拮抗多種牡丹病原菌的多粘類芽孢桿菌的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了拮抗多種牡丹病原菌的多粘類芽孢桿菌的應(yīng)用。該拮抗多種牡丹病原菌的多粘類芽孢桿菌是多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101，其在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)為CGMCC No.8527。多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101可顯著抑制牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢霉(Cladosporium paeoniae)和芍藥雜色尾孢霉菌(Cercospora varricolor Winter)，并顯著促進(jìn)牡丹的生長。CGMCC No.852720131209
【專利說明】
拮抗多種牡丹病原菌的多粘類芽孢桿菌的應(yīng)用
[00011 本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?01410117673.5、申請(qǐng)日為2014年03月26日、發(fā)明創(chuàng)造名稱為 "一株拮抗多種牡丹病原菌的多粘類芽孢桿菌及其應(yīng)用"的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及拮抗多種牡丹病原菌的多粘類芽孢桿菌的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003] 牡丹歸芍藥科(Paeoniaceae)、芍藥屬(Paeonia)，一直以來都是中國最重要的觀 賞植物和藥用植物之一，已有1600多年的歷史。目前，牡丹在國內(nèi)的主要栽培地點(diǎn)為荷澤、 洛陽、北京、臨夏、天彭、銅陵等。近年來，牡丹的油用價(jià)值日漸凸顯，油用牡丹的發(fā)展呈現(xiàn)出 快速擴(kuò)張的態(tài)勢(shì)。對(duì)于觀賞牡丹來講，一個(gè)突出的問題是，由于不同地區(qū)氣候環(huán)境和土壤性 質(zhì)的差異造成的土壤微生態(tài)活性降低，是引種地區(qū)栽培牡丹生長狀況不良、觀賞性狀下降 的重要原因之一。而對(duì)于油用牡丹，如何科學(xué)施肥并顯著提高牡丹籽的產(chǎn)量則是非常迫切 的問題。在牡丹的栽培過程中，還面臨著一些真菌病害的威脅，主要有灰霉?。˙otrytis paeoniae)、紅斑?。–ladosporium aeoniae)和褐斑病（Cercospora paeoniae)等。因此，研 制促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的微生物菌劑具有顯著和迫切的現(xiàn)實(shí)意義。其中，篩選對(duì)牡 丹兼具促生和拮抗病原菌功能的植物促生細(xì)菌菌種資源是限制微生物菌劑發(fā)展的重要瓶 頸因素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問題是提供一株能拮抗多種牡丹病原菌、促進(jìn)牡丹生 長并且能以玉米秸桿為原料生產(chǎn)促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌株。
[0005] 本發(fā)明所提供的菌株是多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101，已 于2013年12月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（簡(jiǎn)稱CGMCC)， 保藏登記號(hào)為CGMCC No.8527。
[0006] 所述多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的形態(tài)學(xué)特征如下:革 蘭氏陽性，運(yùn)動(dòng)，菌體呈桿狀，直徑為0.6-0.8μπι，長為2.0-7.6μπι。芽孢柱狀，1.6-3.5 X 1.2-1.5μπι，中生到次端生。孢子囊明顯膨大成紡錘型或棒狀。其菌落邊緣不整齊裂片狀，半透明 到不透明。后其菌落粗糙，淺白色，中間略突起。菌落粘著在培養(yǎng)基表面。
[0007] 所述多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的生理生化特征如下：
[0008] 水解淀粉:陰性；
[0009] 水解酪蛋白：陰性；
[0010] 水解明膠:陰性；
[0011] 利用檸檬酸鹽:陰性；
[0012]酪氨酸分解:陰性；
[0013]苯丙氨酸脫氨酶實(shí)驗(yàn)：陰性；
[0014]卵黃卵磷脂酶實(shí)驗(yàn):陰性；
[0015] 剛噪產(chǎn)生:陰性；
[0016]馬尿酸鹽實(shí)驗(yàn):陰性；
[0017]接觸酶實(shí)驗(yàn)：陽性；
[0018] 硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)：陽性；
[0019] 二羥丙酮產(chǎn)生：陽性；
[0020] 抗溶菌酶實(shí)驗(yàn)：陽性；
[0021] 分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣：陽性；
[0022] 分解阿拉伯糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣：陽性；
[0023]分解木糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣：陽性；
[0024]分解甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣：陽性；
[0025] 耐鹽性試驗(yàn):7%NaCl生長；
[0026]在pH 6.8的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)和pH 5.7的沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中均可生長。 在MR-VP肉湯上產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，pH 6.0。
[0027] 所述多粘類芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa)CSM 1101 的 16SrDNA序列如SEQ ID No. 1所示。其中，SEQ ID No. 1由1496個(gè)核苷酸組成。
[0028] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種菌劑，該菌劑的活性成分為所述的多粘類芽孢桿 菌（Paenibacillus polymyxa)CSM 1101。
[0029] 該菌劑除包含作為活性成分的多粘類芽孢桿菌（Paenibacil Ius po lymyxa) CSM1101外，還可包括輔料，如草炭、動(dòng)物的糞便、各類作物的秸桿、松殼、稻草、花生皮等。所 述菌劑還可包括載體。所述載體可為固體載體或液體載體。所述固體載體為礦物材料、植物 材料或高分子化合物;所述礦物材料為粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白碳、沸石、硅石和硅藻 土中的至少一種;所述植物材料為玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一種;所述高分子化合物為 聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液體載體可為水。所述菌劑中，所述活性成分可以以被培養(yǎng)的 活細(xì)胞、活細(xì)胞的發(fā)酵液、細(xì)胞培養(yǎng)物的濾液或細(xì)胞與濾液的混合物的形式存在。所述組合 物的劑型可為多種劑型，如液劑、乳劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、可濕性粉劑或水分散粒劑。 [0030] 所述多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101可為下述A1)_A3)中任 一種菌劑：
