用于阻止脫靶效應而變形的rna干擾誘導核酸及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及RNA干擾誘導核酸及其用途，更具體地說，涉及RNA干擾誘導核酸，在RNA干擾誘導核酸的雙鏈的至少一個單鏈中，被變成為將5ˊ末端和3ˊ末端區(qū)域取代為沒有堿基(base)的形式。本發(fā)明的RNA干擾誘導核酸，可提供新型變形形狀的核酸及使用其的目標基因的選擇性表達抑制方法，用來防止用RNA干擾現(xiàn)象來抑制目標基因的表達時發(fā)生的脫靶效應。此外，根據(jù)本發(fā)明的RNA干擾誘導核酸，提供一種新型變形形狀的RNA干擾誘導核酸，在抑制目標基因的表達的同時可以防止脫靶效應，具有目標選擇性及特異性，從而來解決現(xiàn)有RNA干擾誘導核酸的問題，即可以放心作為抑制基因表達的方法來進行研究和基因治療，緩解因脫靶效應引起的不準確性及副作用。
【專利說明】
用于阻止脫靶效應而變形的RNA干擾誘導核酸及其用途
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及RNA干擾誘導核酸及其用途，更具體地說，涉及RNA干擾誘導核酸，在 RNA干擾誘導核酸的雙鏈的至少一個單鏈中，包含在5'末端和3'末端區(qū)域中以間隔物取代 的變形。
【背景技術】
[0002] siRNA(小干擾RNA)已被廣泛地用作通過干擾來抑制預期目標基因的表達的技術， 但是，作為其不可避免的缺點，別的基因也會被非特異地抑制，脫靶效應的產(chǎn)生會帶來錯誤 研究結果和治療副作用，這是令人非常擔憂的。這種脫靶效應，是因為在RNA干擾中起到核 心作用的AGO (Ar gonaute)蛋白被人工導入的s i RNA，會被當作跟細胞內(nèi)存在的微RNA-樣對 待，從而產(chǎn)生的。因此其被稱為微RNA類似脫革E效應(miRNA-like off-target effect)。微 RNA，通過種子區(qū)域(seed region;5'端的第二個到第七個）的堿基配對(base pairing)來 識別主要目標基因并抑制其表達，而siRNA也依賴相同的位置即種子區(qū)域位置的序列，因此 產(chǎn)生脫靶效應。這種siRNA的微RNA類似脫靶現(xiàn)象已在很多研究中被報告出（Jackson，A.L.， et al·，Nat·Biotechnol·，21(6):635，2003;Jackson，A.L·，et al·，Rna，12(7):1179， 2006；Birmingham et al.,Nat.Methods,3(3)：199,2006；Lin et al.,Nucleic Acids Res.，33(14):4527,2005;Anderson et al.，1?熟，14(5):853,2008)，根據(jù)種子部分的序列， 影響少則幾百多則約1500個左右的基因的表達，在使用siRNA的表達型掃描檢查過程中，陽 性命中中有多達30%的表達型呈現(xiàn)出了這種脫靶，其副作用是很嚴重的。此外，微RNA的情 況，種子部分和靶之間的配對很弱時，已經(jīng)有報告表明通過3'端部分中的補償配對（3'_ compensatory pairing)來抑制基因的表達的現(xiàn)象，因此，據(jù)認為，微RNA類似脫革El現(xiàn)象也會 被由這樣的機制來呈現(xiàn)。
