本發(fā)明涉及人參與殘留農(nóng)藥分離、藥用成分凈化領(lǐng)域，具體涉及一種快速分離人參中人參皂苷和殘留農(nóng)藥的方法。

背景技術(shù)：

人參是一種珍貴的常用中藥材,不僅在中醫(yī)藥寶庫中占有重要地位,而且在遠(yuǎn)東其他國家,如韓國、日本和俄羅斯也很受重視。人參皂苷是從人參中分離出來的主要有效成分，它具有抗癌作用等多種功效，是人參營養(yǎng)的主要體現(xiàn)，但由于人們逐漸認(rèn)識到殘留農(nóng)藥對人體和環(huán)境的危害，有機(jī)氯殘留農(nóng)藥含量偏高是制約我國人參以及人參浸膏制品進(jìn)入國際市場的重要因素之一。

目前，分離人參中殘留農(nóng)藥的常用方法有：超臨界萃取、水洗法、炮制法、吸附法、反滲透法、有機(jī)溶劑萃取法、生物化學(xué)法等。但這些方法不能在短時間內(nèi)分離人參皂苷和殘留農(nóng)藥，難以實(shí)現(xiàn)高通量獲得人參皂苷等藥用成分。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種快速分離人參中人參皂苷和殘留農(nóng)藥的方法，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)短時間內(nèi)高效分離極性差異較大的人參皂苷和殘留農(nóng)藥，達(dá)到快速凈化復(fù)雜基質(zhì)中的人參皂苷的效果。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

一種快速分離人參中人參皂苷和殘留農(nóng)藥的方法，包括如下步驟：

（1）將人參樣品經(jīng)有機(jī)溶劑回流提取后，得到人參提取液；

（2）將所述步驟（1）得到的人參提取液先后經(jīng)過未活化的碳纖維材料和活性炭纖維；

（3）采用第一流動相洗脫所述步驟（2）得到吸附有殘留農(nóng)藥的未活化的碳纖維材料和吸附有人參皂苷的活性炭纖維材料，得到第一組分洗脫液，將所述第一組分洗脫液直接流入廢液瓶中，去除人參提取液中強(qiáng)極性水溶性的雜質(zhì)；

所述第一流動相包括體積終濃度為0.05～0.2%的甲酸溶液與體積終濃度為5～10%的甲醇溶液；

（4）采用第二流動相洗脫所述步驟（3）得到活性炭纖維材料，得到第二組分洗脫液，對所述第二組分洗脫液進(jìn)行在線ESI-MSMS分析：進(jìn)入ESI中離子化，后經(jīng)串聯(lián)MS分析，得到人參主皂苷；

所述第二流動相包括體積終濃度為0.05～0.2%的甲酸溶液與體積終濃度為80～100%的甲醇溶液；

（5）采用第三流動相洗脫所述步驟（3）得到未活化的碳纖維材料，得到第三組分洗脫液，將所述第三組分洗脫液餾分接入100 μL襯管中，之后定容50 μL，后進(jìn)GC-MS等儀器分析，得到殘留農(nóng)藥的分析，實(shí)現(xiàn)人參皂苷和殘留農(nóng)藥的快速分離；

所述第三流動相包括體積終濃度為80～100%的二氯甲烷溶液。

進(jìn)一步地，所述步驟（4）中的第二組分洗脫液中人參主皂苷包括Rb1，Re，Rb2，Rc，Rd，Rg1和Rf。

進(jìn)一步地，所述步驟（5）中的所述第三組分洗脫液中殘留農(nóng)藥包括有有機(jī)氯農(nóng)藥、腐霉利。

進(jìn)一步地，所述步驟（3）中的第一流動相包括體積終濃度為0.1%的甲酸溶液與體積終濃度為8%的甲醇溶液；所述步驟（4）中的第二流動相包括體積終濃度為0.1%的甲酸溶液與體積終濃度為100%的甲醇溶液；所述步驟（5）中的第三流動相為體積終濃度為100%的二氯甲烷溶液。

進(jìn)一步地，所述步驟（3）中第一流動相的流速為1.5～3.5 mL /h，優(yōu)選2.5 mL /h；所述步驟（4）中第二流動相的流速為1.5～3.5 mL /h，優(yōu)選2.5 mL /h；所述步驟（5）中第二流動相的流速為1.5～3.5 mL /h，優(yōu)選2.5 mL /h。

