復(fù)合穩(wěn)定劑及添加該復(fù)合穩(wěn)定劑的nmn轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種復(fù)合穩(wěn)定劑及添加該復(fù)合穩(wěn)定劑的NMN轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法，具有這樣的特征，該方法包括以下步驟：步驟一，制備粗酶液；步驟二，將制備得到的粗酶液分裝于多個(gè)離心管中，向其中一部分離心管中加入保護(hù)劑，向另一部分離心管中加入雙蒸水；步驟三，向兩部分離心管中分別加入緩沖溶液、底物以及金屬離子，混勻后置于水浴鍋中反應(yīng)，加入EDTA反應(yīng)后，離心，去除沉淀，取上清液；步驟四，取上清液并測定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值；步驟五，以未加保護(hù)劑的粗酶液為對照，得到相對酶活力。本發(fā)明復(fù)合穩(wěn)定劑由常見的組分組成，成分簡單、成本低廉，能有效提高NMN轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定性，并且應(yīng)用前景廣闊；NMN轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法簡單實(shí)用，效果直觀。
【專利說明】
復(fù)合穩(wěn)定劑及添加該復(fù)合穩(wěn)定劑的NMN轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及微生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種復(fù)合穩(wěn)定劑及添加該復(fù)合穩(wěn)定劑的NMN轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]NMN轉(zhuǎn)移酶(Nmnat)在生物體生命活動(dòng)中起著十分重要的作用，是一類有助于多種蛋白復(fù)合裝配、蛋白折疊以及蛋白損傷后再折疊的蛋白質(zhì)，可以在蛋白折疊過程中與三磷酸腺苷(ATP)相耦聯(lián)，利用煙酰胺單核苷酸(NMN)生成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和NAAD，維持體內(nèi)NAD的平衡;也是一種指示蛋白和應(yīng)激反應(yīng)蛋白，可作為生物藥劑的靶標(biāo)和調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄合成。大量研究表明，NMN轉(zhuǎn)移酶在自然界中來源極為廣泛，主要是植物、動(dòng)物、微生物，如此豐富的資源，以及人類對NMN轉(zhuǎn)移酶研究的不斷深入，使得NMN轉(zhuǎn)移酶在醫(yī)藥、生物、工業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。
[0003]匪N轉(zhuǎn)移酶作為一種同源性蛋白，在生產(chǎn)、加工和貯存過程，由于外界因素，如溫度、有機(jī)溶劑、PH、金屬離子、酶修飾、降解等影響，均易導(dǎo)致酶穩(wěn)定性降低，甚至失活。酶制劑容易失活，已成為限制其工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用的重要因素，因此提高NMN轉(zhuǎn)移酶的熱穩(wěn)定性、減少失活率和延長貯存期是當(dāng)前研究重點(diǎn)。
[0004]目前提高酶穩(wěn)定性的方法主要有化學(xué)修飾、固定化和添加保護(hù)劑等。然而，化學(xué)修飾主要對酶蛋白肽鏈上某些殘基進(jìn)行共價(jià)修飾，會(huì)引起酶活性的改變;盡管酶的固定化處理后穩(wěn)定性增加，易從反應(yīng)中分離，能反復(fù)多次使用，便于運(yùn)輸和貯存，利于自動(dòng)化生產(chǎn)，但是酶的活性降低，使用范圍減小。因此，目前酶的穩(wěn)定化方法最常用的是添加保護(hù)劑，但對NMN轉(zhuǎn)移酶添加保護(hù)劑，尚未有人進(jìn)行過。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明是為了解決上述問題而進(jìn)行的，目的在于提供一種復(fù)合穩(wěn)定劑作為保護(hù)劑來提高NMN轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定性。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0007]本發(fā)明提供了一種復(fù)合穩(wěn)定劑，用于提高NMN轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定性，其特征在于，包含:濃度為0.5?1.5g/L的山梨醇，濃度為0.5?1.5g/L的海藻酸鈉，體積分?jǐn)?shù)為0.5?1.5%的二甲基亞砜。