[0003] 另外，觀察通過siRNA介導的廣泛的脫靶表達抑制效應，為了在維持預期的目標的 表達抑制效率的同時只減少脫靶表達抑制，siRNA中嘗試了幾種任意的化學或結構變更。 Dharmacon研究(拉斐特，CO)中研究使用的變形，向siRNA上的核苷酸的中核糖基環(huán)的2 '位 置上添加甲基(2'0Me)來減少脫靶效應，尤其是，5'端第二位置的2'0Me變形，對預期的目標 的表達抑制的影響多少會變?nèi)酰鞘状伪话l(fā)現(xiàn)，對減少脫靶效應的次數(shù)和程度都有效果。 此后作為其他形狀的變形，LNA變形或(Puri et al.，Nucleic Acids Symp .Ser .2008)，UNA 變形（Bramsen et al ·，Nucleic Acids Res · 2010; 38，5761_73)，還開發(fā)了導入單一核苷酸 凸起(bulge)的結構。但是，此類所有化學變形，并不是對產(chǎn)生脫靶的最重要的堿基配對本 身加以變形，而是加到核苷酸骨架(backbone)上，并不對根本的堿基配對產(chǎn)生影響。因為這 個原因，它盡管可以減少脫靶效應，但是并不能完全阻止其發(fā)生，此外，其還呈現(xiàn)出了還會 減少命中目標抑制效率的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 要解決的技術問題
[0005] 因此，本發(fā)明人為了解決現(xiàn)有技術的問題，開發(fā)了一種目標基因抑制效率高并且 可以完全阻斷脫靶效應的變形RNA干擾誘導核酸，從而完成了本發(fā)明。
[0006] 因此，本發(fā)明的目的在于提供一種RNA干擾誘導核酸，其特征在于，在RNA干擾(RNA interference)誘導核酸的雙鏈的至少一個單鏈中，包括至少一個從5 '末端起第六個核苷 酸或從3'末端起第一個和第二個核苷酸被取代為間隔物的變形。
[0007] 本發(fā)明的另一目的，是提供一種用于抑制基因的表達的化合物，其含所述RNA干擾 誘導核酸。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供一種用于抑制基因的表達的試劑盒，其含有所述RNA干 擾誘導核酸。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供一種用于抑制細胞內(nèi)目標基因的表達的方法，其包括將 所述RNA干擾誘導核酸導入細胞內(nèi)，或使其在細胞內(nèi)表達的步驟。
[0010] 本發(fā)明的另一目的是提供一種用于抑制RNA干擾誘導基因的引導鏈（guide strand)或過客鏈(passenger strand)引起的脫祀效應的方法，其包括將所述的RNA干擾誘 導核酸導入細胞內(nèi)或使其在細胞內(nèi)表達的步驟。
[0011]但是，通過本發(fā)明來實現(xiàn)的技術課題，并不限于上述課題，其中沒有提及的其他課 題，本領域技術人員可通過下面的詳細描述來清楚理解。
[0012]技術方案
[0013] 為了達到本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供一種RNA干擾誘導核苷酸，其特征在于， 在RNA干擾(RNA interference)誘導核酸的雙鏈的至少一個單鏈中，包括至少一個從5'末 端起第六個核苷酸被取代為間隔物，或從3'末端起第一個和第二個核苷酸被取代為間隔物 的變形。
[0014] 在本發(fā)明的實施例中，所述RNA干擾誘導核酸的雙鏈中，成為變形對象的單鏈，只 存在為單鏈，如引起RNA干擾現(xiàn)象的ss_siRNA(single strand siRNA) -樣，具有可與AGO (argonaute)蛋白結合的能力。