進(jìn)一步地，所述人參中的人參主皂苷和殘留農(nóng)藥的組分離時間為7.5 min。

進(jìn)一步地，所述步驟（1）中有機(jī)溶劑為80%乙醇溶液或甲醇溶液，所述甲醇的體積濃度為99.9%，水的體積濃度為99.9%。

進(jìn)一步地，所述步驟（1）中回流提取的溫度為75～85℃。

進(jìn)一步地，所述步驟（1）中回流提取后的人參提取液經(jīng)過濾膜過濾，所述濾膜的孔徑為0.22 μm、0.45 μm或0.6 μm。

本發(fā)明提供了一種快速分離人參中人參皂苷和殘留農(nóng)藥的方法，以未活化的碳纖維材料和活性炭纖維材料依次對人參皂苷和殘留農(nóng)藥進(jìn)行吸附，未活化的碳纖維材料通過π-π作用力、范德華力和疏水相互作用力等非共價作用力與殘留農(nóng)藥結(jié)合；活性炭纖維材料，表面粗糙，具有許多含氧的官能團(tuán)，增強(qiáng)了碳纖維的親水性，活性炭纖維材料可以與極性較強(qiáng)的人參皂苷結(jié)合，同時極性最強(qiáng)的水溶性雜質(zhì)與兩種炭纖維的作用力均很弱，被第一流動相快速洗脫，去除干擾人參皂苷檢測的雜質(zhì)。組分分離與串聯(lián)質(zhì)譜離子化過程結(jié)合可從人參萃取液中快速檢測人參皂苷，能有效提高目標(biāo)物離子化效率，并減少同時分析的物質(zhì)降低背景干擾，提高檢測靈敏度，可快速去除人參皂苷中殘留農(nóng)藥有效維護(hù)食品安全；組分分離與紫外檢測器結(jié)合可離線分析人參皂苷和其中殘留的農(nóng)藥，接出的兩類物質(zhì)的餾分可分別進(jìn)入LC-MSMS和GC-MS進(jìn)行檢測。整個分離時間只需7.5 min，該方法既可以去除人參皂苷中殘留農(nóng)藥分析人參皂苷的含量又可分析農(nóng)藥殘留量；且本發(fā)明提供的分離方法快速，操作簡便，對于不同種類人參樣品通用性好，裝置簡易，易于制作成大型自動化裝置。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中組分分離裝置的結(jié)構(gòu)原理示意圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例在線分離檢測ESI-MS全掃描模式總離子色譜圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例在線人參皂苷分離檢測7種目標(biāo)物質(zhì)MRM色譜圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例殘留農(nóng)藥GC-MS檢測的總離子色譜圖。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例殘留農(nóng)藥GC-MS檢測的SIM色譜圖。

具體實(shí)施方式

一種快速分離人參中人參皂苷和殘留農(nóng)藥的方法，包括如下步驟：

（1）將人參樣品經(jīng)有機(jī)溶劑回流提取后，得到人參提取液。其中的有機(jī)溶劑可以為80%乙醇溶液或甲醇溶液，所述甲醇的體積濃度為99.9%，水的體積濃度為99.9%；回流提取的溫度為75～85℃, 回流提取的間隔時間優(yōu)選為3～5 min，更優(yōu)選為5 min；回流提取后的人參提取液經(jīng)過濾膜過濾，所述濾膜的孔徑為0.22 μm、0.45 μm或0.6 μm，優(yōu)選0.45 μm；

（2）將所述步驟（1）得到的人參提取液先后經(jīng)過未活化的碳纖維材料和活性炭纖維；

（3）利用組分分離裝置如圖1，轉(zhuǎn)換閥門，采用第一流動相洗脫所述步驟（2）人參提取液先后經(jīng)過的未活化的碳纖維材料和活性炭纖維，得到吸附有殘留農(nóng)藥的未活化的碳纖維材料和吸附有人參皂苷的活性炭纖維材料，得到第一組分洗脫液，將所述第一組分洗脫液直接流入廢液瓶中，去除人參提取液中強(qiáng)極性水溶性的雜質(zhì)；

