一株糞產(chǎn)堿菌及其降解赭曲霉毒素a的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株糞產(chǎn)堿菌及其降解赭曲霉毒素A的應(yīng)用。該糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)ASAGF?0D1，其保藏編號為CGMCC No.12100。本發(fā)明還提供了含有該保藏菌株的生物脫毒劑及其制備方法。此外，本發(fā)明還提供了所述菌株或生物脫毒劑在降解赭曲霉毒素A中的應(yīng)用。CGMCC No. 1210020160125
【專利說明】
一株糞產(chǎn)堿菌及其降解赭曲霉毒素 A的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一株奠產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)，該菌可用來降解食品或飼料 中赭曲霉毒素 A。
【背景技術(shù)】
[0002] 赭曲霉毒素 (Ochratoxin Α，0ΤΑ)是一種真菌產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在 于食品和飼料中，具有腎毒性、致癌性、致畸性、神經(jīng)毒性和免疫毒性等，對動物和人體健康 有很大的危害。
[0003] 對飼料和食品中OTA污染控制的主要措施有物理、化學(xué)及生物脫毒技術(shù)。利用吸 附、加熱和輻射等物理方法不能有效地控制食品或飼料中OTA的含量?；瘜W(xué)法主要通過氧 化、酸堿等作用可以有效降解轉(zhuǎn)化0ΤΑ，但營養(yǎng)成分被極大的破壞，并造成化學(xué)試劑殘留對 健康危害的不確定性。此外，物理和化學(xué)法也因處理操作困難、處理成本高等問題難以擴大 應(yīng)用。生物法脫毒主要利用微生物本身或其代謝產(chǎn)物來降解0ΤΑ，具有作用條件溫和、處理 效率高、不會造成營養(yǎng)物質(zhì)流失等優(yōu)點，且能有效避免化學(xué)法和物理法導(dǎo)致的試劑殘留和 副產(chǎn)物安全性等問題，具有十分良好的應(yīng)用前景。微生物或酶因其反應(yīng)的準(zhǔn)確性、有效性和 環(huán)保性而長久以來是人們關(guān)注的熱點。目前，OTA的降解菌和降解酶的研究已取得一定的進(jìn) 展，其中細(xì)菌有乳酸桿菌Lactobacillus sp.、枯草桿菌Bacillus subtilis、乙酸f丐不動桿 菌Acinetobacter calcoaceticus、紅串紅球菌Rhodococcus erythropolis等，真菌有黑曲 霉 Aspergillus n i ger、煙曲霉Aspergi I Ius fumigatus、炭黑曲霉 Aspergi I Ius carbonarius、釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae、梓檬形克勒克氏酵母Kloeckera apiculatas等。目前，未見關(guān)于糞產(chǎn)堿菌降解赭曲霉毒素 A的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一株可以降解赭曲霉毒素 A(0chratoxin Α，0ΤΑ)的糞產(chǎn)堿 菌，利用該菌降解OTA的方法安全簡便、綠色無殘留。
[0005] 本發(fā)明的另一個目的是利用所述糞產(chǎn)堿菌制成各種降解赭曲霉毒素 A的產(chǎn)品。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供一株糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)，菌名為ASAGF-0D1，分類名 為:奠產(chǎn)堿菌Alcal igenes faecal is，已于2016年1月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心(CGMCC)(地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微 生物研究所，郵編100101)，其保藏編號為CGMCC No. 12100。與其它生物的情況一樣，本發(fā)明 具有降解赭曲霉毒素 A的糞產(chǎn)堿菌Alcaligenes faecalis仍然易發(fā)生變異。因此，可以利用 本領(lǐng)域已知的物理和化學(xué)誘變方法得到該菌株的突變株。這些突變株，只要保留了赭曲霉 毒素 A降解能力這樣一個特征，也屬于本發(fā)明的一部分。
[0008] 糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1的培養(yǎng)方法:用LB固體培養(yǎng)基于30°C培養(yǎng);液體培養(yǎng)時搖床的 轉(zhuǎn)速為220r/min。該菌在LB培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)30h后，以1%。的接種量接種于50mL培養(yǎng)基中進(jìn)行 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，即獲得糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1的發(fā)酵液。