[0015] 在本發(fā)明的另一實施例中，所述間隔物，是可以維持核苷酸位置的空間的化合物， 優(yōu)選有機化合物，最優(yōu)選為含有磷酰基或磺?；牧u基碳鏈，所述羥基碳鏈可以是至少一 個碳原子數(shù)為3的烷基鏈(C3間隔物）。
[0016] 在本發(fā)明的另一實施例中，所述間隔物，可以是與生體堿基結合無法進行堿基配 對的，可以是作為非堿基形狀以脫氧核糖核苷酸（Deoxyribo nucleotide)為骨架的 dSpacer或核糖核苷酸(Ribo nucleotide)為骨架的rSpacer分子。
[0017] 在本發(fā)明的另一實施例中，所述RNA干擾誘導核酸，可進一步包括：由于取代引起 的與目標基因的RNA的不一致堿基配對(mismatch base pairing)或由于插入引起的凸起 生成。
[0018] 在本發(fā)明的另一實施例中，所述核酸，可以是siRNA、miRNA、shRNA、DsiRNA、 1811?嫩、88-811?嫩、&811?嫩411?嫩或611(1〇-811?嫩等引起干擾表達的所有核酸。
[0019] 在本發(fā)明的又一實施例中，所述核酸，可像miRNA(微RNA)-樣，當與全部序列相輔 的目標基因不存在于生體中時，其可喪失功能，在這種情況下，可提供與RNA干擾相關聯(lián)的 對照群。
[0020] 在本發(fā)明的又一實施例中，所述核酸想要通過RNA干擾來抑制的目標基因，可以上 在最廣義中表示的基因，在包含病毒在內(nèi)的所有生物體中被轉(zhuǎn)錄(transcription)，可以是 以RNA介導的所有編碼(coding)或非編碼(non-coding)基因。
[0021] 在本發(fā)明的又一實施例中，所述RNA干擾誘導核酸，可以是抑制目標基因的表達的 用途，上述雙鏈，可以在人為組成的形狀或生體中再次變形。
[0022] 本發(fā)明提供用于抑制基因表達的化合物和試劑盒，其含有所述RNA干擾誘導核酸。
[0023] 另外，本發(fā)明提供用于抑制細胞內(nèi)目標基因的表達的方法，其包括將所述RNA干擾 誘導核酸導入細胞內(nèi)的或使其在細胞內(nèi)表達的步驟。
[0024]此外，本發(fā)明提供用于抑制RNA干擾誘導核酸的引導鏈(gui de strand)或過客鏈 (passenger strand)引起的脫祀效應的方法，其包括將所述的RNA干擾誘導核酸導入細胞 內(nèi)的步驟。
[0025]進一步，本發(fā)明提供用于抑制RNA干擾誘導核酸的引導鏈(guide strand)或過客 鏈(passenger strand)引起的脫革巴效應的方法，其包括使所述RNA干擾誘導核酸在細胞內(nèi) 表達的步驟。
[0026]有益效果
[0027] 本發(fā)明的RNA干擾誘導核酸，可提供新型變形形狀的核酸及使用其的目標基因的 選擇性表達抑制方法，用來防止用RNA干擾現(xiàn)象來抑制目標基因的表達時發(fā)生的脫靶效應。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的RNA干擾誘導核酸，具有以下特征，其提供新型變形形狀的RNA干擾 誘導核酸，在抑制目標基因的表達的同時可以防止脫靶效應，具有目標選擇性及特異性，從 而來解決現(xiàn)有RNA干擾誘導基因的問題，即可以放心作為抑制基因表達的方法來進行研究 和基因治療，緩解因脫靶效應引起的不準確性及副作用。
[0029] 附圖簡述
[0030] 圖1以圖表示出了被變形為脫氧核糖核苷酸間隔物(dSpacer)的核酸的基因表達 命中目標抑制效果和微RNA類似脫靶效應抑制的圖表。