所述第一流動相包括體積終濃度為0.05～0.2%的甲酸溶液與體積終濃度為5～10%的甲醇溶液；優(yōu)選：0.1%的甲酸溶液與8%的甲醇溶液；

所述第一流動相的流速為1.5～3.5 mL /h，優(yōu)選2.5 mL /h；

（4）采用第二流動相洗脫所述步驟（3）得到活性炭纖維材料，得到第二組分洗脫液，對所述第二組分洗脫液進(jìn)行在線ESI-MSMS分析：進(jìn)入ESI中離子化，后經(jīng)串聯(lián)MS分析，得到人參主皂苷；

所述第二流動相包括體積終濃度為0.05～0.2%的甲酸溶液與體積終濃度為80～100%的甲醇溶液；優(yōu)選：0.1%的甲酸溶液與100%的甲醇溶液；

所述第二組分洗脫液中人參主皂苷包括Rb1，Re，Rb2，Rc，Rd，Rg1和Rf；

所述第二流動相的流速為1.5～3.5 mL /h，優(yōu)選2.5 mL /h；

（5）離線操作，斷開裝置與質(zhì)譜連接線，采用第三流動相洗脫所述步驟（3）得到未活化的碳纖維材料，得到第三組分洗脫液，將所述第三組分洗脫液餾分接入100 μL襯管中，之后定容50 μL，后進(jìn)GC-MS等儀器分析，得到殘留農(nóng)藥的分析，實(shí)現(xiàn)人參皂苷和殘留農(nóng)藥的快速分離，分離時間約為7.5 min；

所述第三流動相包括體積終濃度為80～100%的二氯甲烷溶液，優(yōu)選100%的二氯甲烷溶液；

所述第三流動相的流速為1.5～3.5 mL /h，優(yōu)選2.5 mL /h；

所述第三組分洗脫液中殘留農(nóng)藥包括有有機(jī)氯農(nóng)藥（六六六，滴滴滴）、腐霉利。

在本發(fā)明中采用東北地區(qū)人參為分析樣品，所述植物樣品的部位優(yōu)選為根部。本發(fā)明對所述人參的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的人參的來源即可。所述人參樣品無需前處理過程。

在本發(fā)明中，所述人參樣品與萃取溶劑的質(zhì)量體積比優(yōu)選為1 g：5 mL～1 g：15 mL，更優(yōu)選為1 g：10 mL。

附圖1為本發(fā)明人參提取液分離人參皂苷和殘留農(nóng)藥所用裝置的結(jié)構(gòu)示意圖，1、第一流動相試劑瓶；2、第二流動相試劑瓶；3、第三流動相試劑瓶；4、泵1；5、泵2；6、泵3；7、控制器；8、進(jìn)樣閥；9、閥1；10、閥2；11、填充有未活化的碳纖維材料微型柱；12、閥3；13、填充有活性炭纖維的微型柱；14、閥4；15、廢液筒；16、質(zhì)譜檢測器。

附圖1展示了A、B、C、D 進(jìn)樣后4種不同階段的情況：

A狀態(tài)為第一流動相對填充有未活化的碳纖維材料微型柱和填充有活性炭纖維的微型柱潤洗的過程，第一流動相進(jìn)入裝置內(nèi)，在控制器7的作用下，設(shè)置一定流速，其中將閥1和閥4斷開，閥2和閥3閉合，使第一流動相先后通過填充有未活化的碳纖維材料的微型柱11和填充有活性炭纖維的微型柱13，用廢液筒15收集排出的廢液，達(dá)到潤洗未活化的碳纖維材料的微型柱11和填充有活性炭纖維的微型柱13的目的；

B狀態(tài)為去除強(qiáng)極性雜質(zhì)的洗脫過程，人參提取液樣品均由進(jìn)樣閥8手動進(jìn)樣進(jìn)入裝置內(nèi)，在控制器7的作用下，設(shè)置一定流速，其中將閥1和閥4斷開，閥2和閥3閉合，使第一流動相先后通過填充有未活化的碳纖維材料的微型柱11和填充有活性炭纖維的微型柱13，用廢液筒15收集排出的人參中強(qiáng)極性雜質(zhì)廢液，填充有未活化的碳纖維材料的微型柱11結(jié)合弱極性農(nóng)殘，填充有活性炭纖維的微型柱13結(jié)合上人參主皂苷；