[0008]進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種NMN轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法，采用上述的復(fù)合穩(wěn)定劑作為保護(hù)劑，其特征在于，包括以下步驟:步驟一，制備NMN轉(zhuǎn)移酶的粗酶液;步驟二，將制備得到的NMN轉(zhuǎn)移酶的粗酶液分裝于多個(gè)I?2mL的離心管中，向其中一部分離心管中加入預(yù)定量的保護(hù)劑，向另一部分離心管中加入與保護(hù)劑相同的量的雙蒸水;步驟三，向兩部分離心管中分別加入等量的緩沖溶液、底物以及金屬離子，分別混勻后置于30?40°C的水浴鍋中反應(yīng)I?2h，加入乙二胺四乙酸(EDTA)反應(yīng)5?1min后，在轉(zhuǎn)速為4000?8000r/min條件下離心I?5min，去除沉淀，取上清液;步驟四，取上清液并在340nm處測定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值0D34q，吸光值ODmq代表NMN轉(zhuǎn)移酶酶活力的大??；步驟五，以未加保護(hù)劑的粗酶液為對照100%，得到相對酶活力。
[0009]在本發(fā)明提供的匪N轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法中，還可以具有這樣的特征，其中，在步驟一中，NMN轉(zhuǎn)移酶的粗酶液的制備方法包括以下子步驟:子步驟一，將大腸桿菌劃線接種到固體培養(yǎng)基上，在35?40 °C的條件下培養(yǎng)12?18h，得到含有大腸桿菌的固體培養(yǎng)基；子步驟二，取一定量的LB培養(yǎng)基溶于雙蒸水中，調(diào)節(jié)其pH值為6.0?8.0，在121°C條件下滅菌15?30min，得到濃度為20?30g/L的活化液;子步驟三，在無菌環(huán)境下從固體培養(yǎng)基上挑取大腸桿菌接種到活化液中，并加入終濃度為20?40yg/ml的硫酸卡那霉素，在35?40°C條件下培養(yǎng)過夜，得到含有活化的大腸桿菌菌體的液體;子步驟四，將含有活化的大腸桿菌菌體的液體按照體積分?jǐn)?shù)為I?5%的接種量接入經(jīng)過滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為35?400C，搖床轉(zhuǎn)速為180?200r/min的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)至OD6qq為0.5?0.7時(shí)，加入終濃度為5?lOmmol/L的誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在溫度為20?30°C，搖床轉(zhuǎn)速為150?200r/min條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)8?12h，收集得到含煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵液;子步驟五，將發(fā)酵液放置于離心管中，在8000?12000r/min條件下離心攪拌5?lOmin，收集含有煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉(zhuǎn)移酶的菌體沉淀。子步驟六，向菌體沉淀中加入PH7.5的磷酸鹽緩沖溶液，用移液槍吹吸數(shù)次使菌體均勻懸浮，再用超聲波破碎菌體;子步驟七，破壁后的菌體在轉(zhuǎn)速為8000?12000r/min，溫度4°C條件下，冷凍離心15?30min，收集上清液，上清液為NMN轉(zhuǎn)移酶的粗酶液。
[0010]在本發(fā)明提供的匪N轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法中，還可以具有這樣的特征，其中，在步驟二中，預(yù)定量為100yL。
[0011]在本發(fā)明提供的匪N轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法中，還可以具有這樣的特征，其中，在步驟三中，緩沖溶液為Tris-HCl緩沖液，底物為煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)，金屬離子為Mn2
+
O
[0012]在本發(fā)明提供的匪N轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法中，還可以具有這樣的特征，其中，在步驟三中，乙二胺四乙酸的質(zhì)量濃度為0.155moI/L，加入的體積為10yL。
[0013]在本發(fā)明提供的匪N轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法中，還可以具有這樣的特征，其中，在子步驟一中，固體培養(yǎng)基的制備方法為:將濃度為25g/L的LB培養(yǎng)基和濃度為20g/L的瓊脂用雙蒸水溶解于500ml的錐形瓶中，加入NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0，在121°C條件下高壓滅菌20min，得到固體培養(yǎng)基。
[0014]發(fā)明的作用與效果