[0009]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方:胰蛋白胨l〇g、酵母浸粉5g、氯化鈉 10g，瓊脂1.5%，加蒸 餾水至比4!17.〇-7.2，121°(：滅菌2〇11^11。
[0010] 糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性。（表1)
[0011] 表1糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性。
[0014]本發(fā)明還提供了一種生物脫毒劑，它的活性成分為糞產(chǎn)堿菌（Alcaligenes faecal is )ASAGF_0D1，或其細(xì)胞內(nèi)溶物，例如胞內(nèi)蛋白，所述奠產(chǎn)堿菌（Alcal igenes faecalis)ASAGF-0Dl保藏編號為CGMCC No. 12100。該生物脫毒劑可以是液體劑型也可以是 固體劑型，并通過現(xiàn)有技術(shù)中已公開的制備方法來制備。具體地，本發(fā)明提供了一種上述生 物脫毒劑的制備方法，該方法包括：
[0015]將保藏編號為CGMCC如.12100的糞產(chǎn)堿菌4346?-001活化，多級擴培，當(dāng)菌體處于 穩(wěn)定期時，收集發(fā)酵液，制備成液體型生物脫毒劑。優(yōu)選地，該發(fā)酵液經(jīng)自然沉降、離心、過 濾等不影響菌體活性的方法濃縮后得到濃度較高的菌懸液;更優(yōu)選地，所述菌懸液還可以 加入營養(yǎng)液或營養(yǎng)液和保護(hù)劑的混合液，制備成液體型生物脫毒劑。進(jìn)一步地，也可以利用 本領(lǐng)域現(xiàn)有方法制備將該液體型生物脫毒劑制成固體型生物脫毒劑，例如加入吸附劑等。 [0016]本發(fā)明制備生物脫毒劑的方法還可以包括:將保藏編號為CGMCC No. 12100的糞產(chǎn) 堿菌ASAGF-0D1活化，多級擴培，當(dāng)菌體處于穩(wěn)定期時，收集發(fā)酵液，該發(fā)酵液經(jīng)自然沉降、 離心、過濾等不影響菌體活性的方法濃縮后得到濃度較高的菌懸液或菌體細(xì)胞，利用均質(zhì)、 超聲等現(xiàn)有的方法進(jìn)行破碎，除去菌體細(xì)胞碎片等雜質(zhì)后通過濃縮獲得濃度較高的蛋白 液，制得液體型生物脫毒劑。進(jìn)一步地，也可以利用本領(lǐng)域現(xiàn)有方法制備將該液體型生物脫 毒劑制成固體型生物脫毒劑，例如加入吸附劑等。
[0017] 上述生物脫毒劑可采用本領(lǐng)域的常規(guī)包裝技術(shù)包裝，依據(jù)具體環(huán)境條件保存。
[0018] 本發(fā)明還要求保護(hù)所述糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1或上述生物脫毒劑在降解赭曲霉毒素 A中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明的優(yōu)點在于:本發(fā)明提供的糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1對OTA具有降解作用，降解 產(chǎn)物為赭曲霉毒素 α，毒性降低至少1000倍，無免疫毒性，OTA在大鼠體內(nèi)的半衰期為103h， 而赭曲霉毒素 α縮短至9.6h。本發(fā)明提供的糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1或其細(xì)胞內(nèi)溶物對赭曲霉毒 素 A的降解率均可達(dá)到100%，且降解反應(yīng)為不可逆的生物降解。此外，本發(fā)明提供的糞產(chǎn)堿 菌ASAGF-0D1可用于制備赭曲霉毒素 A的生物脫毒劑，可應(yīng)用于大規(guī)模赭曲霉毒素 A污染廢 棄物的脫毒處理。
【附圖說明】
[0020] 圖1溫度對糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1脫毒率的影響。
[0021] 圖2不同處理對糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1脫毒能力的影響。
[0022] 圖3 OTA標(biāo)準(zhǔn)品和經(jīng)糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1細(xì)胞內(nèi)溶物處理的OTA樣品的色譜圖。注： A-內(nèi)溶物;B-OTA標(biāo)準(zhǔn)品；C-經(jīng)細(xì)胞內(nèi)溶物處理的OTA樣品。
[0023]圖4經(jīng)糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1內(nèi)溶物處理的OTA樣品的總離子峰、OTa和OTA的提取離 子圖。注:A-總離子峰;B-OTa的提取離子圖；C-OTA標(biāo)準(zhǔn)品的提取離子圖。