[0031 ] Al)促進(jìn)牡丹生長和拮抗病原菌的菌劑；
[0032] 所述病原菌為牡丹葡萄孢菌（Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢霉（Cladosporium paeoniae)和茍藥雜色尾抱霉菌(Cercospora varricolor Winter)中的三種、任兩種或任 一種。
[0033] A2)詰抗病原菌的菌劑;所述病原菌為牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae)、牡丹 枝抱霉(Cladosporium paeoniae)和茍藥雜色尾抱霉菌(Cercospora varricolor Winter) 中的二種、任兩種或任一種。
[0034] A3)促進(jìn)牡丹生長的菌劑。
[0035] 所述的多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101在制備所述A1)_A3) 中的任一種菌劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0036] 上述多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101或上述菌劑的下述用 途也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0037] Cl)促進(jìn)牡丹生長和拮抗病原菌；
[0038] C2)所述促進(jìn)牡丹生長；
[0039] C3)所述拮抗病原菌。
[0040] 本發(fā)明還提供了一種促進(jìn)牡丹生長的方法。
[0041] 本發(fā)明所提供的促進(jìn)牡丹生長的方法，包括在生根前將浸種后的牡丹種子用所述 菌劑處理1-3小時(shí)(如1小時(shí))再進(jìn)行生根培養(yǎng)的步驟。
[0042]上述方法中，將浸種后的牡丹種子用所述菌劑處理的方式因所述菌劑的物理狀態(tài) 而異，如果所述菌劑為液態(tài)，直接用所述菌劑浸泡所述浸種后的牡丹種子即可，所述菌劑中 的所述多粘類芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的含量可為108cfu/ml_ 109〇如/1111(如109〇;^/1]11) ;如果所述菌劑為固態(tài)，需要向所述菌劑中加水制成液體菌劑，再 用該液體菌劑浸泡所述浸種后的牡丹種子，所述液體菌劑中的所述多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa)CSM 1101 的含量可為108cfu/ml-109cfu/ml (如 109cfu/ml)。 [0043]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述牡丹為鳳丹(Paeonia ostii)。
[0044] 上述文中，所述促進(jìn)牡丹生長可體現(xiàn)為下述Bl)-B7)中的任一種：
[0045] BI)縮短牡丹種子生根時(shí)間；
[0046] B2)提高牡丹種子生根率；
[0047] B3)縮短牡丹種子的發(fā)芽時(shí)間；
[0048] B4)提高牡丹種子的發(fā)芽率；
[0049] B5)提高牡丹的主根長度；
[0050] B6)提高牡丹苗高；
[0051] B7)提高牡丹幼苗生物量；
[0052]所述提高牡丹幼苗生物量體現(xiàn)為提高牡丹幼苗的鮮重或干重。
[0053] 上述方法中，所述病原菌可為牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢霉 (Cladosporium paeoniae)和茍藥雜色尾抱霉菌（Cercospora varricolor Winter)中的三 種、任兩種或任一種。
[0054] 本發(fā)明的又一目的是提供一種培養(yǎng)多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) CSM 1101的方法。
[0055] 本發(fā)明所提供的培養(yǎng)多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的方 法，包括將多粘類芽孢桿菌(PaenibaciIlus polymyxa)CSM 1101在用于培養(yǎng)多粘類芽孢桿 菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的步驟。
[0056] 本發(fā)明的又一目的是提供一種制備所述菌劑的方法。
[0057] 本發(fā)明所提供的制備所述菌劑的方法，包括如下步驟:將所述的多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa)CSM 1101作為活性成分，得到所述菌劑。
[0058] 本發(fā)明的多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101可顯著抑制牡丹 葡萄孢菌（Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢霉（Cladosporium paeoniae)和茍藥雜色尾孢霉 菌（Cercospora varricolor Winter)，對(duì)它們的抑菌率分別達(dá)到了57 · 2 %、65 · 7 % 和 88.3%。本發(fā)明多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101處理的牡丹種子(菌 劑組層積處理）的生根時(shí)間比對(duì)照組層積處理提前了 10天;菌劑組層積處理的生根率達(dá)到 95.0%，比對(duì)照組層積處理(未用菌劑處理）的生根率提高了 33.8%;菌劑組層積處理的主 根長度為69.0mm，是對(duì)照組層積處理的1.68倍;菌劑組層積處理的主根長度2 40mm的種子 百分率達(dá)到90±0.5%，是對(duì)照組層積處理的1.3倍;菌劑組層積處理的發(fā)芽時(shí)間比對(duì)照組 層積處理縮短了 10天;菌劑組層積處理的發(fā)芽率達(dá)到99.0%，是對(duì)照組層積處理的1.2倍； 菌劑組層積處理的苗高是對(duì)照組層積處理的1.77倍，菌劑組層積處理的干重是對(duì)照組層積 處理的2.27倍。說明以多粘類芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC No. 8527為活性成分的促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑不但拮抗牡丹病原菌還顯著地促 進(jìn)了牡丹種子的生根(胚根萌發(fā))和發(fā)芽(胚芽萌發(fā))和牡丹幼苗的生長。
[0059] 保藏說明
[0060] 菌種名稱:多粘類芽孢桿菌
[0061] 拉丁名：PaenibaciIlus polymyxa
[0062] 菌株編號(hào)：CSM 1101
[0063]保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心
[0064] 保藏機(jī)構(gòu)簡(jiǎn)稱:CGMCC
[0065]地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)
[0066] 保藏日期：2013年12月09日
[0067] 保藏中心登記入冊(cè)編號(hào):CGMCC No .8527
【附圖說明】
[0068]圖1為菌劑組層積處理和對(duì)照組層積處理部分種子生根培養(yǎng)60天的照片。
[0069] a為對(duì)照組層積處理，b為菌劑組層積處理。
【具體實(shí)施方式】
