一種基于基因芯片同時鑒定三種伊蚊的探針及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測鑒定領(lǐng)域，涉及一種針對白紋伊蚊、埃及伊蚊、東鄉(xiāng)伊蚊3種 伊蚊的基因芯片檢測鑒定探針及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 伊蚊，蚊科（Culicidae)庫蚊亞科（Culicinae)伊蚊屬（Aedes)昆蟲的統(tǒng)稱。分布 于全世界，是蚊科中最大一屬，近1000種，中國有100余種。伊蚊會傳播很多疾病，對人類 的健康帶來危害，黃熱病與登革熱就主要通過伊蚊傳播。黃熱病是由黃熱病病毒引起的急 性傳染病，埃及伊蚊是主要傳播媒介。登革熱是一種急性傳染病，已知12種伊蚊可傳播本 病，但最主要的是埃及伊蚊和白紋伊蚊。東鄉(xiāng)伊蚊幼蟲多孳生在海濱巖穴、石洞以及容器、 船艙等的積水中，是馬來絲蟲病和乙型腦炎的傳播媒介。
[0003] 目前，口岸媒介生物的傳統(tǒng)鑒定方法為形態(tài)學(xué)鑒定方法，主要是依據(jù)有形態(tài)學(xué)鑒 定經(jīng)驗、具有媒介生物形態(tài)鑒定知識的實驗室專業(yè)人員根據(jù)醫(yī)學(xué)媒介分類檢索表進(jìn)行種類 鑒定。受限于鑒定人員的經(jīng)驗積累、專業(yè)要求、標(biāo)本完整性與發(fā)育階段，傳統(tǒng)媒介蚊種鑒定 方法存在著鑒定專家數(shù)量有限、鑒定周期長、鑒定效率低等問題。比如，首先，傳統(tǒng)的分類方 法在鑒定蚊蟲復(fù)合體、近緣種存在一定困難；其次，在國境口岸蚊媒監(jiān)測和交通工具等的衛(wèi) 生檢疫工作中，受不同的采集工具、采集方法的影響以及標(biāo)本運(yùn)送過程的限制，當(dāng)專業(yè)技術(shù) 人員鑒定時，許多蚊蟲標(biāo)本已經(jīng)是殘缺不全，往往是腹部鱗片或翅等重要體征脫落或受損， 難以進(jìn)行準(zhǔn)確的形態(tài)分類；再次，對于截獲的卵、幼蟲和蛹，整個鑒定過程大致需要數(shù)周的 時間，由于鑒定特征細(xì)微難辨，往往需要培養(yǎng)至成蟲再鑒定，如果是少見的國外種類，還要 請國外專家協(xié)助鑒定，鑒定所需的時間就更多了。
[0004] 近年來，分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，顯示了在蚊類鑒別應(yīng)用中的極大潛力，形成 了許多分子鑒別方法，成為解決當(dāng)前蚊蟲分類難題的新鑰匙。
[0005] 基因芯片技術(shù)系指將大量探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜 交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息?；蛐?片主要用于基因檢測工作。基因芯片技術(shù)由于同時將大量探針固定于支持物上，所以可以 一次性對樣品大量序列進(jìn)行檢測和分析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)操作繁雜、自 動化程度低、操作序列數(shù)量少、檢測效率低等不足。目前基于基因芯片鑒定蚊蟲報道的技術(shù) 極少，僅能搜索到趙明等人建立的D NA條形碼芯片的初步研究，但是芯片的設(shè)計與研制主 要通過虛擬電子雜交及驗證，結(jié)果與實物的雜交還是有很大的差異。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明公開了一種基于基因芯片同時鑒定三種 伊蚊的探針，包括下列三種探針：
[0007] 白紋伊蚊：CTTTAACACTGCTGCTITCTAGITC ;
[0008] 埃及伊蚊：GTGCTGAACTTAGCCACCCTGGT ;
[0009] 東鄉(xiāng)伊蚊：AACTCTCCTGCTITCAAGTAGT。
[0010] 本發(fā)明的內(nèi)容還包括一種用于同時鑒定三種伊蚊的基因芯片，所述基因芯片含有 上述二種探針。
[0011] 本發(fā)明的內(nèi)容還包括一種用于同時鑒定三種伊蚊的基因芯片試劑盒，所述基因芯 片含有上述三種探針。