[0015]本發(fā)明提供了一種復(fù)合穩(wěn)定劑及添加該復(fù)合穩(wěn)定劑的匪N轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法，該復(fù)合穩(wěn)定劑包含山梨醇、海藻酸鈉以及二甲基亞砜這些常見組分，成分簡單、成本低廉，能有效提高NMN轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定性，并且應(yīng)用前景廣闊。另外，本發(fā)明的NMN轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法采用對照實(shí)驗(yàn)比較穩(wěn)定劑對NMN轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定性作用，方法簡單實(shí)用，效果直觀。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，對于實(shí)施例中所用到的具體方法或材料，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā)明技術(shù)思路的基礎(chǔ)上，根據(jù)已有的技術(shù)進(jìn)行常規(guī)的替換選擇，而不僅限于本發(fā)明實(shí)施例的具體記載。
[0017]實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均視為常規(guī)方法;所使用的材料、試劑等，如無特別說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0018]固體培養(yǎng)基:將濃度為25g/L的LB培養(yǎng)基和濃度為20g/L的瓊脂用雙蒸水溶解于500mI的錐形瓶中，加入NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0，在12 TC條件下高壓滅菌20miη，得到固體培養(yǎng)基。
[0019]發(fā)酵培養(yǎng)基成分:濃度為24g/L的酵母粉，濃度為12g/L的胰蛋白胨，濃度為4ml/L的甘油，濃度為2.31g/L KH2PO4以及濃度為12.54g/L的K2HPO^
[0020]實(shí)施例一
[0021]1、復(fù)合穩(wěn)定劑
[0022]本實(shí)施例的復(fù)合穩(wěn)定劑包含:濃度為1.5g/L的山梨醇，濃度為1.0g/L的海藻酸鈉，體積分?jǐn)?shù)為0.5 %的二甲基亞砜。
[0023]2、酶活測定方法
[0024]采用上述成分含量的復(fù)合穩(wěn)定劑作為保護(hù)劑來提高NMN轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定性，NMN轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法包括以下步驟:
[0025]步驟一，制備NMN轉(zhuǎn)移酶的粗酶液:將大腸桿菌劃線接種到固體培養(yǎng)基上，在37V的條件下培養(yǎng)12h，得到含有大腸桿菌的固體培養(yǎng)基;取一定量的LB培養(yǎng)基溶于雙蒸水中，調(diào)節(jié)其PH值為7.0，在121°C條件下滅菌20min，得到濃度為25g/L的活化液;在無菌環(huán)境下從固體培養(yǎng)基上挑取大腸桿菌接種到活化液中，并加入終濃度為30yg/ml的硫酸卡那霉素，在37°C條件下培養(yǎng)過夜，得到含有活化的大腸桿菌菌體的液體;將含有活化的大腸桿菌菌體的液體按照體積分?jǐn)?shù)為I %的接種量接入經(jīng)過滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為37°C，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)至0D6QQ為0.6時(shí)，加入終濃度為8mmol/L的誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在溫度為25°C，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)8h，收集得到含煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵液;將發(fā)酵液放置于離心管中，在溫度為4°C、轉(zhuǎn)速為8000r/min條件下離心攪拌6min，收集含有煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉(zhuǎn)移酶的菌體沉淀，向菌體沉淀中加入PH7.5的磷酸鹽緩沖溶液，用移液槍吹吸數(shù)次使菌體均勻懸浮，再用超聲波破碎菌體;破壁后的菌體在轉(zhuǎn)速為12000r/min，溫度4°C條件下，冷凍離心20min，收集上清液，上清液即為NMN轉(zhuǎn)移酶的粗酶液。
[0026]步驟二，將制備得到的匪N轉(zhuǎn)移酶的粗酶液分裝于多個(gè)ImL的離心管中，向其中一部分離心管中加入10yL的保護(hù)劑，向另一部分離心管中加入10yL的雙蒸水；
[0027]步驟三，向兩部分離心管中分別加入lmol/L PH7.5的Tris-HCl緩沖液、煙酰胺單核苷酸腺苷(匪N)、Mn2+，分別混勻后置于37°C的水浴鍋中反應(yīng)2h，加入10yL質(zhì)量濃度為
0.155mol/L為乙二胺四乙酸溶液(EDTA)反應(yīng)5min后，在轉(zhuǎn)速為8000r/min條件下離心lmin，去除沉淀，取上清液；