[0070]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為 常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0071 ] 下述實(shí)施例中所用的牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae)ACCC36053和牡丹枝孢 霉(Cladosporium paeoniae)ACCC36063于本申請(qǐng)的申請(qǐng)日前均收藏于中國微生物菌種保 藏管理委員會(huì)農(nóng)業(yè)微生物中心（簡(jiǎn)稱ACCC，地址:北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街12號(hào)，中國農(nóng) 業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，郵編100081)，這兩個(gè)菌株的收藏日均為2006年8月 31日，自收藏之日起，公眾可從中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)農(nóng)業(yè)微生物中心獲得該菌 株。
[0072]下述實(shí)施例中所用的牡丹褐斑病病原菌為茍藥雜色尾孢霉菌（Cercospora varricolor Winter)(張建國，2001 ·牡丹的主要病害及防治·中國花丼園藝，23:32-34)公 眾可從上海辰山植物園獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它 用途使用。
[0073]下述實(shí)施例中的牡丹為鳳丹（Paeonia ostii)(Jigang Han,Yao Song,Zhigang Liu，etc·201I·Culturable bacterial community analysis in the root domains of two varieties of tree peony(Paeonia ostii).FEMS Microbiol Lett，322:15-24)公眾 可從上海辰山植物園獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用 途使用。
[0074] 下述實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基如下：
[0075] 半固體D6bereiner 無氮培養(yǎng)基：鹿糖，IOg;蘋果酸，5g;KH2PO4 · H2O，0 · 4g; K2HPO4 · H20,0.1g;MgS〇4 · 7H2〇,0.2g;NaCl，0.1g;CaCl2 · 2H2〇,0.02g;FeCl3,0.01g; Na2MoO4 · 2H20,0.02g;瓊脂，3g;用蒸餾水定容至1000 mKpH 7.0-7.23211:蒸氣滅菌 20min〇
[0076] D0bereiner無氮培養(yǎng)基：鹿糖，IOg;蘋果酸，5g;KH2P〇4 · H2〇,0.4g;K2HP〇4 · H2O， 0.1g;MgS〇4 · 7H2〇,0.2g;NaCl，0.1g;CaCl2 · 2H2〇,0.02g;FeCl3,0.01g;Na2Mo〇4 · 2H2O， 0.02g;瓊脂18g;用蒸餾水定容至1000ml、pH 7.〇-7.2。121<€蒸氣滅菌2〇111；[11。
[0077] NB培養(yǎng)基:葡萄糖5 · Og，蛋白胨5 · Og，牛肉膏3 · Og，用蒸餾水定容至1000ml，pH7 · 0-7.2，121°C 滅菌 20min。
[0078] NA培養(yǎng)基：葡萄糖5. Og，蛋白胨5. Og，牛肉膏3. Og，瓊脂18g，用蒸餾水定容至 100〇1111，？!17.〇-7.2，121。(：滅菌2〇11^11。
[0079] PDA培養(yǎng)基:葡萄糖20g，瓊脂18g，馬鈴薯200g，加水1000 mL煮沸30min濾取汁液，加 水補(bǔ)足 1000ml，pH6.0-7.0，121°C滅菌20min。
[0080] 下述實(shí)施例中的纖維素酶購于生工生物工程(上海)股份有限公司。下述實(shí)施例中 的纖維素酶酶活力單位(FPU)定義為Ig纖維素酶粉在55°C下60min內(nèi)水解濾紙所得葡萄糖μ m ο 1數(shù)。纖維素酶酶活力的具體測(cè)定方法如下：取纖維素酶10.0 0 g，加10 0 m 1 ρ H 4.8 5的 0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液充分溶解，得到纖維素酶液，將纖維素酶液稀釋后，吸取 0.5ml，加入0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液1.5ml，I X 6cm新華一號(hào)濾紙條一張，55 °C下水解 60min。水解完畢后采用如下的DNS法測(cè)定體系中的葡萄糖含量，并計(jì)算纖維素酶的酶活力。
[0081] 下述實(shí)施中，發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖含量的測(cè)定方法采用DNS法，具體如下：
[0082] (I)DNS試劑的配制：200g酒石酸鉀鈉，溶于一定量的水中，加熱溶解，添加10.0g3， 5-二硝基水楊酸，IOg NaOH溶解后加入2g苯酸，0.5g無水亞硫酸鈉，全部加熱溶解后，冷卻 至室溫，定容至l〇〇〇ml。
[0083] (2)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確稱取100.Omg分析純的無水葡萄糖(預(yù)先在105°C 干燥至恒重），用少量蒸餾水溶解后，定量轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，再定容到刻度、搖勻，濃度 為lmg/mL。取10支試管，分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0 mL、 1.2mL、1.6mL后，用蒸餾水稀釋至2mL，再加入2.5mL DNS試劑混合均勻，在沸水中加熱5min。 取出后即用水冷卻至室溫，定容到25ml，搖勻。30min后于520nm下測(cè)OD值。以O(shè)D 52q值為縱坐 標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，形式為Y = aX+b。
[0084] (3)發(fā)酵液中葡萄糖濃度的測(cè)定:取稀釋到一定濃度的發(fā)酵上清液(4000r/min，離 心20min)，加入2.5mL DNS試劑混合均勻，在沸水中加熱5min。取出用水冷卻到室溫，定容至 25mL，搖勻，靜置30min后于520nm出測(cè)OD 52q值。根據(jù)樣品的OD52q值與標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中 的葡萄糖含量。
[0085] 實(shí)施例1、多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的分離與鑒定
[0086] -、多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101 的分離
[0087] 從安徽省銅陵市順安鎮(zhèn)金山村丹皮種植地的牡丹(Paeonia ostii，鳳丹）（株齡6 年)植株的根際采集土樣，將土樣放入裝有無菌水和滅菌玻璃珠的小三角瓶中，200rpm/min 振蕩20min;取振蕩后的懸液做系列梯度稀釋，IO3UO4稀釋度懸液各吸取200μ1均勻涂布 ffibere i ner無氮培養(yǎng)基，置30°C培養(yǎng)4d后，挑取單菌落，在DSbere i ner無氮培養(yǎng)基固體培 養(yǎng)基平板上用平板劃線法進(jìn)行菌種純化。將分離純化所得的其中一個(gè)菌株命名為牡丹根際 固氮菌CSM 1101。
[0088] 二、牡丹根際固氮菌CSM 1101的鑒定 [0089] 1.形態(tài)特征觀察和生理生化特性測(cè)定