[0031] 圖2示出了被脫氧核糖核苷酸間隔物(dSpacer)取代變形的SiRNA分子的基因表達 抑制效果和微RNA類似脫靶效應。
[0032]圖3示出了被核糖核苷酸間隔物(rSpacer)取代變形的SiRNA分子的基因表達抑制 效果和微RNA類似類似脫靶效應。
[0033]圖4示出了被插入脫氧核糖核苷酸間隔物(dSpacer)的變形的SiRNA分子的基因表 達抑制效果和微RNA類似脫靶效應。
[0034]圖5示出了被插入核糖核苷酸間隔物(rSpacer)的變形的S iRNA分子的基因表達抑 制效果和微RNA類似脫靶效應。
[0035]圖6通過比較示出了以5'末端為基準第六個核苷酸被取代變形為脫氧核糖核苷酸 間隔物(dSpacer)的形狀(6pi)的siRNA分子對miRNA分子的目標基因調(diào)整功能的影響，及現(xiàn) 有的5 '末端第二個部分的2 ' OMe變形的s iRNA分子與效果。
[0036]圖7示出了在細胞內(nèi)siRNA(PCSK9)的脫靶效應及根據(jù)本發(fā)明被變更為6pi后評價 其脫靶效應的結果。
[0037]圖8示出了在生體內(nèi)siRNA(PCSK9)的脫靶效應及根據(jù)本發(fā)明被變更為6pi后評價 其脫靶效應的結果。
[0038]圖9示出了現(xiàn)有的不一致堿基配對(mismatch)及2'0Me變形被應用到5'末端的第 六部分的siRNA形狀，與5 '末端第二部分的2 'OMe變形，第六部分的UNA變形，siRNA雙鏈體第 二位置導入凸起的形狀的siRNA分子的相關基因表達抑制效果，與將微RNA類似脫靶效應與 本發(fā)明比較的結果。
[0039]圖10用圖表示出了在RNA干擾誘導核酸的單鏈中，5'端的第六個，被變形為碳原子 數(shù)至少為3的烷基鏈的羥基碳鏈構成的間隔物時，基因表達命中目標抑制效果和微RNA類似 脫靶效應抑制。
[0040] 圖11示出了將5'末端的第六位置被由烷基鏈構成的間隔物（C3spaCer)取代的 siRNA分子的基因表達抑制效果，與微RNA類似脫靶效果進行評價的結果。
[0041] 圖12示出了對3'末端的第一個和第二個核苷酸被取代變形為間隔物的siRNA分子 的基因表達抑制效果，和微RNA類似脫靶中3'末端補償結合的相關效果進行評價的結果。
【具體實施方式】
[0042]本發(fā)明的特征在于，提供一種RNA干擾誘導核酸，其特征在于，在RNA干擾（RNA interference)誘導核酸的雙鏈的至少一個單鏈中，包括至少一個從5 '末端起第六個核苷 酸或從3'末端起第一個和第二個核苷酸被取代為間隔物的變形。
[0043] 本發(fā)明人，為找到使用由名為RNA干擾的短RNA誘導的基因抑制現(xiàn)象，來在序列特 異地有效抑制關注目標基因的表達的同時，完全防止脫靶效應的方法進行研究的結果，完 成了本發(fā)明，將RNA干擾誘導核酸的雙鏈中的任何一個單鏈，變形為在5'末端區(qū)域中包含不 含堿基的共價結合如間隔物形狀的非堿基單一核苷酸，由此可以確認到，其具有在可在阻 止微RNA類似脫靶效應的同時有效抑制目標基因的特異性，此外，還可以確認到，在3 '端領 域中包含無堿基的共價結合變形，如間隔物形狀的非堿基單一核苷酸，由此可以確認到，在 阻止因3 '末端補償結合造成的微RNA類似脫靶效應的同時，有效抑制目標基因的特點。
[0044] 即，在本發(fā)明的實施例中，確認到，在從5 '端第6位置上的間隔物變形，在沒有脫靶 的同時還呈現(xiàn)出了最有效的目標基因抑制效果。這與本研究者之前的研究，也就是微RNA識 別機制的相關新模型，即過渡成核模型（transitional nucleation model，納特結構體分 子生物學雜志2012年02月12; 19(3) :321-7)-致，因此，被稱為"樞軸(pivot)"的5'端第6位 置上的堿基配對，可以展示微RNA類似脫靶識別的核心要素。