[0012] 本發(fā)明的內(nèi)容還包括上述基因芯片試劑盒在檢測和鑒定白紋伊蚊、埃及伊蚊、東 鄉(xiāng)伊蚊三種伊蚊中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明根據(jù)不同伊蚊的基因序列，選擇基因序列保守位置并設(shè)計特異性寡核苷酸 檢測探針，利用分子生物學(xué)的方法進(jìn)行蚊類鑒別，克服了傳統(tǒng)媒介蚊種鑒定方法存在著鑒 定專家數(shù)量有限、鑒定周期長、鑒定效率低等問題，實現(xiàn)了對白紋伊蚊、埃及伊蚊、東鄉(xiāng)伊蚊 三種伊蚊快速、準(zhǔn)確的鑒定。經(jīng)過實驗檢測，本發(fā)明的基因芯片及試劑盒特異性強(qiáng)，靈敏度 高，可以很好的應(yīng)用于口岸媒介生物鑒定工作。
[0014] 為了更好地理解和實施，下面結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明。
【附圖說明】
[0015] 圖1實施例1的基因芯片的點(diǎn)樣位置示意圖，其中灰色點(diǎn)為陽性質(zhì)控；黑色空心點(diǎn) 為陰性質(zhì)控；黑色實心點(diǎn)為檢測樣本。檢測樣本和質(zhì)控點(diǎn)平行兩組，檢測樣本從左到右分別 為白紋伊蚊、東鄉(xiāng)伊蚊、埃及伊蚊。
[0016] 圖2是特異性檢測中，樣品為白紋伊蚊的基因芯片雜交結(jié)果圖，結(jié)果證明本發(fā)明 的基因芯片可以特異性識別樣品中的白紋伊蚊基因。
[0017] 圖3是特異性檢測中，樣品為東鄉(xiāng)伊蚊的基因芯片雜交結(jié)果圖，結(jié)果證明本發(fā)明 的基因芯片可以特異性識別樣品中的東鄉(xiāng)伊蚊基因。
[0018] 圖4是特異性檢測中，樣品為埃及伊蚊的基因芯片雜交結(jié)果圖，結(jié)果證明本發(fā)明 的基因芯片可以特異性識別樣品中的埃及伊蚊基因。
[0019] 圖5為本發(fā)明的基因芯片針對白紋伊蚊的靈敏度檢測結(jié)果，其中1-6號為檢測模 板梯度依次2倍梯度稀釋；
[0020] 圖6為本發(fā)明的基因芯片針對東鄉(xiāng)伊蚊的靈敏度檢測結(jié)果，其中1-6號為檢測模 板梯度依次2倍梯度稀釋；
[0021] 圖7為本發(fā)明的基因芯片針對埃及伊蚊的靈敏度檢測結(jié)果，其中1-6號為檢測模 板梯度依次2倍梯度稀釋； 具體實施例
[0022] 【實施例1基因芯片的制備】
[0023] 本實施例的制備方法如下：
[0024] 1、探針的設(shè)計：首先從NCBI基因數(shù)據(jù)庫中下載相應(yīng)的基因序列，使用軟件對序列 進(jìn)行比對。根據(jù)比對結(jié)果在基因序列保守位置設(shè)計特異性寡核苷酸檢測探針（表1)、質(zhì)控 探針（表2)和特異性引物（表3)。
[0025] 2、探針的合成：每條探針的3'端加入6個堿基T且3'末端氨基修飾作為連接 臂，使其固定在芯片上；質(zhì)控探針除了 3'末端進(jìn)行氨基修飾外，5'端同時標(biāo)記生物素。
[0026] 3、芯片的制備：將合成的探針用去離子水稀釋成100uM，分別取lOul探針溶液和 10ul體積芯片點(diǎn)樣液混勻，使探針終濃度為50uM。其中，點(diǎn)樣位置如圖1所示，灰色點(diǎn)為陽 性質(zhì)控；黑色空心點(diǎn)為陰性質(zhì)控；黑色實心點(diǎn)為檢測樣本。檢測樣本和質(zhì)控點(diǎn)平行兩組，檢 測樣本從左到右分別為白紋伊蚊、東鄉(xiāng)伊蚊、埃及伊蚊。點(diǎn)樣過程保持一定濕度，點(diǎn)樣完成 后將芯片置于干燥器中避光常溫靜置24小時。點(diǎn)制好的芯片常溫干燥保存。
[0027] 其中，用于檢測鑒定3種伊蚊的寡核苷酸探針和質(zhì)控探針如下：
[0028] 表1檢測探針
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[0034] 利用基因芯片檢測鑒定上述三種伊蚊的使用方法步驟如下：
[0035] 1、提取待測樣本的模板DNA :使用商品化動物組織基因組DNA提取試劑盒提取蚊 蟲 DNA。
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