[0028]步驟四，取上清液并在340nm處測定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值ODmq，吸光值ODmq代表NMN轉(zhuǎn)移酶酶活力的大小；
[0029]步驟五，以未加保護(hù)劑的NMN轉(zhuǎn)移酶的粗酶液為對照100%，得到相對酶活力。
[0030]實(shí)施例一作用與效果
[0031]根據(jù)本實(shí)施例的NMN轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法，其中添加了本實(shí)施例成分含量的復(fù)合穩(wěn)定劑作為保護(hù)劑的相對酶活為114.23%，未添加保護(hù)劑的酶活為15.8%。
[0032]實(shí)施例二
[0033]1、復(fù)合穩(wěn)定劑
[0034]該復(fù)合穩(wěn)定劑包含:濃度為1.0g/L的山梨醇，濃度為0.5g/L的海藻酸鈉，體積分?jǐn)?shù)為1.5%的二甲基亞砜。
[0035]2、酶活測定方法
[0036]采用上述成分含量的復(fù)合穩(wěn)定劑作為保護(hù)劑來提高NMN轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定性，NMN轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法包括以下步驟:
[0037]步驟一，制備NMN轉(zhuǎn)移酶的粗酶液:將大腸桿菌劃線接種到固體培養(yǎng)基上，在35°C的條件下培養(yǎng)16h，得到含有大腸桿菌的固體培養(yǎng)基;取一定量的LB培養(yǎng)基溶于雙蒸水中，調(diào)節(jié)其PH值為6.0，在121°C條件下滅菌15min，得到濃度為20g/L的活化液;在無菌環(huán)境下從固體培養(yǎng)基上挑取大腸桿菌接種到活化液中，并加入終濃度為20yg/ml的硫酸卡那霉素，在35°C條件下培養(yǎng)過夜，得到含有活化的大腸桿菌菌體的液體;將含有活化的大腸桿菌菌體的液體按照體積分?jǐn)?shù)為3%的接種量接入經(jīng)過滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為35°C，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)至0D6QQ為0.5時(shí)，加入終濃度為5mmol/L的誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在溫度為20°C，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)10h，收集得到含煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵液;將發(fā)酵液放置于離心管中，在溫度為4°C、轉(zhuǎn)速為10000r/min條件下離心攪拌5min，收集含有煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉(zhuǎn)移酶的菌體沉淀，向菌體沉淀中加入PH7.5的磷酸鹽緩沖溶液，用移液槍吹吸數(shù)次使菌體均勻懸浮，再用超聲波破碎菌體;破壁后的菌體在轉(zhuǎn)速為10000r/min，溫度4°C條件下，冷凍離心15min，收集上清液，上清液即為NMN轉(zhuǎn)移酶的粗酶液。
[0038]步驟二，將制備得到的匪N轉(zhuǎn)移酶的粗酶液分裝于多個(gè)2mL的離心管中，向其中一部分離心管中加入10yL的保護(hù)劑，向另一部分離心管中加入10yL的雙蒸水；
[0039]步驟三，向兩部分離心管中分別加入lmol/L PH7.5的Tris-HCl緩沖液、煙酰胺單核苷酸腺苷(匪幻1112+，分別混勻后置于30°(:的水浴鍋中反應(yīng)111，加入10(^1質(zhì)量濃度為0.155mol/L為乙二胺四乙酸溶液(EDTA)反應(yīng)8min后，在轉(zhuǎn)速為6000r/min條件下離心3min，去除沉淀，取上清液；
[0040]步驟四，取上清液并在340nm處測定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值ODmq，吸光值ODmq代表NMN轉(zhuǎn)移酶酶活力的大??；
[0041 ] 步驟五，以未加保護(hù)劑的NMN轉(zhuǎn)移酶的粗酶液為對照100%，得到相對酶活力。
[0042]實(shí)施例二作用與效果
[0043]根據(jù)本實(shí)施例的NMN轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法，其中添加了本實(shí)施例成分含量的復(fù)合穩(wěn)定劑作為保護(hù)劑的相對酶活為102.90%，未添加保護(hù)劑的酶活為15.8%。
[0044]實(shí)施例三
[0045]1、復(fù)合穩(wěn)定劑
[0046]該復(fù)合穩(wěn)定劑包含:濃度為0.5g/L的山梨醇，濃度為1.5g/L的海藻酸鈉，體積分?jǐn)?shù)為1.0%的二甲基亞砜。
[0047]2、酶活測定方法
