一種人源諾如病毒的檢測試劑盒及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種人源諾如病毒的檢測試劑盒，所述檢測試劑盒至少包括如下試劑：用于檢測GI組人源諾如病毒的第一引物對和第一引物對配套TaqMan探針、用于檢測GII組人源諾如病毒的第二引物對和第二引物對配套TaqMan探針、一步反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑。本發(fā)明還提供了該檢測試劑盒的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的檢測試劑盒特異性好，靈敏度高，使用簡便，能高效檢測人源諾如病毒。
【專利說明】
一種人源諾如病毒的檢測試劑盒及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基于病毒特異性受體捕獲的高效定量 檢測人源諾如病毒的原位捕獲檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 諾如病毒(noroviruses，NoVs)又稱諾瓦克病毒(Norwalk Virus)、類諾瓦克病毒 (Norwalk-like Virus)或小圓狀病毒（Small Round Structured Virus，SRSV)，隸屬于嵌 杯科諾如病毒屬成員，為單鏈RNA病毒。1972年Kapikian等利用免疫電鏡的方法在1968年美 國俄亥俄州Norwalk鎮(zhèn)暴發(fā)的急性冬季嘔吐癥樣品中首次發(fā)現(xiàn)了該病毒，并將其命名為 Norwalk virus。此后陸續(xù)出現(xiàn)關(guān)于該病毒暴發(fā)的報道，導(dǎo)致該病毒命名混亂。2002年，國際 病毒分類委員會(the International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)將其歸 為嵌杯狀病毒科，并正式更名為諾如病毒。
[0003] 根據(jù)病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白核酸序列的不同，NoVs被分為7個組(GI-GVII)，其中GI、 GII和GIV組NoVs可以感染人類，被稱為人源諾如病毒(human noroviruses，HuNoVs)。流行 病學(xué)數(shù)據(jù)表明：HuN〇Vs(GI和GII組為主)是造成急性非細(xì)菌性胃腸炎的最主要元兇，具有發(fā) 病率高、感染劑量低、對外界抵抗力強(qiáng)等特點。美國疾控中心對該國的疫情監(jiān)測結(jié)果表明， 2009-2010年間共暴發(fā)1527件食源性疾病事件，其中790例疫情的病原體是HuNoVs，占總暴 發(fā)事件的42 %。2012年底，陸續(xù)在英國、荷蘭、日本等國暴發(fā)了不同等級的HuNoVs流行事件。 HuNoVs呈現(xiàn)出全世界范圍頻發(fā)且各地發(fā)病率出現(xiàn)逐年增高的趨勢，與人們對其認(rèn)識的深 入、檢測方法日益發(fā)展完善、靈敏度顯著提高有關(guān)。
[0004] 目前，HuNoVs的檢測方法建立在病毒粒子外形、特異性核酸區(qū)段和主要抗原決定 簇的基礎(chǔ)上，主要有電鏡法、免疫學(xué)方法和分子檢測方法等。中國專利CN201510487540.1、 CN201510179138.7、CN201310553678.8、CN201310271924.0 等都是用于 NoVs 的分子檢測。但 是，這些發(fā)明專利和目前常用的HuNoVs檢測方法的缺陷主要在于：1)均需要通過專門抽提 RNA的步驟獲得病毒核酸，費時費力;2)無法區(qū)別擴(kuò)增模板RNA來源于感染性的NoVs粒子，還 是樣品中游離的病毒RNA;3)環(huán)境和食品樣本中通常含有一些PCR抑制劑，容易造成假陽性 結(jié)果。因此，研發(fā)一種靈敏度高，準(zhǔn)確率高，操作簡單，耗時短，且高通量HuNoVs的檢測試劑 盒具有良好的應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種新的人源諾如病毒的檢測試劑 盒，本所提供的檢測試劑盒特異性好，靈敏度高，使用簡便，能高效檢測人源諾如病毒。