C狀態(tài)為人參主皂苷的洗脫過程，第二流動相在控制器7的作用下到達(dá)進(jìn)樣閥8，設(shè)置一定流速，其中將閥2和閥4斷開，閥1和閥3閉合，使第二流動相僅通過填充有活性炭纖維的微型柱13，使結(jié)合在填充有活性炭纖維的微型柱13的人參主皂苷洗脫下來，得到的第二組分洗脫液，在線進(jìn)行離子化得到人參主皂苷質(zhì)譜圖；

D狀態(tài)為殘留農(nóng)藥的洗脫過程，擰開與質(zhì)譜連接的接頭，第三流動相在進(jìn)樣閥8的作用下進(jìn)入裝置中，在控制器7設(shè)置一定流速，將閥2和閥4閉合，閥1和閥3斷開，使第三流動相僅通過填充有未活化的碳纖維材料的微型柱11，使結(jié)合在填充有未活化的碳纖維材料的微型柱11上的殘留農(nóng)藥洗脫下來，得到的第三組分洗脫液經(jīng)管線流出，接出該餾分，后進(jìn)入GC-MS分析檢測。

在本發(fā)明中，所述未活化的碳纖維材料和活性炭纖維的表面是不同的。所述未活化的碳纖維材料表面未經(jīng)過修飾，所述活性炭纖維的表面為是經(jīng)表面修飾氧元素。本發(fā)明中對所述未活化的碳纖維材料和活性炭纖維的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的未活化的碳纖維材料和活性炭纖維的來源即可。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述未活化的碳纖維材料和活性炭纖維是商業(yè)化產(chǎn)品。

所述未活化的碳纖維材料和活性炭纖維材料優(yōu)選作為填充材料填充到微型柱中，將植物萃取液依次通過填充有未活化的碳纖維材料的微型填充柱和填充有活性炭纖維材料的微型填充柱。所述微型柱的長度優(yōu)選為5 cm，所述微型柱的內(nèi)經(jīng)優(yōu)選為0.75 mm。

在本發(fā)明中，所述填充碳纖維材料的填充度優(yōu)選為6000～8000根，更優(yōu)選為7000根；所述填充活性炭纖維材料的填充度優(yōu)選為3000～4000根，更優(yōu)選為3500根。

得到吸附有殘留農(nóng)藥的未活化的碳纖維材料和吸附有人參皂苷的活性炭纖維材料后，本發(fā)明用第一流動相先后對所述未活化的碳纖維材料和進(jìn)行第一次洗脫，得到第一組分洗脫液和經(jīng)第一次洗脫后的未活化的碳纖維材料和活性炭纖維材料。

在本發(fā)明中，所述第一流動相優(yōu)選采用注射泵導(dǎo)入。所述的注射泵為多通道單獨(dú)調(diào)控的低壓注射泵，在低壓下實(shí)現(xiàn)高效分析。

在本發(fā)明中，所述第一流動相優(yōu)選包括體積終濃度為0.1%的甲酸溶液和體積終濃度為8%的甲醇溶液。

在本發(fā)明中，所述第一流動相的流速優(yōu)選為1.5～3.5 mL /h，更優(yōu)選為2.5 mL /h。

在本發(fā)明中，所述第一次洗脫時間優(yōu)選為0.5～1.5 min，更優(yōu)選為1 min。

在本發(fā)明中，所述離子化過程的條件優(yōu)選滿足如下條件：

離子源條件：ESI離子源正離子MRM模式檢測，毛細(xì)管電壓優(yōu)選為3500～4500V，更優(yōu)選為4000 V，干燥氣流速優(yōu)選為8～14L / min，更優(yōu)選為11 L / min，噴霧器電壓優(yōu)選為10～25psi；更優(yōu)選為15 psi，干燥氣溫度優(yōu)選為250～320℃，更優(yōu)選為300℃；