[0090]形態(tài)學(xué)和生理生化特性鑒定參考"伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)"（Garrity，2001)和"一 般細(xì)菌學(xué)常用鑒定方法"（東秀珠等，2001 )，按照常規(guī)方法進(jìn)行。
[0091]牡丹根際固氮菌CSM 1101的形態(tài)學(xué)特征如下：革蘭氏陽性，運(yùn)動(dòng)，菌體呈桿狀，直 徑為0.6-0.8μπι，長為2.0-7.6μπι。芽孢柱狀，1.6-3.5 X 1.2-1.5μπι，中生到次端生。孢子囊明 顯膨大成紡錘型或棒狀。其菌落邊緣不整齊裂片狀，半透明到不透明。后其菌落粗糙，淺白 色，中間略突起。菌落粘著在培養(yǎng)基表面。
[0092] 牡丹根際固氮菌CSM 1101的生理生化特征測(cè)定結(jié)果如下：
[0093]水解淀粉:陰性；
[0094]水解酪蛋白：陰性；
[0095]水解明膠:陰性；
[0096]利用檸檬酸鹽：陰性；
[0097]酪氨酸分解:陰性；
[0098]苯丙氨酸脫氨酶實(shí)驗(yàn)：陰性；
[0099]卵黃卵磷脂酶實(shí)驗(yàn):陰性；
[0100] 吲哚產(chǎn)生：陰性；
[0101] 馬尿酸鹽實(shí)驗(yàn):陰性；
[0102] 接觸酶實(shí)驗(yàn):陽性；
[0103] 硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)：陽性；
[0104] 二羥丙酮產(chǎn)生：陽性；
[0105] 抗溶菌酶實(shí)驗(yàn):陽性；
[0106] 分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣：陽性；
[0107] 分解阿拉伯糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣：陽性；
[0108] 分解木糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣：陽性；
[0109] 分解甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣：陽性；
[0110] 耐鹽性試驗(yàn):7%NaCl生長；
[0111] 在pH 6.8的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)和pH 5.7的沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中均可生長。 在MR-VP肉湯上產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，pH 6.0。
[0112] 2.16S rDNA的序列擴(kuò)增和分析
[0113] 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN公司）提取基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模 板。PCR 引物（Pf 5 ' -CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ' 和Pr 5 ' -CGGGATCCAA GGAGGTGATCCAGCC-3'）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 9700PCR擴(kuò)增細(xì)菌的 16S rDNA。反應(yīng)體系為 10XPCR buffer，2.5uL; dNTP (2 · 5mM) (TaKaRa)，2uL，Pf (IOpmo I/uL) O · IuL，Pr (IOpmo I/uL) O · IuL，Taq聚合酶（5U/ uL) (TaKaRa)，0.125uL，基因組DNA 0.5uL，加 CldH2O至25UUPCR反應(yīng)條件為，94°C預(yù)變性 5min，94°C 變性 lmin，52°C 復(fù)性 lmin，72°C 延伸 lmin，72°C 最后延伸 10min，30 個(gè)循環(huán)。PCR 擴(kuò) 增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司純化并測(cè)序。將菌株的16S rDNA序列在 GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比較分析。
[0114] 結(jié)果表明測(cè)得的牡丹根際固氮菌CSM 1101 16S rDNA序列全長I 496bp JnSEQID No· 1。在GENBANK進(jìn)行blastn分析的結(jié)果表明，其序列與Paenibacillus polymyxa strain M-I (EF656457)的相似性達(dá)到99%。
[0115] 根據(jù)牡丹根際固氮菌CSM 1101的形態(tài)特征、生理生化特征和16s rDNA序列同源性 分析結(jié)果，將牡丹根際固氮菌CSM 1101鑒定為多粘類芽孢桿菌（Paenibaci Ilus polymyxa)。多粘類芽抱桿菌（PaenibaciIlus polymyxa)CSM 1101 已于2013年 12月09 日保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區(qū) 北辰西路1號(hào)院3號(hào)），保藏編號(hào)為CGMCC No.8527。
[0116] 實(shí)施例2、多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的生物活性
[0117] -、多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的固氮活性測(cè)定
[0?18] 固氮活性測(cè)定米用乙炔還原法。在15mm X 15mm螺口試管中加入2 · 5mL半固體 D:0berei.n:er_無氮培養(yǎng)基，接種多粘類芽孢桿菌（PaenibaciIlus polymyxa)CSM 1101 CGMCC No. 8527后，塞好棉塞，30°C培養(yǎng)24h;再換無菌膠塞密封，抽出10%氣體，注入相同體 積的乙炔，30°C培養(yǎng)24h。抽取氣樣在Varian VISTA 6000型氣相色譜儀上測(cè)定ARA (acetyiene reduction activity，乙炔還原活性）。實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)重復(fù)，取其平均值并計(jì)算方 差不大于5%。
[0119] 測(cè)定結(jié)果表明，CSM 1101在DSbereiner無氮培養(yǎng)基中表現(xiàn)出了較高的固氮活性。 其乙炔還原活性為12.6C2H4nmol ml/l·1。
[0120] 二、多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101 的抑菌活性
[0121 ]以牡丹葡萄抱菌（Botrytis paeoniae)ACCC36053、牡丹枝抱霉（Cladosporium paeoniae)ACCC36063、茍藥雜色尾抱霉菌（Cercospora varricolor Winter)中的任一菌株 單獨(dú)為病原菌，均采用平板對(duì)峙法測(cè)定抑菌率，具體方法如下:病原菌菌株在roA斜面上活 化后，加入無菌水制成病原菌懸浮液，將病原菌懸浮液加到融化后冷卻到45-50 °C的PDA培 養(yǎng)基中混勻倒平板，在30°C培養(yǎng)4天，得到病原菌平板，用直徑為6mm的打孔器打取病原菌菌 餅。
