落。當(dāng)延伸體和細(xì)胞體均移位時發(fā)生脫落。該過程描述于上文引用的Dunois-Lard6的出 版物中和國際專利申請W0 2010/06382311中。破裂后，兩種實(shí)體繼續(xù)移位到壁表面上。
[0188] 當(dāng)細(xì)胞體移位直到在桿周圍或桿后被捕獲時，也發(fā)生脫落（圖10. C)。在幾分鐘的 時間范圍內(nèi)，巨核細(xì)胞經(jīng)歷形態(tài)變異，導(dǎo)致形成采用線上的珠的結(jié)構(gòu)的延伸體，如之前上文 引用的Dunois-Lard6的出版物中所報告。此外，與整個細(xì)胞與涂層表面接觸相反，一些延伸 體似乎與物流一起自由移動(搖擺），盡管細(xì)胞通過至少一個接觸點(diǎn)保持在相同位置。隨著 線上的珠的延伸體的尺寸增長，一些發(fā)生破裂，釋放血小板和/或前血小板。圖11報告了十 種巨核細(xì)胞延伸的Ξ種不同的破裂(數(shù)據(jù)未顯示）。搖擺釋放詳細(xì)描述于圖12的短時標(biāo)中。 破裂后，釋放的前血小板的速度測量為4cm每秒，其對應(yīng)于物流的速度。我們假定破裂后釋 放的元件平流輸送。
[0189] 各巨核細(xì)胞釋放的血小板的量可通過單個細(xì)胞的長時間成像來估計。我們的觀察 結(jié)果顯示捕獲于桿上且經(jīng)歷剪切的巨核細(xì)胞可W釋放11個片段/小時。運(yùn)些片段具有線上 的珠的形狀。我們測量了釋放珠的尺寸分布，將它們中每一個固定為影像框架上的楠圓。假 定旋轉(zhuǎn)對稱，我們估計了釋放珠的總體積并用它除W我們假定為血小板的最小的觀察到的 珠子體積。用該方法，我們發(fā)現(xiàn)血小板產(chǎn)量高達(dá)350個血小板/巨核細(xì)胞。通過比較，預(yù)期人 巨核細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)化為1〇2-1〇3個血小板（Thon et al,"Cytoskeletal mechanics of proplatelet maturation and platelet release"，J Cell Biol,vol.191,n°4,p.961- 874,2010,and Thon et al.,"Platelet Formation",Seminars in Hematology,vol.47, n°3,p.220-226,2010)〇
[0190] 從巨核細(xì)胞生產(chǎn)血小板的平行化
[0191] 我們通過制造用柱陣列組成圖案的平行化通道來擴(kuò)大血小板生產(chǎn)的過程。所有W 下實(shí)驗(yàn)使用上述幾何形狀3。幾何形狀3具有總共168770個柱。圖13. a和13. b是顯示總共66 個柱的柱陣列的細(xì)節(jié)，其中48個柱設(shè)及巨核細(xì)胞捕獲或伸長過程。單獨(dú)地，我們注意到單個 柱能夠捕獲幾個巨核細(xì)胞。該過程是瞬時的，且在物流方向上與距離相關(guān)。圖13.a描繪了廝 帶血巨核細(xì)胞的捕獲和延伸，圖13.b描繪了外周血巨核細(xì)胞的捕獲和延伸。
[0192] 在"微射流裝置"結(jié)構(gòu)中，將20mL經(jīng)攬拌的巨核細(xì)胞懸液(200000個巨核細(xì)胞/mU 在閉環(huán)中通過5個根據(jù)幾何形狀3制造的平行裝置循環(huán)2小時。在"對照"結(jié)構(gòu)中，將20mL經(jīng)攬 拌的巨核細(xì)胞懸液在不具有任何微射流裝置的閉環(huán)中在單管(Tygon，0.57mm I. D.，Saint- Gobain,France)中循環(huán)。為量化血小板生產(chǎn)，在血細(xì)胞計數(shù)器中計數(shù)在開始時和120min灌 注后通過微射流裝置或通過對照系統(tǒng)收集的細(xì)胞懸液。認(rèn)為直徑為lym-4wii的雙重折射細(xì) 胞是血小板。圖13. C和13. d顯示分別從廝帶血巨核細(xì)胞和從外周血巨核細(xì)胞生產(chǎn)血小板的 血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)的結(jié)果。圖13. C顯示在t = 0min時，在微射流裝置和在對照中回收的血小 板濃度沒有顯著差異(273 800和301 000個血小板/mL)。在t = 120min，濃度分別為486 000 ±69 400個血小板/mL和1 360 000± 159 000個血小板/mL，顯示顯著差異（Student t檢 驗(yàn)，成對樣品，P<〇. 005)。我們假定運(yùn)種濃度增加是通過微射流裝置的結(jié)果。圖13. d顯示了 類似的趨勢，但沒有對在微射流裝置和對照中回收的血小板濃度進(jìn)行統(tǒng)計分析。