[0048]采用上述成分含量的復(fù)合穩(wěn)定劑作為保護(hù)劑來提高NMN轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定性，NMN轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法包括以下步驟:
[0049]步驟一，制備NMN轉(zhuǎn)移酶的粗酶液:將大腸桿菌劃線接種到固體培養(yǎng)基上，在40°C的條件下培養(yǎng)18h，得到含有大腸桿菌的固體培養(yǎng)基;取一定量的LB培養(yǎng)基溶于雙蒸水中，調(diào)節(jié)其PH值為8.0，在121°C條件下滅菌30min，得到濃度為30g/L的活化液;在無菌環(huán)境下從固體培養(yǎng)基上挑取大腸桿菌接種到活化液中，并加入終濃度為30yg/ml的硫酸卡那霉素，在40°C條件下培養(yǎng)過夜，得到含有活化的大腸桿菌菌體的液體;將含有活化的大腸桿菌菌體的液體按照體積分?jǐn)?shù)為5%的接種量接入經(jīng)過滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為40°C，搖床轉(zhuǎn)速為190r/min的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)至OD6qq為0.7時(shí)，加入終濃度為10mmol/L的誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在溫度為30°C，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)12h，收集得到含煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵液;將發(fā)酵液放置于離心管中，在溫度為4°C、轉(zhuǎn)速為12000r/min條件下離心攪拌lOmin，收集含有煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉(zhuǎn)移酶的菌體沉淀，向菌體沉淀中加入PH7.5的磷酸鹽緩沖溶液，用移液槍吹吸數(shù)次使菌體均勻懸浮，再用超聲波破碎菌體;破壁后的菌體在轉(zhuǎn)速為8000r/min，溫度4°C條件下，冷凍離心30min，收集上清液，上清液即為NMN轉(zhuǎn)移酶的粗酶液。
[0050]步驟二，將制備得到的NMN轉(zhuǎn)移酶的粗酶液分裝于多個(gè)1.5mL的離心管中，向其中一部分離心管中加入10yL的保護(hù)劑，向另一部分離心管中加入10yL的雙蒸水；
[0051 ] 步驟三，向兩部分離心管中分別加入lmol/L PH7.5的Tris-HCl緩沖液、煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)、Mn2+，分別混勻后置于40 V的水浴鍋中反應(yīng)1.5h，加入10yL質(zhì)量濃度為
0.155mol/L為乙二胺四乙酸溶液(EDTA)反應(yīng)1min后，在轉(zhuǎn)速為4000r/min條件下離心5min，去除沉淀，取上清液；
[0052]步驟四，取上清液并在340nm處測定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值ODmq，吸光值ODmq代表NMN轉(zhuǎn)移酶酶活力的大??；
[0053]步驟五，以未加保護(hù)劑的NMN轉(zhuǎn)移酶的粗酶液為對照100%，得到相對酶活力。
[0054]實(shí)施例三作用與效果
[0055]根據(jù)本實(shí)施例的NMN轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法，其中添加了本實(shí)施例成分含量的復(fù)合穩(wěn)定劑作為保護(hù)劑的相對酶活為91.62%，未添加保護(hù)劑的酶活為15.8%。
[0056]以上實(shí)施例僅為本發(fā)明構(gòu)思下的基本說明，不對本發(fā)明進(jìn)行限制。而依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案所作的任何等效變換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種復(fù)合穩(wěn)定劑，用于提高NMN轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定性，其特征在于，包含: 濃度為0.5?1.5g/L的山梨醇，濃度為0.5?1.5g/L的海藻酸鈉，體積分?jǐn)?shù)為0.5?1.5%的二甲基亞砜。2.—種匪N轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法，采用權(quán)利要求1所述的復(fù)合穩(wěn)定劑作為保護(hù)劑，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一，制備NMN轉(zhuǎn)移酶的粗酶液； 步驟二，將制備得到的所述粗酶液分裝于多個(gè)I?2mL的離心管中，向其中一部分離心管中加入預(yù)定量的所述保護(hù)劑，向另一部分離心管中加入與所述保護(hù)劑相同的量的雙蒸水； 步驟三，向兩部分離心管中分別加入等量的緩沖溶液、底物以及金屬離子，分別混勻后置于30?40 °C的水浴鍋中反應(yīng)I?2h，加入乙二胺四乙酸(EDTA)反應(yīng)5?1min后，在轉(zhuǎn)速為4000?8000r/min條件下離心I?5min，去除沉淀，取上清液； 步驟四，取所述上清液并在340nm處測定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值OD34Q，所述吸光值OD34Q代表NMN轉(zhuǎn)移酶酶活力的大?。? 