[0024]圖5經(jīng)糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1內(nèi)溶物處理的OTA樣品的OTa二級質(zhì)譜圖。圖6糞產(chǎn)堿菌 ASAGF-0D1的掃描電鏡照片（X30000)。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但并不是限定本發(fā)明。下述實施例 中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說 明，均為常規(guī)生化試劑供應(yīng)商購買得到。
[0026] 實施例1奠產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)ASAGF_ODl分離、純化與鑒定
[0027]從北京市昌平區(qū)北七家國家糧食局科學(xué)研究院中試基地中采集土樣，以96孔深孔 板為培養(yǎng)載體，采用微量富集培養(yǎng)方法，首先將樣品在無菌水中制成菌懸液，以10%的接種 量接種于OTA-LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中OTA終濃度為lμg/ml，培養(yǎng)7天后再以10%接種量 移種，培養(yǎng)基中OTA濃度不變。經(jīng)過連續(xù)5次移種后，檢測OTA含量，以未接菌含相同OTA濃度 的OTA-LB培養(yǎng)基為陰性對照。將具有降解OTA的菌懸液按稀釋涂布法以合適的稀釋度涂布 在LB瓊脂平板，30°C培養(yǎng)72h后，挑取分離程度良好且菌落形態(tài)不同的單菌落，在OTA濃度為 lμg/ml的OTA-LB培養(yǎng)基中進(jìn)行脫毒試驗，檢測OTA的含量，經(jīng)過反復(fù)的篩選最終獲得一株能 夠降解OTA的菌株，編號為OD-I。挑取OD-I單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)期中期時， 用50%的甘油與培養(yǎng)物等體積混合后置于-80°C保存。其中LB培養(yǎng)基的配方:胰蛋白胨10g、 酵母浸粉5g、氯化鈉10g，瓊脂1.5%，加蒸餾水至11^4!17.〇-7.2，121 <€滅菌2〇111；[11。
[0028]采用形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA序列分析等分類法對降解菌株進(jìn)行分類鑒定。 [0029] ODl的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性見表1。
[0030] 16S rDNA序列分析：利用引物27f (5 ' -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 '）和1492r (5 ' - TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行PCR擴增，長度為 1460bp的 16S rDNA序列（16S rDNA如序 列表中SEQ ID No.3所示)與Genbank數(shù)據(jù)庫中已有序列進(jìn)行BLAST比對，該序列與糞產(chǎn)堿菌 16S rDNA同源性很高(99.0%)。
[0031] 參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》(第九版)對革蘭氏陰性好氧菌的描述，結(jié)合OD-I形態(tài) 學(xué)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析結(jié)果，將該菌鑒定為Alcaligenes faecal is。
[0032] 本發(fā)明OD-I菌株已于2016年1月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心(CGMCC)(地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所， 郵編100101)，其保藏編號為CGMCC No. 12100。實施例2赭曲霉毒素 A和赭曲霉毒素 α的檢測 方法
[0033] HPLC-FLD 檢測方法：
[0034]檢測方法參照Bragulat et al · (Bragulat，M.，Abarca，M.，&Cabafies，F(xiàn). (2001) .An easy screening method for fungi producing ochratoxin A in pure culture. Int J Food Microbiol ,71(2) ,139-144·)的方法并改進(jìn)。具體如下:吸取600yL樣 品，于14000r/min下離心10min，取上清用0.22μηι濾膜過濾，用HPLC-FLD進(jìn)行分析或?qū)悠?于4°C保存。
[0035] 檢測條件:Agilent 5TC-C18(2)反相色譜柱（250 X4.6mm，5ym);流動相為乙腈： 水：乙酸（57:41:2);等度洗脫，流速：lmL/min，進(jìn)樣量:20yL;柱溫：30°C ;;激發(fā)波長330nm， 發(fā)射波長460nm〇
[0036] UPLC-MS/MS 檢測方法：