[OW] 射流裝置中生產(chǎn)的血小板的表征
[0194]灌注兩小時后，裝置中循環(huán)的細(xì)胞懸液包含的血小板的含量大于在對照系統(tǒng)中循 環(huán)的細(xì)胞懸液。因此可W通過上述的不同方法分煉運(yùn)些血小板。在射流裝置中生產(chǎn)的血小 板顯示出與天然血小板（即從血分離的血小板或循環(huán)血小板)相當(dāng)?shù)娜舾商卣?。我們發(fā)現(xiàn)從 對照系統(tǒng)中獲得的樣品不具有運(yùn)些特征，所述對照系統(tǒng)由除了射流通道之外的所有元件組 成。如圖14.a所示，射流裝置生產(chǎn)的血小板中CD42b受體的表達(dá)明顯高于對照樣品中回收的 血小板樣顆粒(P<〇.05)。如使用血小板所觀察到的，在微射流裝置中生產(chǎn)的血小板中鑒定 了CD41+CD42b+元件的清晰群體，而在對照樣品中回收的血小板樣顆粒中沒有發(fā)現(xiàn)（圖 14.b)。有趣的是，TRAP刺激后，血小板能夠經(jīng)歷類似于已知的表征血小板的活化特征，例如 增加其與特異于anb盼受體的活性構(gòu)象的PACl單克隆抗體的結(jié)合水平，而在對照樣品中回 收的血小板樣顆粒中沒有運(yùn)個發(fā)現(xiàn)（圖14.C和14.d)。圖15.a顯示表示血小板特征的微管蛋 白環(huán)存在于從射流裝置收集的樣品中，但不存在于從對照樣品收集的樣品中。一旦它們被 凝血酶活化，通過射流裝置生產(chǎn)的血小板顯示出線狀偽足、板狀偽足和肌動蛋白應(yīng)力纖維， 表明肌動蛋白微絲如在從血分離的凝血酶激活的血小板中一樣重組。對照樣品缺少血小板 功能的兩種標(biāo)志。掃描電子顯微鏡（圖15.b)顯示了通過射流裝置生產(chǎn)的TRAP激活的血小板 中線狀偽足和板狀偽足的存在，而運(yùn)些形式在對照樣品中沒有檢測到。圖15 . C顯示從通過 射流裝置的通路中回收的樣品中的血小板聚集。再一次，在對照中回收的血小板中沒有運(yùn) 種大的聚集。因此該報告首次表明，從通過平行化微射流裝置的巨核細(xì)胞暴露中收集的樣 品中觀察到清楚的血小板特征，運(yùn)是在缺少微射流忍片的對照中回收的血小板樣顆粒所缺 少的。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于從巨核細(xì)胞懸液巧)生產(chǎn)血小板的射流裝置（1)，包含： -生產(chǎn)室(3)，包含通過非多孔壁定界的至少一個通道(8)，和在一端的其中能引入包含 巨核細(xì)胞或其片段的懸液的至少一個進(jìn)口孔(9)，和在另一端的其中可W收集血小板的至 少一個出口孔(10); 其中所述通道(8)的壁的內(nèi)表面的至少一部分(11)構(gòu)造成具有多個障礙物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的射流裝置，其中所述通道(8)的內(nèi)表面的紋理部分（11)進(jìn)一步 涂有對巨核細(xì)胞具有結(jié)合親合力的配體，例如血管性血友病因子(VWF)、其功能性變體或包 含血管性血友病因子的片段的重組多膚、或纖維蛋白原或纖連蛋白。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的射流裝置，其中確定所述障礙物的密度、尺寸和形狀W便 將巨核細(xì)胞捕獲于通道內(nèi)表面的所述紋理部分上，從而血小板脫落。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的射流裝置，其中所述障礙物是桿(12)或束（15)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的射流裝置，其中所述通道(8)具有基本上正方形或長 方形的截面。