質(zhì)譜檢測條件：各目標(biāo)物母離子及相應(yīng)子離子如表所示，F(xiàn)ragmentor為毛細(xì)管出口電壓（單位：V），CE為碰撞能(單位：eV)，Delta為掃描頻率100 μs。

表1 目標(biāo)物質(zhì)離子化條件及MRM模式檢測參數(shù)。

本發(fā)明中，所述人參主皂苷包括Rb1，Re，Rb2，Rc，Rd，Rg1和Rf。

得到經(jīng)第一次洗脫后的未活化的碳纖維材料和活性炭纖維材料后，本發(fā)明用第二流動相對經(jīng)第一次洗脫后的未活化的碳纖維材料和活性炭纖維材料進(jìn)行第二次洗脫，得到第二組分洗脫液和第二次洗脫后活性炭纖維材料和第一次洗脫后未活化的碳纖維材料。

在本發(fā)明中，所述第二流動相優(yōu)選采用注射泵導(dǎo)入。所述的注射泵為多通道單獨(dú)調(diào)控的低壓注射泵，在低壓下實(shí)現(xiàn)高效分析。

在本發(fā)明中，所述第二流動相優(yōu)選包括體積濃度0.1%的甲酸溶液和體積濃度為100%的甲醇溶液。

在本發(fā)明中，所述第二流動相的流速優(yōu)選為1.5～3.5 mL /h，更優(yōu)選為2.5 mL /h。

在本發(fā)明中，所述未活化的碳纖維材料和活性炭纖維材料與紫外檢測器聯(lián)用，操作環(huán)境安全。

得到第二次洗脫后的未活化的碳纖維材料和活性炭纖維材料，本發(fā)明優(yōu)選還包括：將第三流動相通過第一次洗脫后的未活化的碳纖維材料，分離人參中結(jié)合在未活化的碳纖維材料上的殘留農(nóng)藥，同時沖洗、平衡纖維材料，以便下次循環(huán)篩選時使用。

在本發(fā)明中，所述第三流動相優(yōu)選包括體積濃度為二氯甲烷溶液。所述第三流動相的洗脫時間優(yōu)選為2～3 min，更優(yōu)選為2 min。

在本發(fā)明中，所述第三流動相的流速為1.5～3.5 mL /h，更優(yōu)選為2.5 mL /h。

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明提供的一種快速分離人參中人參皂苷和殘留農(nóng)藥的方法進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

實(shí)施例1

稱取人參樣品1 g，經(jīng)80%乙醇水溶液82℃條件下回流提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，過0.45 μm濾膜定容，后直接由微量注射器注入到進(jìn)樣器內(nèi)，搬動進(jìn)樣器閥門，完成進(jìn)樣；斷開閥門1和閥門2，調(diào)節(jié)注射泵控制器令泵1推動第一流動相，流速為2.5 mL/ h，樣品在第一流動相的帶動下進(jìn)入到由未活化的碳纖維微型柱和活化的炭纖維微型柱，人參提取液中不同極性的組分與兩個微型柱的作用機(jī)理不同，分別被選擇性地保留在不同的微型柱上；（3）第一流動相洗脫后，得到第一組分洗脫液，去除人參提取液中強(qiáng)極性雜質(zhì)；（4）關(guān)閉閥門1、斷開閥門2并調(diào)節(jié)注射泵令泵2推動第二流動相洗脫活化的炭纖維微型柱，流速為2.5 mL/ h進(jìn)行洗脫得到第二組分洗脫液，經(jīng)檢測器在線進(jìn)行離子化后進(jìn)入質(zhì)譜等儀器進(jìn)行分析；（5）斷開閥門1、關(guān)閉閥門2并調(diào)節(jié)注射泵令泵3推動第三流動相洗脫未活化的碳纖維微型柱，流速為2.5 mL/ h進(jìn)行洗脫得到第三組分洗脫液，經(jīng)管線接出的第三組分餾分，后可進(jìn)入GC-MS等儀器進(jìn)行分析；（6） 斷開閥門1、斷開閥門2并調(diào)節(jié)注射泵令泵3推動第二流動相，流速調(diào)節(jié)至5.0 mL/ h，調(diào)節(jié)MS/MS檢測器狀態(tài)為waste，完成沖洗、平衡微型柱過程，以便下次循環(huán)篩選時使用。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。