[0122] 按照如下方法測(cè)定多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101對(duì)每種 病原菌的抑菌率:實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)病原菌設(shè)兩個(gè)處理，即CSM 1101組和對(duì)照組。將 20個(gè)無菌HM平板均分為兩組，即CSM 1101組和對(duì)照組，每組10個(gè)平板，進(jìn)行以下接種處理： 在CSM 1101組的無菌PDA平板中心接種直徑為6mm的病原菌菌餅，將多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC No.8527斜面活化菌種接種于距病原菌菌餅 3cm處。同時(shí)，在對(duì)照組的無菌PDA平板中心只接種直徑為6mm的病原菌菌餅。將經(jīng)過上述接 種處理的CSM 1101組平板和對(duì)照組平板在30°C培養(yǎng)5-7天，待對(duì)照組平板(僅接種病原菌） 長滿整個(gè)培養(yǎng)皿時(shí)，測(cè)量對(duì)照組的病原菌菌落直徑和CSM 1101組的病原菌菌落直徑，計(jì)算 抑菌率。
[0123] 抑菌率（％ )=(對(duì)照組的病原菌菌落直徑-CSM 1101組的病原菌菌落直徑)/對(duì)照 組的病原菌菌落直徑X100。
[0124] 結(jié)果如表1所不，表明多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC No · 8527對(duì)牡丹葡萄抱菌（Botrytis paeoniae)ACCC36053、牡丹枝抱霉（Cladosporium paeoniae)ACCC36063和茍藥雜色尾抱霉菌(Cercospora varricolor Winter)均具有較強(qiáng) 的平板抑菌活性，其抑菌率分別達(dá)到了57.2%、65.7%和88.3%。
[0125]表 1 多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC No.8527對(duì)病原 菌的抑菌率
[0131]實(shí)施例3、利用玉米秸桿酶解液生產(chǎn)促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑A
[0132] I、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
[0133] 取玉米秸桿SOOOg(以干重計(jì)），切成小段，投入水熱反應(yīng)釜，在180°C和1.0 Mpa的條 件下進(jìn)行水熱處理20min后自然晾干，得到經(jīng)過預(yù)處理的玉米秸桿;將該經(jīng)過預(yù)處理的玉米 秸桿粉碎至100目后，按照以干重計(jì)每克秸桿加入15FPU的比例加入纖維素酶，按照以干重 計(jì)每200克干秸桿加入IL蒸餾水的比例加入蒸餾水，于55°C，IOOrpm(旋轉(zhuǎn)半徑20mm)，pH = 4.8的條件下水解48h后冷卻離心，分別收集上清液和沉淀，該上清液即為酶解液，該沉淀即 為酶解殘?jiān)y(cè)定酶解液中的葡萄糖含量，結(jié)果表明酶解液中的葡萄糖含量為55g/L。用酶 解液、（NH4) 2S〇4、MgSO4、CaCO3、玉米漿和水配制發(fā)酵培養(yǎng)基（即發(fā)酵培養(yǎng)基由酶解液、（NH4) 25〇4、185〇4、0&0)3、玉米漿和水組成），每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中所述酶解液的含量滿足每升 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖含量為20g;每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，（NH4) 2S〇4的含量為10g、 MgSO4的含量為0.4g、CaC03的含量為6g、玉米漿的含量為2g。
[0134] 2、發(fā)酵培養(yǎng)
[0135] 2.1種子培養(yǎng)
[0136] 將多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa)CSM 1101 CGMCC No.8527在NA培 養(yǎng)基斜面上活化培養(yǎng)后取2 - 3環(huán)接種到500ml三角瓶內(nèi)的50ml NB培養(yǎng)基中。28°C，26mm振 幅，200r/min振蕩培養(yǎng)24h作為種子液，準(zhǔn)備用于發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。
[0137] 2.2發(fā)酵培養(yǎng)
[0138] 取50L步驟1的發(fā)酵培養(yǎng)基置于100L全自動(dòng)發(fā)酵罐中，于121°C滅菌20min，冷卻后， 將2.1所得的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量(V/V)為10%。培養(yǎng)溫度為30°C，通過調(diào)節(jié)通氣 量和攪拌轉(zhuǎn)速維持發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量為30%，發(fā)酵過程中自動(dòng)調(diào)節(jié)pH為6.8-7.2。培養(yǎng) 14小時(shí)時(shí)補(bǔ)加步驟1的酶解液，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖含量為15g/L，繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)，結(jié) 束發(fā)酵?？偣舶l(fā)酵30小時(shí)。取發(fā)酵液，測(cè)定發(fā)酵液中的菌體含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均 值。結(jié)果表明發(fā)酵液中實(shí)施例1的多粘類芽孢桿菌(Paenibaci IIus poIymyxa)CSM 1101的 含量為2.58 X IO1t3Cfu/mL，芽孢含量為85%。將該發(fā)酵液和步驟1中的酶解殘?jiān)荣|(zhì)量混合， 噴霧干燥后(60°C)制粒，得到促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑A。
[0139] 實(shí)施例4、利用玉米秸桿酶解液生產(chǎn)促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑B
[0140] 1、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
[0141] 取玉米秸桿SOOOg(以干重計(jì)），切成小段，投入水熱反應(yīng)釜，在180°C和1.0 Mpa的條 件下進(jìn)行水熱處理20min后自然晾干，得到經(jīng)過預(yù)處理的玉米秸桿;將該經(jīng)過預(yù)處理的玉米 秸桿粉碎至100目后，按照以干重計(jì)每克秸桿加入15FPU的比例加入纖維素酶，按照以干重 計(jì)每200克干秸桿加入IL蒸餾水的比例加入蒸餾水，于55°C，IOOrpm(旋轉(zhuǎn)半徑20mm)，pH = 4.8的條件下水解48h后冷卻離心，分別收集上清液和沉淀，該上清液即為酶解液，該沉淀即 為酶解殘?jiān)?。測(cè)定酶解液中的葡萄糖含量，結(jié)果表明酶解液中的葡萄糖含量為55g/L。用酶 解液、（NH4) 2S〇4、MgSO4、CaCO3、玉米漿和水配制發(fā)酵培養(yǎng)基（即發(fā)酵培養(yǎng)基由酶解液、（NH4) 25〇4、185〇4、0&0)3、玉米漿和水組成），每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中所述酶解液的含量滿足每升 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖含量為20g;每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，（NH4) 2S〇4的含量為10g、 MgSO4的含量為0.4g、CaC03的含量為6g、玉米漿的含量為2g。