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的射流裝置，其中所述障礙物是具有半徑為r的基本上 圓形截面的桿（12)，且所述桿布置在至少一部分所述通道的內(nèi)表面上W形成具有六邊形的 周期性結(jié)構(gòu)的規(guī)則圖案，例如： (i) 桿的半徑r優(yōu)選為50nm-15mm，更優(yōu)選500nm-l .5mm; (ii) 兩個桿中屯、之間的最近距離p為至少等于10化m，優(yōu)選100nm-50mm，更優(yōu)選500nm- 10mm，甚至更優(yōu)選如m-lmm; (iii) 角度α，其是通過通道縱向（14)和六邊形布拉維晶格的晶格矢量之一定義的最低 角度，例如α為0-90°，優(yōu)選0-30% (iv) 任選所述桿的高度h為如0<h《H，其中Η是指通道截面中兩個相對的壁之間測量的 最小距離。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的射流裝置，其中所述通道的高度Η為扣m-lmm。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的射流裝置，其中所述生產(chǎn)室(3)包含至少一個或多個 在其內(nèi)表面上具有紋理部分的平行通道，例如2個通道-106個通道。9. 從巨核細(xì)胞或其片段生產(chǎn)血小板的離體方法，所述方法包含： -將包含巨核細(xì)胞或其片段的細(xì)胞懸液引入根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的射流裝置； -在生產(chǎn)室的通道中，使所述懸液在適于巨核細(xì)胞的延伸、破碎和血小板釋放的剪切率 下流動;和 -收集通道出口處的血小板。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中將流速固定在能夠?qū)⒕哂屑y理部分的通道中的所 述巨核細(xì)胞經(jīng)歷最小值到最大壁剪切率?&,χ的范圍內(nèi)，所述最大壁剪切率不超過30，〇〇〇s -1、優(yōu)選10，OOOs-i、更優(yōu)選8，OOOs-i和甚至更優(yōu)選5，OOOs-i。11. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其中所述通道出口處收集的血小板進(jìn)一步包含裸 核和/或完整的巨核細(xì)胞，所述方法進(jìn)一步包含從所述懸液純化、富集或分離血小板的步 驟。12. 根據(jù)權(quán)利要求9-11任一項(xiàng)所述的方法，其中所述懸液是通過W下步驟獲得的懸液： (i)提供巨核細(xì)胞祖細(xì)胞和/或干細(xì)胞； (i i)擴(kuò)增所述巨核細(xì)胞祖細(xì)胞和/或干細(xì)胞； (i i i)將所述擴(kuò)增的細(xì)胞分化成巨核細(xì)胞。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述巨核細(xì)胞祖細(xì)胞和/或干細(xì)胞選自造血干細(xì) 胞、胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。14. 根據(jù)權(quán)利要求9-13任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述巨核細(xì)胞懸液在進(jìn)入生產(chǎn)室之 前均質(zhì)化和/或純化。15. 根據(jù)權(quán)利要求9-14任一項(xiàng)所述的方法，其中所述血小板在通道出口通過選自下組 的方法分煉:交叉流過濾、層流、介電電泳、光學(xué)力、磁力、聲學(xué)力或慣性力。16. 根據(jù)權(quán)利要求9-15任一項(xiàng)所述的方法，其中所述血小板是可W如循環(huán)血小板一樣 被激活的功能性血小板。
【文檔編號】B01L3/00GK105980057SQ201480062983
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2014年11月18日
【發(fā)明人】D·巴呂什, A·P·M·布林, A·馬涅, S·沙薩克, A·勒格夫, M·雷薩特
【申請人】普拉托德公司, 巴黎市工業(yè)物理化學(xué)學(xué)校