[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種人源諾如病毒的檢測試劑盒，所 述檢測試劑盒至少包括如下試劑:用于檢測GI組人源諾如病毒的第一引物對和第一引物對 配套TaqMan探針、用于檢測GII組人源諾如病毒的第二引物對和第二引物對配套TaqMan探 針、一步反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑；
[0007] 其中，第一引物對的引物一的序列如SEQ ID NO: 1所示，第一引物對的引物二的序 列如SEQ ID N0:2所示；第一引物對配套TaqMan探針的探針三的序列如SEQ ID N0:3所示， 第一引物對配套TaqMan探針的探針?biāo)牡男蛄腥鏢EQ ID NO:4所示;第二引物對的引物五的 序列如SEQ ID N0:5所示，第二引物對的引物六的序列如SEQ ID N0:6所示；第二引物對配 套TaqMan探針的探針七的序列如SEQ ID N0:7所示。
[0008] 優(yōu)選地，所述TaqMan探針的5 '端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)FAM，3 '端標(biāo)記有熒光淬滅基 團(tuán)擺RA〇
[0009] 優(yōu)選地，所述檢測試劑盒還包括III型豬腸胃粘膜提取物和牛血清蛋白/脫脂奶 粉。
[0010] 優(yōu)選地，所述III型豬腸胃粘膜提取物中含有人源諾如病毒的特異性受體。
[0011] 優(yōu)選地，所述檢測試劑盒還包括酶標(biāo)條、酶標(biāo)框、聚烯烴膜、吸水濾紙、磷酸鹽緩沖 液、碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液和DEPC水/ddH 20。
[0012] 本發(fā)明還提供了本發(fā)明所提供的的檢測試劑盒的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括如下步驟：
[0013] 1)將III型豬腸胃粘膜提取物包被到酶標(biāo)板上；
[0014] 2)封閉酶標(biāo)板，防止酶標(biāo)板非特異性吸附病毒粒子；
[0015] 3)將待測樣品加入到酶標(biāo)板；
[0016] 4)高溫裂解釋放RNA;
[0017] 5)加入第一引物對、第一引物對配套TaqMan探針、第二引物對、第二引物對配套 TaqMan探針以及一步反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑進(jìn)行反應(yīng)；
[0018] 6)進(jìn)行 RT-qPCR 檢測。
[0019] 優(yōu)選地，檢測GI組人源諾如病毒和GII組人源諾如病毒的清洗酶標(biāo)板和稀釋病毒 的緩沖液分別為pH=3.0和pH=7.0。
[0020] 優(yōu)選地，高溫裂解釋放RNA的溫度為95°C。
[0021] 優(yōu)選地，RT-qPCR檢測的反應(yīng)條件為:第一階段42°C反轉(zhuǎn)錄lOmin，第二階段95°C預(yù) 變性30s;第三階段95°C變性15s，53°C退火15s，60°C延伸30s，擴(kuò)增45個循環(huán);4°C保溫;并在 第二階段進(jìn)行FAM焚光彳目號米集。
[0022]本發(fā)明根據(jù)病毒的序列保守區(qū)域RNA依賴的RNA聚合酶區(qū)，使用Primer5.0軟件設(shè) 計了特異性引物，通過使用原位捕獲反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)的方 法，對人源諾如病毒的感染進(jìn)行輔助診斷，以及該病毒的流行病學(xué)研究。
[0023]本發(fā)明的要點在于:人源諾如病毒特異性受體附著于酶標(biāo)板上，樣品中病毒可與 其受體特異性結(jié)合;在洗滌酶標(biāo)板的過程中可以清除雜質(zhì)，保留與特異性受體結(jié)合的病毒 粒子，對檢測目標(biāo)物進(jìn)行第一步的篩選;95°C釋放病毒核酸;所設(shè)計引物和TaqMan探針具有 高度特異性，對檢測目標(biāo)物進(jìn)行再次確認(rèn)。此發(fā)明免去了純化病毒RNA的繁雜步驟，不僅大 大降低了試劑成本和人工成本，而且也提高了檢測的靈敏度和特異性，操作簡便。
[0024]本發(fā)明的有益效果為：1)檢測方法操作簡便，且可規(guī)?；绦蛐圆僮?2)檢測方法 靈敏度高、特異性強(qiáng);3)檢測結(jié)果可靠、直觀;4)檢測成本低。