[0142] 2、發(fā)酵培養(yǎng)
[0143] 2.1種子培養(yǎng)
[0144] 將多粘類芽孢桿菌（？&611化3(^11118口〇1711^13)05]\111010610：吣.8527在嫩培 養(yǎng)基斜面上活化培養(yǎng)后取2 - 3環(huán)接種到500ml三角瓶內(nèi)的50ml NB培養(yǎng)基中。28°C，26mm振 幅，200r/min振蕩培養(yǎng)24h作為種子液，準(zhǔn)備用于發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。
[0145] 2.2發(fā)酵培養(yǎng)
[0146] 取50L步驟1的發(fā)酵培養(yǎng)基置于100L全自動(dòng)發(fā)酵罐中，于121°C滅菌20min，冷卻后， 將2.1所得的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量(V/V)為10%。培養(yǎng)溫度為30°C，通過調(diào)節(jié)通氣 量和攪拌轉(zhuǎn)速維持發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量為30%，發(fā)酵過程中自動(dòng)調(diào)節(jié)pH為6.8-7.2。培養(yǎng) 24小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵。取發(fā)酵液，測(cè)定發(fā)酵液中的菌體含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié) 果表明發(fā)酵液中實(shí)施例1的多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus p〇lymyxa)CSM 1101的含量為 1.86 X IO8Cfu/mL，芽孢含量為85 %。將發(fā)酵液和步驟1中的酶解殘?jiān)荣|(zhì)量混合，噴霧干燥 后(60°C)制粒，得到促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑B。
[0147] 實(shí)施例5、利用玉米秸桿酶解液生產(chǎn)促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑C
[0148] 1、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
[0149] 取玉米秸桿8000g (以干重計(jì)），切成小段，投入水熱反應(yīng)釜，在200 °C和2. OMpa的條 件下進(jìn)行水熱處理20min后自然晾干，得到經(jīng)過預(yù)處理的玉米秸桿;將該經(jīng)過預(yù)處理的玉米 秸桿粉碎至100目后，按照以干重計(jì)每克秸桿加入15FPU的比例加入纖維素酶，按照以干重 計(jì)每200克干秸桿加入IL蒸餾水的比例加入蒸餾水，于55°C，IOOrpm(旋轉(zhuǎn)半徑20mm)，pH = 4.8的條件下水解48h后冷卻離心，分別收集上清液和沉淀，該上清液即為酶解液，該沉淀即 為酶解殘?jiān)?。測(cè)定酶解液中的葡萄糖含量，結(jié)果表明酶解液中的葡萄糖含量為60g/L。用酶 解液、（NH4) 2S〇4、MgSO4、CaCO3、玉米漿和水配制發(fā)酵培養(yǎng)基（即發(fā)酵培養(yǎng)基由酶解液、（NH4) 25〇4、185〇4、0&0)3、玉米漿和水組成），每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中所述酶解液的含量滿足每升 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖含量為20g;每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，（NH4) 2S〇4的含量為10g、 MgSO4的含量為0.4g、CaC03的含量為6g、玉米漿的含量為2g。
[0150] 2、發(fā)酵培養(yǎng)
[0151] 2.1種子培養(yǎng)
[0152] 將多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC No.8527在NA培養(yǎng) 基斜面上活化培養(yǎng)后取2 - 3環(huán)接種到500ml三角瓶內(nèi)的50ml NB培養(yǎng)基中。28°C，26mm振幅， 200r/min振蕩培養(yǎng)24h作為種子液，準(zhǔn)備用于發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。
[0153] 2.2發(fā)酵培養(yǎng)
[0154] 取50L步驟1的發(fā)酵培養(yǎng)基置于100L全自動(dòng)發(fā)酵罐中，于121°C滅菌20min，冷卻后， 將2.1所得的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量(V/V)為10%。培養(yǎng)溫度為30°C，通過調(diào)節(jié)通氣 量和攪拌轉(zhuǎn)速維持發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量為30%，發(fā)酵過程中自動(dòng)調(diào)節(jié)pH為6.8-7.2。培養(yǎng) 24小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵。取發(fā)酵液，測(cè)定發(fā)酵液中的菌體含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié) 果表明發(fā)酵液中實(shí)施例1的多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus p〇lymyxa)CSM 1101的含量為 2.78 X IO9Cf u/mL，芽孢含量為85 %。將發(fā)酵液和步驟1中的酶解殘?jiān)荣|(zhì)量混合，噴霧干燥 后(60°C)制粒，得到促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑C。
[0155] 實(shí)施例6、利用玉米秸桿酶解液生產(chǎn)促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑D
[0156] 1、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
[0157] 取玉米秸桿SOOOg (以干重計(jì)），切成小段，投入水熱反應(yīng)釜，在200 °C和2. OMpa的條 件下進(jìn)行水熱處理IOmin后自然晾干，得到經(jīng)過預(yù)處理的玉米秸桿;將該經(jīng)過預(yù)處理的玉米 秸桿粉碎至100目后，按照以干重計(jì)每克秸桿加入15FPU的比例加入纖維素酶，按照以干重 計(jì)每200克干秸桿加入IL蒸餾水的比例加入蒸餾水，于55°C，IOOrpm(旋轉(zhuǎn)半徑20mm)，pH = 4.8的條件下水解48h后冷卻離心，分別收集上清液和沉淀，該上清液即為酶解液，該沉淀即 為酶解殘?jiān)?。測(cè)定酶解液中的葡萄糖含量，結(jié)果表明酶解液中的葡萄糖含量為46g/L。用酶 解液、（NH4) 2S〇4、MgSO4、CaCO3、玉米漿和水配制發(fā)酵培養(yǎng)基（即發(fā)酵培養(yǎng)基由酶解液、（NH4) 25〇4、185〇4、0&0)3、玉米漿和水組成），每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中所述酶解液的含量滿足每升 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖含量為20g;每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，（NH4) 2S〇4的含量為10g、 MgSO4的含量為0.4g、CaC03的含量為6g、玉米漿的含量為2g。