[0037] 色譜條件:Waters Cortecstm UPLC C18色譜柱（IOOmmX 2· 1mm，1 ·6μηι)，流動相A 為甲醇，B為含0.1 %甲酸和ImM乙酸銨的水溶液，洗脫梯度:0~2min，90%Β; 2~3min，90%Β ~80%Β;3 ~4min，80%B~79%Β;4~5min，79%B~74%Β;5~7min，74%B;7~10.5min， 74%B ~40%B;10.5~13.5min，40%B;13.5~14.5min，40%B~5%B ;14.5~17min，5%B; 17 ~18min，5%B ~90%B;18 ~21min，90%B;進(jìn)樣量：2yL;流速：0.3mL/min;柱溫：40°C。
[0038] 質(zhì)譜條件:加熱電噴霧離子源(HESI)溫度為300°C ;毛細(xì)管電壓為3.2kV;離子傳輸 管溫度為320°C;鞘氣為35unit，輔助氣為10unit;full scan/ddms2掃描模式:采集范圍為 200~800Da，正離子采集;一級質(zhì)譜分辨率為70000FWHM，二級質(zhì)譜分辨率為17500FWHM;碰 撞池能量(NCE)為35eV;tS頂掃描模式:正離子采集，分辨率70000FWHM，質(zhì)荷比寬度為4Da。
[0039] 實施例3糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1用于降解赭曲霉毒素 A
[0040] 糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1培養(yǎng):挑取糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1(保藏號：CGMCC No. 12100)單 菌落，接種于3mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度30°C，轉(zhuǎn)速220r/min，培養(yǎng)時間30h。發(fā)酵結(jié)束 后，將發(fā)酵液保存于4°C備用。
[0041 ] 取制備的糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1發(fā)酵液50yL，接種于50mL OTA-LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫 度為30和37°C每隔12h取樣測定OTA含量并計算脫毒率。試驗重復(fù)至少3次。
[0042]其中LB培養(yǎng)基的配方:胰蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化鈉10g，瓊脂1.5%，加蒸餾 水至比4耵.〇-7.2，121°(：滅菌2〇11^11。
[0043]其中OTA-LB培養(yǎng)基制備方法:將一定體積的赭曲霉毒素 A母液(0 . lmg/mL)轉(zhuǎn)移至 無菌三角瓶中，用氮吹儀于50°C下吹干，加入一定體積的LB培養(yǎng)基充分溶解，配成赭曲霉毒 素 A終濃度為lyg/mL的OTA-LB培養(yǎng)基后按需分裝。
[0044] 其中OTA的HPLC-FLD檢測方法參見實施例2。
[0045] 檢測結(jié)果:37 °C下培養(yǎng)時，糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1反應(yīng)36h，降解率為100 % ; 25°C下培 養(yǎng)時，反應(yīng)36h，降解率為71 %，反應(yīng)48h，降解率為98 %，反應(yīng)72h，降解率為100 %。（圖1) [0046] 實施例4糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1降解機理的初步研究
[0047] 糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1培養(yǎng):取實施例3中的制備的糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1發(fā)酵液50yL， 接種于50mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度30°C，轉(zhuǎn)速220r/min，培養(yǎng)時間30h。所述發(fā)酵培養(yǎng) 基的配方:胰蛋白胨IOg、酵母浸粉5g、氯化鈉 IOg，瓊脂1.5 %，加蒸餾水至IL，pH7.0-7.2， 121°C滅菌20min。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液保存于4°C備用。
[0048] 取上述糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1發(fā)酵液，離心（8000r/min，4°C，10min)，分別收集菌體 和上清。收集的菌體用0.85%生理鹽水沖洗2次后重懸（IO 8~109CFU/mL)，分為3等份，一份 不做任何處理，一份使用高壓滅菌鍋滅活（12?Γ，20π?η)，一份使用高壓均質(zhì)機均質(zhì)破碎 (301^^，4°〇后離心（1200(^/1^11，4°(：，101^11)，收集上清液，得到細(xì)胞內(nèi)溶物。