[0025]以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說明，以 充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。
【附圖說明】
[0026]圖1為本發(fā)明實施例2中pH值對檢測GI組和GII組病毒的影響；
[0027]圖2為本發(fā)明實施例3中與傳統(tǒng)RT-qPCR方法進(jìn)行檢測限的比較(GI組）；
[0028]圖3為本發(fā)明實施例3中與傳統(tǒng)RT-qPCR方法進(jìn)行檢測限的比較(GII組）；
[0029] 圖4為本發(fā)明實施例4中檢測GI組病毒人工污染的河水的擴(kuò)增曲線；
[0030] 圖5為本發(fā)明實施例4中檢測GII組病毒人工污染的河水的擴(kuò)增曲線；
[0031] 圖6為本發(fā)明實施例5中檢測疾病預(yù)防控制中心臨床樣本的擴(kuò)增曲線；
[0032] 圖7為本發(fā)明實施例6中檢測人工污染牡蠣組織的擴(kuò)增曲線；
[0033] 圖8為本發(fā)明實施例7中檢測檢測市售牡蠣組織的擴(kuò)增曲線。
【具體實施方式】
[0034] 本發(fā)明實施例中所用試劑均可通過市售獲得，所用人源諾如病毒臨床樣本來自北 京疾病預(yù)防控制中心（Center for Disease Control and Prevention,CDC)和湖州疾病預(yù) 防控制中心。
[0035] 實施例1引物和TaqMan探針
[0036] 獲取本發(fā)明中引物和TaqMan探針的方法:使用Mega 5.0軟件對在GenBank中現(xiàn)有 人源諾如病毒的基因序列進(jìn)行序列的生物信息學(xué)分析，通過同源性比較，獲取保守區(qū)域;應(yīng) 用ABI 引物合成軟件（Primer Express version 2.0，Applied Biosystems)設(shè)計了擴(kuò)增保 守區(qū)基因片段的引物及TaqMan探針;所設(shè)計的引物和探針均具有互補(bǔ)于人源諾如病毒特異 性基因片段的序列，應(yīng)用從351/?1'；[11161-131^\31'(111^。://?^.11(313；[.111111.11；[11.80￥/131^\31')對所 設(shè)計合成的引物及TaqMan探針進(jìn)行特異性及可用性檢測，確保與其它病原體的核酸序列沒 有同源性;PGM中含有人源諾如病毒的受體，在孵育過程中病毒與其受體特異性結(jié)合，并對 結(jié)合物進(jìn)行洗滌，提高檢測結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確度。
[0037]實施例2檢測試劑盒及檢測方法
[0038]檢測試劑盒的試劑包括:酶標(biāo)條、酶標(biāo)框、MicroAmp聚烯烴膜、吸水濾紙、III型豬 腸胃粘膜提取物（porcine gastric mucin,PGM)、牛血清蛋白（bovine serum albumin, BSA)、第一引物對、第一引物對配套TaqMan探針、第二引物對、第二引物對配套TaqMan探針、 一步反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR)酶、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline， PBS)、碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液和DEPC水。
[0039]其中，第一引物對的引物一的序列如SEQ ID NO: 1所示，第一引物對的引物二的序 列如SEQ ID N0:2所示；第一引物對配套TaqMan探針的探針三的序列如SEQ ID N0:3所示， 第一引物對配套TaqMan探針的探針?biāo)牡男蛄腥鏢EQ ID NO:4所示;第二引物對的引物五的 序列如SEQ ID N0:5所示，第二引物對的引物六的序列如SEQ ID N0:6所示；第二引物對配 套TaqMan探針的探針七的序列如SEQ ID N0: 7所示。TaqMan探針的5'端標(biāo)記有熒光報告基 團(tuán)FAM，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。引物一、引物二、TaqMan探針三、TaqMan探針?biāo)?、弓?物五、引物六、TaqMan探針七的濃度都為10 .ΟμΜ。III型豬腸胃粘膜提取物中含有人源諾如 病毒的特異性受體(如血清組織抗原，Histo-blood group antigens)。