[0158] 2、發(fā)酵培養(yǎng)
[0159] 2.1種子培養(yǎng)
[0160] 將多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa)CSM 1101 CGMCC No.8527在NA培 養(yǎng)基斜面上活化培養(yǎng)后取2-3環(huán)接種到500ml三角瓶內(nèi)的50ml NB培養(yǎng)基中。28°C，26mm振 幅，200r/min振蕩培養(yǎng)24h作為種子液，準(zhǔn)備用于發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。
[0161] 2.2發(fā)酵培養(yǎng)
[0162] 取50L步驟1的發(fā)酵培養(yǎng)基置于100L全自動(dòng)發(fā)酵罐中，于121°C滅菌20min，冷卻后， 將2.1所得的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量(V/V)為10%。培養(yǎng)溫度為30°C，通過調(diào)節(jié)通氣 量和攪拌轉(zhuǎn)速維持發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量為30%，發(fā)酵過程中自動(dòng)調(diào)節(jié)pH為6.8-7.2。培養(yǎng) 24小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵。取發(fā)酵液，測(cè)定發(fā)酵液中的菌體含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié) 果表明發(fā)酵液中實(shí)施例1的多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus p〇lymyxa)CSM 1101的含量為 4.42 X IO8Cfu/mL，芽孢含量為85 %。將發(fā)酵液和步驟1中的酶解殘?jiān)荣|(zhì)量混合，噴霧干燥 后(60°C)制粒，得到促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑D。
[0163] 對(duì)比例:利用淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑E
[0164] 1、發(fā)酵培養(yǎng)基配制
[0165] 發(fā)酵培養(yǎng)基：用淀粉、（NH4)2S04、MgS04、CaCO 3、玉米漿和水配制發(fā)酵培養(yǎng)基（即發(fā)酵 培養(yǎng)基由淀粉、（NH4)2S〇4、MgS〇4、CaC0 3、玉米漿和水組成），每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中所述淀粉 的含量滿足每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖含量為20g;每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，（NH 4)2SO4的 含量為l〇g、MgS〇4的含量為0.4g、CaC0 3的含量為6g、玉米漿的含量為2g。）
[0166] 該對(duì)比例的發(fā)酵培養(yǎng)基中采用的組分除將玉米秸桿酶解液替換為等葡萄糖含量 的淀粉外，發(fā)酵培養(yǎng)基中的其它組分其它均與實(shí)施例3-6相同。
[0167] 2、發(fā)酵培養(yǎng)
[0168] 該發(fā)酵培養(yǎng)中，發(fā)酵液的制備方法與實(shí)施例4-6相同，具體如下：
[0169] 2.1種子培養(yǎng)
[0170] 將多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa)CSM 1101 CGMCC No.8527在NA培 養(yǎng)基斜面上活化培養(yǎng)后取2 - 3環(huán)接種到500ml三角瓶內(nèi)的50ml NB培養(yǎng)基中。28°C，26mm振 幅，200r/min振蕩培養(yǎng)24h作為種子液，準(zhǔn)備用于發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。
[0171] 2.2發(fā)酵培養(yǎng)
[0172] 取50L發(fā)酵培養(yǎng)基置于100L全自動(dòng)發(fā)酵罐中，于121°C滅菌20min，冷卻后，將2.1所 得的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量(V/V)為10%。培養(yǎng)溫度為30°C，通過調(diào)節(jié)通氣量和攪 拌轉(zhuǎn)速維持發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量為30 %，發(fā)酵過程中自動(dòng)調(diào)節(jié)pH為6.8-7.2。培養(yǎng)24小 時(shí)，結(jié)束發(fā)酵。取發(fā)酵液，測(cè)定發(fā)酵液中的菌體含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果表 明發(fā)酵液中實(shí)施例1的多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的含量為3.66 X 109cfu/mL，芽孢含量為85 %。將發(fā)酵液噴霧干燥后(60°C )制粒，得到促進(jìn)牡丹生長并拮 抗病原菌的菌劑E。
[0173] 實(shí)施例7、促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑促進(jìn)牡丹種子萌發(fā)和牡丹幼苗生長
[0174] 種子采收:7月以果皮蟹黃為標(biāo)準(zhǔn)采收鳳丹(Paeonia ostii)朞莢果(安徽省銅陵 市順安鎮(zhèn)金山村），置室內(nèi)陰干至果皮開裂后收集種子，〇.5%KMn04浸泡2h進(jìn)行消毒得到消 毒后的鳳丹(Paeonia ostii)種子用于試驗(yàn)。試驗(yàn)地點(diǎn)為上海市松江區(qū)上海辰山植物園。
[0175] 多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC No.8527菌懸液的制 備:將實(shí)施例3的促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑A懸浮于無菌水中得到多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC Νο·8527菌懸液，使菌懸液中多粘類芽抱桿菌 (Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC No.8527的含量為 109cfu/mL。
[0176] 取消毒后的鳳丹(Paeonia ostii)種子，用50°C無菌水浸種24h得到浸種后的鳳丹 (Paeonia ostii)種子，以下簡(jiǎn)稱浸種后的牡丹種子，進(jìn)行下述種子生根(胚根萌發(fā))實(shí)驗(yàn)和 發(fā)芽(胚芽萌發(fā))實(shí)驗(yàn)。種子生根(胚根萌發(fā))實(shí)驗(yàn)和發(fā)芽(胚芽萌發(fā))實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，每次 重復(fù)設(shè)置兩種處理，即菌劑組層積處理和對(duì)照組層積處理。種子生根(胚根萌發(fā))實(shí)驗(yàn)中，每 種處理300粒浸種后的牡丹種子。發(fā)芽（胚芽萌發(fā)）實(shí)驗(yàn)中，每種處理選取50粒主根長度2 40mm并且長度一致的生根種子。具體實(shí)驗(yàn)方法如下：