[0045] 另外，確認到，從所述非堿基核苷酸變形擴張，用間隔物取代從5 '端起第六個位置 上的核苷酸，當?shù)谖鍌€核苷酸和第七個核苷酸與所述間隔物是共價結合形狀時，可以既不 出現(xiàn)脫靶，也可最有效地抑制目標基因。
[0046] 即，在本發(fā)明的一個實施例中，從5 '端起第六位置上的間隔物u變形，其所有種類 可將脫靶效應消除，但是，在上靶效應中，與間隔物變形中大小最大的核糖核苷酸間隔物 (rSpacer)相比，由于2'位置沒有氧原子，所以大小相對較小的脫氧核糖核苷酸間隔物 (dSpacer)更好，作為一個極端的情況，在最小的間隔物形狀的烷基鏈間隔物(C3Spacer) 中，呈現(xiàn)出了與沒有施加變形的形狀的上靶抑制效果類似的情況。這種在5'端第六個上較 小的間隔物呈現(xiàn)出優(yōu)秀的上靶效應的現(xiàn)象，與先前報告的AGO蛋白質(zhì)與微RNA的結構 (Schirle et al，Science 2012,336，1037-40)以及過渡成核模式對照的話，與微RNA在5' 端第六個堿基配對之后為抑制目標而進行的結構及功能的變化這一點上一致。
[0047]在本發(fā)明的另一實施例中，確認到，向?qū)嶋H上以種子部位識別目標顯示功能的微 RNA中的一個，即向miR-124施加本發(fā)明的變形的結果，呈現(xiàn)出了阻止微RNA目標妨礙，其功 能呈現(xiàn)出神經(jīng)細胞分化誘導功能喪失，與此相反，施加先前在Dharmacon公司中開發(fā)出的脫 靶抑制變形，即2'0Me變形時，未能阻止miR-124的功能即神經(jīng)分化誘導，在染色體水平的轉(zhuǎn) 錄表達調(diào)查中，與本發(fā)明的變形方法相比，其抑制效果非常不足。
[0048]在本發(fā)明的其他實施例中，確認到，作為目標基因，將根據(jù)本發(fā)明的siRNA變形應 用到海腎熒光素酶(Renilla Iuciferase)或PCSK9基因妨礙用siRNA上，對其中靶效果和脫 靶效果進行調(diào)查的結果，可以以優(yōu)秀的效率阻止介導鏈造成的脫靶效應，顯示出對目標的 選擇能力得到提高的效果。尤其是，確認到，用于降低血漿膽固醇水平的PCSK9的siRNA的情 況，以動物模型小鼠為對象治療效果，即減少膽固醇水平，其效果與非變形形狀的siRNA效 果相當。
[0049]在本發(fā)明的另一實施例中，作為由PCSK9siRNA引起的脫靶現(xiàn)象，人類肝細胞HepG2 出現(xiàn)了停止細胞周期，在小鼠肝組織中，發(fā)現(xiàn)了由于銅離子代謝異常造成細胞死亡的副作 用，為了改善這一點，施加根據(jù)本發(fā)明的siRNA變形，確認上述副作用及脫靶效應的結果，確 認到，副作用和脫靶現(xiàn)象消失，本來的目標及PCSK9妨礙表達得到了有效的維持。
[0050] 在本發(fā)明的另一實施例中，確認到，將作為現(xiàn)有的微RNA類似脫靶抑制方法而提出 的種子部分的不匹配，向微RNA中的一個，向從miR-124的5'端起第六個中導入時，miR-124 的目標識別形狀的種子匹配(seed match)造成的目標基因妨礙，雖然可以抑制，但是對由 于不匹配導入造成的變形的序列的相關新種子匹配，依然存在可將其識別為目標從而出現(xiàn) 抑制的副作用，將用于抑制現(xiàn)有脫靶的變形方法，即2'0Me變形導入至5'端第六時，同樣也 確認到了上述副作用的存在。