[0040] 利用以上引物TaqMan探針可檢測兩組流行基因型(GI組和GII組)人源諾如病毒毒 株，第一引物對和第一引物對配套TaqMan探針檢測GI組人源諾如病毒，第二引物對和第二 引物對配套TaqMan探針檢測GII組人源諾如病毒。
[0041 ]使用該檢測試劑盒的檢測方法具體包括如下步驟：
[0042] 1)PGM包被到酶標(biāo)板上
[0043] 用碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液稀釋PGM，至終濃度為1. Omg/mL，以100.0yL-200.0μ L/孔將稀釋后的PGM添加到酶標(biāo)孔內(nèi)；4°C孵育過夜。
[0044] 2)封閉酶標(biāo)板
[0045]以roS溶解BSA，至終濃度為1.0% (w/v)。取出包被過夜的酶標(biāo)板，PBS洗滌3次，以 120.0yL-230.0μ!7孔將終濃度1.0 %的BSA添加到酶標(biāo)孔內(nèi)，37 °C孵育30min-60min;作為該 具體實施例的變形，封閉液亦可使用終濃度約為5.0%的脫脂奶粉。
[0046] 3)加入待測樣品
[0047] 取出酶標(biāo)板，PBS洗滌3次，以100.0yL-200.0yL/孔將待測樣品加入到酶標(biāo)板孔中， 37°C孵育30min-60min。其中，檢測GI組病毒和GII組病毒清洗酶標(biāo)板和稀釋病毒的PBS分別 為pH = 3.0和pH= 7.0(ρΗ值對檢測GI組和GII組病毒的影響如圖1所示，在相應(yīng)的pH條件下 可提高病毒粒子與病毒特異性受體的結(jié)合率）。
[0048] 4)高溫裂解釋放RNA
[0049] 取出酶標(biāo)板，棄掉酶標(biāo)板孔中液體，PBS洗滌3次，以8.5μ!7孔加入DEPC水，并以 MicroAmp 聚稀經(jīng)膜封蓋。95°C 孵育 5min-10min，4°C 冷卻 5min。
[0050] 5)RT-qPCR反應(yīng)液配制
[0051 ] 反應(yīng)液配方如下：10. ΟμΜ上下游引物各0.5yL，10. ΟμΜ TaqMan探針1. OyL，2 X反應(yīng) 緩沖液12.5yL，一步法RT-qPCR反應(yīng)酶2. OyL(包括逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶），合計16.5yL。以 16.5μ!7孔將上述反應(yīng)液加入酶標(biāo)孔，并混合均勻。將酶標(biāo)條用新的MicroAmp聚烯烴膜進(jìn)行 封蓋。
[0052] 6)RT_qPCR 檢測
[0053]將酶標(biāo)條放入熒光定量PCR儀中，選用FAM熒光通道。反應(yīng)條件如下：第一階段42°C 反轉(zhuǎn)錄10min，第二階段95°C預(yù)變性30s;第三階段95°C變性158,53°(：退火158,60°(：延伸 30s，擴(kuò)增45個循環(huán);4°C保溫;在第三階段進(jìn)行FAM熒光信號采集。
[0054] 實施例3與傳統(tǒng)RT-qPCR方法比較
[0055]以PBS對60.0 yLGI組人源諾如病毒陽性樣本進(jìn)行梯度稀釋，稀釋倍數(shù)從101到106， 每個稀釋度體積為600.0此，平均分為2份；1份用實施例2提供的試劑盒和方法進(jìn)行檢測，每 個樣本三個重復(fù);另1份用病毒RNA抽提試劑盒抽提RNA，RNA溶解于30 .OyLDPEC水中，取8.5μ LRNA進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，每個樣本3個重復(fù)。結(jié)果如圖2所示，當(dāng)稀釋倍數(shù)達(dá)到10 5時，實施例2 提供的試劑盒和方法可以檢測到GI組病毒，而傳統(tǒng)RT-qPCR方法無法檢測到，表明使用本發(fā) 明可有效地提高GI組病毒的檢測限。