步驟五，以未加所述保護(hù)劑的所述粗酶液為對照100%，得到相對酶活力。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述NMN轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法，其特征在于: 其中，在步驟一中，所述NMN轉(zhuǎn)移酶的粗酶液的制備方法包括以下子步驟: 子步驟一，將大腸桿菌劃線接種到固體培養(yǎng)基上，在35?40 0C的條件下培養(yǎng)12?18h，得到含有大腸桿菌的固體培養(yǎng)基； 子步驟二，取一定量的LB培養(yǎng)基溶于雙蒸水中，調(diào)節(jié)其pH值為6.0?8.0，在121°C條件下滅菌15?30min，得到濃度為20?30g/L的活化液； 子步驟三，在無菌環(huán)境下從所述固體培養(yǎng)基上挑取大腸桿菌接種到所述活化液中，并加入終濃度為20?40yg/ml的硫酸卡那霉素，在35?40°C條件下培養(yǎng)過夜，得到含有活化的大腸桿菌菌體的液體； 子步驟四，將所述含有活化的大腸桿菌菌體的液體按照體積分?jǐn)?shù)為I?5%的接種量接入經(jīng)過滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為35?40 °C，搖床轉(zhuǎn)速為180?200r/min的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)至0D6QQ為0.5?0.7時(shí)，加入終濃度為5?10mmol/L的誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在溫度為20?300C，搖床轉(zhuǎn)速為150?200r/min條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)8?12h，收集得到含煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵液； 子步驟五，將所述發(fā)酵液放置于離心管中，在8000?12000r/min條件下離心攪拌5?lOmin，收集含有煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉(zhuǎn)移酶的菌體沉淀。 子步驟六，向所述菌體沉淀中加入PH7.5的磷酸鹽緩沖溶液，用移液槍吹吸數(shù)次使菌體均勾懸浮，再用超聲波破碎所述菌體； 子步驟七，破壁后的所述菌體在轉(zhuǎn)速為8000?12000r/min，溫度4°C條件下，冷凍離心15?30min，收集上清液，所述上清液為所述NMN轉(zhuǎn)移酶的粗酶液。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述NMN轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法，其特征在于: 其中，在步驟二中，所述預(yù)定量為10yL。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述NMN轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法，其特征在于: 其中，在步驟三中，所述緩沖溶液為Tris-HCl緩沖液，所述底物為煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)，所述金屬離子為Mn2+。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述NMN轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法，其特征在于: 其中，在步驟三中，所述乙二胺四乙酸的質(zhì)量濃度為0.155mol/L，加入的體積為lOOyL。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述NMN轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法，其特征在于: 其中，在子步驟一中，所述固體培養(yǎng)基的制備方法為:將濃度為25g/L的LB培養(yǎng)基和濃度為20g/L的瓊脂用雙蒸水溶解于500ml的錐形瓶中，加入NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0，在121°C條件下高壓滅菌20min，得到所述固體培養(yǎng)基。
【文檔編號(hào)】C12N9/12GK106085996SQ201610435404
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月17日
【發(fā)明人】段琳琳, 李紅梅, 袁飛飛, 亢涵
【申請人】上海理工大學(xué)