[0177] 1、種子生根(胚根萌發(fā))實(shí)驗(yàn)
[0178] 菌劑組層積處理和對(duì)照組層積處理這兩種處理中除生根前預(yù)處理方式不同外，其 它處理方式完全相同。菌劑組層積處理的生根前預(yù)處理如下：將浸種后的牡丹種子置于多 粘類芽抱桿菌（PaenibaciIlus polymyxa)CSM 1101CGMCC No.8527菌懸液（109cfu/mL)中 在25-30°C浸泡1小時(shí)，完成生根前預(yù)處理。對(duì)照組層積處理的生根前預(yù)處理如下:將浸種后 的牡丹種子在25-30Γ置于無菌水中浸泡1小時(shí)，完成生根前預(yù)處理。然后將完成生根前預(yù) 處理的種子均進(jìn)行如下生根培養(yǎng):將完成生根前預(yù)處理的種子與含水量為400%的高溫滅 菌的珍珠巖(層積基質(zhì)）按照1:3的體積比混勻后，裝入聚乙烯塑料袋均置于10°C-25°C(晝 20-25Γ，夜10-15Γ)進(jìn)行生根培養(yǎng)。每天觀察1次，調(diào)查生根時(shí)間，生根培養(yǎng)90d調(diào)查測(cè)定生 根率、主根長度、主根長度2 40mm的種子百分率。數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。
[0179] 其中，以胚根露出種皮的長度為種子長度的1/2為生根。
[0180] 生根率=(L1/L0)X100%;
[0181 ] LI:生根實(shí)驗(yàn)種子中生根種子粒數(shù);LO:生根實(shí)驗(yàn)種子粒數(shù)。
[0182] 2、發(fā)芽(胚芽萌發(fā))實(shí)驗(yàn)
[0183] 分別取步驟1的菌劑組層積處理和對(duì)照組層積處理這兩種處理得到的主根長度2 40mm并且長度一致的生根種子在4 °C貯藏21天后，栽植于高IOcm裝有泥炭和珍珠巖的穴盤 中，置于l〇-25°C溫室(晝20-25°C，夜10-15°C)中進(jìn)行發(fā)芽培養(yǎng)成苗，每天觀察1次，測(cè)定發(fā) 芽時(shí)間，發(fā)芽培養(yǎng)90d測(cè)定發(fā)芽率、苗高、整個(gè)牡丹幼苗植株的干重，計(jì)算發(fā)芽率。數(shù)據(jù)用 SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。
[0184] 其中，以胚芽露出種皮為發(fā)芽。
[0185] 發(fā)芽率=(1^/LO') X 100%;
[0186] LI':發(fā)芽實(shí)驗(yàn)種子中發(fā)芽種子粒數(shù);LO':發(fā)芽實(shí)驗(yàn)種子粒數(shù)。
[0187] 結(jié)果如表3-表5所示，菌劑組層積處理的生根時(shí)間比對(duì)照組層積處理提前了 10天； 菌劑組層積處理的生根率達(dá)到95.0%，比對(duì)照組層積處理的生根率提高了33.8% ;菌劑組 層積處理的主根長度為69.0mm，是對(duì)照組層積處理的1.68倍;菌劑組層積處理的主根長度 2 40mm的種子百分率達(dá)到90±0.5%，是對(duì)照組層積處理的1.3倍;菌劑組層積處理的發(fā)芽 時(shí)間比對(duì)照組層積處理縮短了 10天;菌劑組層積處理的發(fā)芽率達(dá)到99.0%，是對(duì)照組層積 處理的1.2倍;菌劑組層積處理的苗高是對(duì)照組層積處理的1.77倍，菌劑組層積處理的干重 是對(duì)照組層積處理的2.27倍。說明以多粘類芽孢桿菌（？3611；^3(3；[11118口017111713)031 1101CGMCC No.8527為活性成分的促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑顯著地促進(jìn)了牡丹種 子的生根(胚根萌發(fā))和發(fā)芽(胚芽萌發(fā))和牡丹幼苗的生長。圖1顯示了菌劑組層積處理和 對(duì)照組層積處理部分種子生根培養(yǎng)60天的情況。
[0188] 表3、菌劑處理對(duì)牡丹種子生根的影響
[0190] 注:表中同列的英文字母表示差異顯著程度，相同字母的處理間在0.05水平無顯 著差異，字母不同的處理間在0.05水平有顯著差異。生根時(shí)間是指第1粒種子生根的時(shí)間。 [0191]表4、菌劑處理對(duì)牡丹種子發(fā)芽的影響
L0193」注：表中同列的英文字母表示差異顯著程度，相同字母的處理間在0.05水平無顯 著差異，字母不同的處理間在0.05水平有顯著差異。發(fā)芽時(shí)間是指第1粒主根長度2 40mm的 生根種子發(fā)芽的時(shí)間。
[0194]表5、菌劑處理對(duì)牡丹幼苗生長的影響
[0196] 注:表中同列的英文字母表示差異顯著程度，相同字母的處理間在0.05水平無顯 著差異，字母不同的處理間在0.05水平有顯著差異。苗高是幼苗地上部分的高度，干重是整
【主權(quán)項(xiàng)】
1 ·多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101在制備下述A1 )_A3)中的任一 種菌劑中的應(yīng)用： A1)促進(jìn)牡丹生長和拮抗病原菌的菌劑； 所述病原菌為牡丹葡萄孢菌（Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢霉（Cladosporium paeoniae)和茍藥雜色尾抱霉菌(Cercospora varricolor Winter)中的三種、任兩種或任 一種； A2)詰抗病原菌的菌劑;所述病原菌為牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢 霉（Cladosporium paeoniae)和茍藥雜色尾抱霉菌（Cercospora varricolor Winter)中的 二種、任兩種或任一種； A3)促進(jìn)牡丹生長的菌劑； 所述多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101在中國微生物菌種保藏管 理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)為CGMCC No.8527。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述促進(jìn)牡丹生長體現(xiàn)為下述B1 )-B7)中 的任一種： B1)縮短牡丹種子生根時(shí)間； B2)提高牡丹種子生根率； B3)縮短牡丹種子的發(fā)芽時(shí)間； B4)提高牡丹種子的發(fā)芽率； B5)提高牡丹的主根長度； B6)提高牡丹苗高； B7)提高牡丹幼苗生物量。3. 促進(jìn)牡丹生長的方法，包括在生根前將浸種后的牡丹種子用菌劑處理1-3小時(shí)再進(jìn) 行生根培養(yǎng)的步驟；所述菌劑的活性成分為所述多粘類芽孢桿菌（Paenibaci 1 lus polymyxa)CSM 1101〇4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述促進(jìn)牡丹生長體現(xiàn)為下述Bl)-B7)中 的任一種： B1)縮短牡丹種子生根時(shí)間； B2)提高牡丹種子生根率； B3)縮短牡丹種子的初萌期； B4)提高牡丹種子的發(fā)芽率； B5)提高牡丹的主根長度； B6)提高牡丹苗高； B7)提高牡丹幼苗生物量； 所述詰抗病原菌為詰抗牡丹葡萄孢菌（Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢霉 (Cladosporium paeoniae)和茍藥雜色尾抱霉菌（Cercospora varricolor Winter)中的三 種、任兩種或任一種。
【文檔編號(hào)】A01C1/00GK105861378SQ201610308942
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2014年3月26日
【發(fā)明人】韓繼剛, 王云山, 胡永紅
【申請(qǐng)人】上海辰山植物園