[0049]發(fā)酵液上清降解赭曲霉毒素 A:取200yL的赭曲霉毒素 A，使用氮吹儀吹干后，加入 20mL的發(fā)酵液上清溶解(0ΤΑ終濃度為lyg/mL)，在第0.6、12、24、36和48h測定OTA的含量，并 計算脫毒率。
[0050]菌體降解赭曲霉毒素 A:取200yL的赭曲霉毒素 A，使用氮吹儀吹干后，加入20mL的 菌體懸液溶解(0ΤΑ終濃度為lyg/mL)，在第0.6、12、24、36和48h測定OTA的含量，并計算脫毒 率。
[0051]滅活菌體降解赭曲霉毒素 A:取200yL的赭曲霉毒素 A，使用氮吹儀吹干后，加入 20mL滅活菌體溶液溶解(0ΤΑ終濃度為lyg/mL)，在第0.6、12、24、36和48h測定OTA的含量，并 計算脫毒率。
[0052 ]細(xì)胞內(nèi)溶物降解赭曲霉毒素 A:取200yL的赭曲霉毒素 A母液，使用氮吹儀吹干后， 加入20mL的內(nèi)溶物溶解(0ΤΑ終濃度為lyg/mL)，在第0.6、12、24、36和48h測定OTA的含量，并 計算脫毒率。
[0053] 其中HPLC-FLD的檢測方法參見實施例2。
[0054]檢測結(jié)果:發(fā)酵液上清具有微弱的降解能力；滅活菌體沒有降解OTA的能力；未經(jīng) 處理的菌體培養(yǎng)24h的降解率為59 %，培養(yǎng)48h時，降解率為76 % ;細(xì)胞內(nèi)溶物培養(yǎng)0.6h的降 解率為100%，這說明降解赭曲霉毒素 A的活性物質(zhì)主要存在于菌體內(nèi)。（圖2)。
[0055]實施例5赭曲霉毒素 A降解產(chǎn)物分析
[0056]以實施例5所述制備內(nèi)溶物，取200yL的赭曲霉毒素 A母液，使用氮吹儀吹干后，用 20mL的內(nèi)溶物溶解赭曲霉毒素 A(終濃度為lyg/mL)，反應(yīng)Ih后用HPLC-FLD和UPLC-MS/MS檢 測分析。
[0057] 檢測結(jié)果：經(jīng)HPLC-FLD檢測OTA的保留時間為9.453min，反應(yīng)Ih，0ΤΑ降解率為 100 % ;在4.824min出現(xiàn)一新峰，可能為OTA的降解產(chǎn)物（圖3-A，3-B，3-C)，經(jīng)UPLC-MS/MS分 析，該峰的保留時間分別為10.54min(圖4-C)，結(jié)合其二級質(zhì)譜裂解碎片信息（圖5)可以確 定此為OTa的離子峰。因此，Hl菌株的降解產(chǎn)物中確含OTa。
[0058]顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對 本發(fā)明的實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可 以做出其它不同形式的變化或變動。這里無法對所有的實施方式予以窮舉。凡是屬于本發(fā) 明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。
【主權(quán)項】
1. 一株糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)ASAGF-〇Dl，其保藏編號為CGMCC Νο·12100〇2. 一種生物脫毒劑，它的活性成分為奠產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)ASAGF_ODl或 其細(xì)胞內(nèi)溶物，所述糞產(chǎn)堿菌（Alcaligenes faecal is )ASAGF-0D1保藏編號為CGMCC Νο·12100〇3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物脫毒劑，其特征在于，所述生物脫毒劑為液體型或固體 型。4. 一種權(quán)利要求2所述的生物脫毒劑的制備方法，其特征在于，該方法包括:將保藏編 號為CGMCC No . 12100的糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1活化，多級擴培，當(dāng)菌體處于穩(wěn)定期時，收集發(fā) 酵液，制得液體型生物脫毒劑;或 將保藏編號為CGMCC No. 12100的糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1活化，多級擴培，當(dāng)菌體處于穩(wěn)定 期時，收集發(fā)酵液，然后破碎菌體，獲得細(xì)胞內(nèi)溶物，制得液體型生物脫毒劑。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物脫毒劑的制備方法，其特征在于，該方法還包括將液體型 生物脫毒劑制成固體型生物脫毒劑的步驟。6. 權(quán)利要求1所述的糞產(chǎn)堿菌ASAGF-0D1在降解赭曲霉毒素 A中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求2或3所述的生物脫毒劑在降解赭曲霉毒素 A中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/05GK105861368SQ201610250530
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月21日
【發(fā)明人】張曉琳, 張宏海, 汪洋, 趙晨
【申請人】國家糧食局科學(xué)研究院