[0056]以PBS對60.0 yLGII組人源諾如病毒陽性樣本進(jìn)行梯度稀釋，稀釋倍數(shù)從101到106， 每個稀釋度體積為600.0此，平均分為2份，1份用實施例2提供的試劑盒和方法進(jìn)行檢測，每 個樣本3個重復(fù)；另1份用病毒RNA抽提試劑盒抽提RNA，RNA溶解于30yLDPEC水中，取8.5μ LRNA進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，每個樣本3個重復(fù)。結(jié)果如圖3所示，當(dāng)稀釋倍數(shù)達(dá)到10 5和106時，實 施例2提供的試劑盒和方法均可檢測到GII組病毒，而傳統(tǒng)RT-qPCR方法無法檢測到，表明使 用本發(fā)明可有效地提高GII組病毒的檢測限。
[0057]實施例4檢測人工污染的河水
[0058]河水取樣:選取黃浦江某支流的河水進(jìn)行隨機(jī)取樣。采用50mL的塑料離心管進(jìn)行 采集，每管30mL左右，共取3個平行水樣，從3個平行水樣中各取5mL于新管中混合均勻，作為 實驗水樣，儲存于4 °C冰箱待用。
[0059] 人工污染:分別用GI組和GII組人源諾如病毒陽性樣本對河水進(jìn)行污染，即用河水 進(jìn)行病毒稀釋，共100倍和1000倍兩個稀釋度，并設(shè)置PBS稀釋病毒作為陽性對照、僅檢測河 水作為陰性對照，采用實施例2提供的試劑盒和方法進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖4和圖5所示，其中 A-E代表的分別是A:以PBS稀釋100倍的病毒陽性樣本;B:以PBS稀釋1000倍的病毒陽性樣 本;C:以河水稀釋100倍的病毒陽性樣本;D:以河水稀釋1000倍的病毒陽性樣本;E:河水。由 結(jié)果可知，本發(fā)明可高效檢出人工污染的河水中的HuNoVs，且結(jié)果穩(wěn)定。
[0060] 實施例5檢測人源諾如病毒臨床樣本
[0061]選取來自北京和湖州CDC的共10個人源諾如病毒臨床樣本進(jìn)行檢測，取用人源諾 如病毒臨床樣本3.OyL，用PBS稀釋100倍，每個樣品三個重復(fù)，采用實施例2提供的試劑盒和 方法進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果穩(wěn)定(見圖6)，表明相關(guān)引物和探針具有良好的特異性。
[0062] 實施例6檢測人工污染的牡蠣樣品
[0063] 模擬牡蠣生長環(huán)境，經(jīng)過夜預(yù)飼養(yǎng)挑后選30只有活力的牡蠣隨機(jī)分為兩組，分別 飼養(yǎng)于15L海水中。將106拷貝的人源諾如病毒陽性臨床樣本分別投入于兩組人工模擬牡蠣 飼養(yǎng)水體。按照上述飼養(yǎng)方式飼養(yǎng)牡蠣24h后，取出牡蠣撬殼。取牡蠣不同組織(鰓、胃、消化 盲囊及其他）以1:4的比例加入生理鹽水，均質(zhì)，與50%甘油1:1混合后分裝至2.0mL EP管 中，儲存于-80 °C。
[0064] 取0.5mL組織勻漿液加入1. OmL蛋白酶K(0.2mg/mL)充分混勻；37°C搖床孵育 60min; 60 °C 水浴 15min; 12000 X g離心 15min，收集上清 1 · OmL。以 100 · 0yL-200 · OyL/孔上清 液加入酶標(biāo)孔中，采用實施例2提供的試劑盒和方法進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖7所示，GI組和GII 組病毒在牡蠣的鰓、胃、消化盲囊及其他組織中均呈現(xiàn)陽性檢測結(jié)果。
[0065]實施例7檢測市售的牡蠣樣品
[0066] 市場上隨機(jī)購買新鮮的牡蠣樣品，取牡蠣不同組織(鰓、胃、消化盲囊及其他）以1: 4的比例加入生理鹽水，均質(zhì)，與50 %甘油1:1混合后分裝至2. OmLEP管中，儲存于-80 °C。取 0.5mL組織勻漿液加入1. OmL蛋白酶K(0.2mg/mL)充分混勻；37°C搖床孵育60min; 60°C水浴 15min; 12000 X g離心15min，收集上清1 .OmL。以100.0yL_200 .OyL/孔上清液加入酶標(biāo)孔中， 采用實施例2提供的試劑盒和方法進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖8所示，對于GI組病毒而言，在牡蠣的 鰓、胃、消化盲囊中均有陽性擴(kuò)增;對于GII組病毒而言，并無陽性結(jié)果。
[0067] 以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無 需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù) 人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的 技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種人源諾如病毒的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒至少包括如下試劑： 用于檢測GI組人源諾如病毒的第一引物對和第一引物對配套TaqMan探針、用于檢測GII組 人源諾如病毒的第二引物對和第二引物對配套TaqMan探針、一步反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試 劑； 其中，第一引物對的引物一的序列如SEQ ID NO: 1所示，第一引物對的引物二的序列如 SEQ ID NO: 2所示；第一引物對配套TaqMan探針的探針三的序列如SEQ ID NO: 3所示，第一 引物對配套TaqMan探針的探針?biāo)牡男蛄腥鏢EQ ID NO:4所示；第二引物對的引物五的序列 如SEQ ID N0:5所示，第二引物對的引物六的序列如SEQ ID N0:6所示；第二引物對配套 TaqMan探針的探針七的序列如SEQ ID NO:7所示。2. 如權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述TaqMan探針的5'端標(biāo)記有熒光報 告基團(tuán)FAM，3 '端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。3. 如權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒還包括III型豬腸胃 粘膜提取物和牛血清蛋白/脫脂奶粉。4. 如權(quán)利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述III型豬腸胃粘膜提取物中含有 人源諾如病毒的特異性受體。5. 如權(quán)利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒還包括酶標(biāo)條、酶標(biāo) 框、聚烯烴膜、吸水濾紙、磷酸鹽緩沖液、碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液和DEPC水/(IdH 2O。6. 如權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括如下步驟： 1) 將III型豬腸胃粘膜提取物包被到酶標(biāo)板上； 2) 封閉酶標(biāo)板，防止酶標(biāo)板非特異性吸附病毒粒子； 3) 將待測樣品加入到酶標(biāo)板； 4) 高溫裂解釋放RNA; 5) 加入第一引物對、第一引物對配套TaqMan探針、第二引物對、第二引物對配套TaqMan 探針以及一步反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑進(jìn)行反應(yīng)； 6) 進(jìn)行RT-qPCR檢測。7. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述步驟3)中，檢測GI組人源諾如病毒和 GII組人源諾如病毒的清洗酶標(biāo)板和稀釋病毒的緩沖液分別為pH=3.0和pH=7.0。8. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述步驟4)中，高溫裂解釋放RNA的溫度為 95。。。9. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述步驟6)中，RT-qPCR檢測的反應(yīng)條件 為:第一階段42°C反轉(zhuǎn)錄IOmin，第二階段95°C預(yù)變性30s;第三階段95°C變性15s，53°C退火 15s，60°C延伸30s，擴(kuò)增45個循環(huán);4°C保溫;并在第三階段進(jìn)行FAM熒光信號采集。
【文檔編號】C12Q1/70GK105907889SQ201610293917
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月5日
【發(fā)明人】王大鵬, 周震寰, 邢逸凡, 崔妍, 史賢明
【申請人】上海交通大學(xué)