[0051] 在本發(fā)明的另一實施例中，確認到，作為抑制以往的脫靶的變形方法而提出的從 5 '末端起的第2個進行2 ' OMe變形，從5 '末端起的第7個進行UNA變形，在siRNA雙鏈結構中在 介導鏈的5'末端起第二個上形成單一核苷酸凸起的變形被施加時，雖然不能在所有情況下 完美地抑制脫靶，但是本發(fā)明的情況，可以確認到脫靶被完美地抑制。
[0052]在本發(fā)明的另一實施例中，確認到將從5'末端第六個位置上的核苷酸以間隔物取 代，且第五個核苷酸和第七個核苷酸與間隔物共價結合的形狀時，既可以抑制目標基因的 表達，又可以完全地阻止脫靶效應。
[0053] 在本發(fā)明的另一實施例中，確認到，當將從siRNA的3'端起第一和第二核苷酸用沒 有堿基的形狀的間隔物取代時，基因表達抑制效果優(yōu)秀，且可以完美地阻止微RNA類似脫靶 中3'末端補償結合造成的脫靶效應。
[0054] 如上所述，本發(fā)明，可提供抑制目標基因的表達的RNA干擾誘導核苷酸，其特征在 于，在RNA干擾誘導核苷酸的雙鏈中的至少一個單鏈中，用間隔物取代從5'端起第六個位置 上的核苷酸，當?shù)谖鍌€核苷酸和第七個核苷酸與所述間隔物共價結合形狀，或用非堿基核 苷酸或間隔物取代從3'端起第一和第二位置上的核苷酸。
[0055] 在上面，RNA干擾誘導核苷酸優(yōu)選形成雙鏈，其包括由18-23個構成的核苷酸的介 導鏈(guide strand)及與所述介導鏈相輔的過客鏈(passenger strand)，最優(yōu)選是由21個 核苷酸構成，但不限于此。此時，所述雙鏈，可以是具有莖-環(huán)(stem-loop)的發(fā)夾(hairpin) 結構的核酸的莖部分被迪塞爾（Dicer)蛋白質(zhì)加工從而變形成為雙鏈形狀，即，shRNA被加 工形成siRNA形狀，但是其根據(jù)核酸形狀會有所不同，因此其不限于此。此外，為了發(fā)揮最好 的脫祀抑制效果，所述核酸，在3'末端具有兩個核苷酸突起部(overhang)，或者可進一步包 括由于取代造成的目標基因的RNA的不一致堿基配對(mismatch base pairing)或由于插 入造成的凸起(bulge)的生成。術語凸起(bulge)指的是雙鏈的核酸中，由于導入了一個以 上核苷酸，而造成無法配對因此分開的部分，不一致堿基配對，一般指的是堿基對之間的沃 森-克里克堿基配對(Watson-Crick base pairing)沒有形成的情況。
[0056] 在本發(fā)明中，術語"介導鏈(guide strand;antisense strand)"，指的是，作為所 述雙鏈中用于抑制目標的用途而規(guī)定序列的單鏈部分，實際上主要結合至AGO蛋白質(zhì)，作用 在于介導使得AGO復合體可以識別目標基因，作為感興趣的目標基因mRNA中基本上或者 100%具有互補核酸序列的多聚核苷酸，因此其也被叫做"反義鏈"，例如，與siRNA、miRNA、 shRNA、DsiRNA、18丨1?熟、88-8丨1?熟、卩丨1?熟、611(1〇-8丨1?熟或&8丨1?祖等核酸序列全部或一部分互 補，術語"過客鏈(passenger strand;sense strand)"，指的是，所述雙鏈中，和介導鏈形成 雙鏈結構，作用在于幫助使介導鏈與AGO蛋白質(zhì)結合的過客角色，作為與目標核酸具有基本 上或者100%相同的核酸序列的多聚核苷酸，因此被叫做"有義鏈(sense strand)"，例如 siRNA、miRNA、shRNA、DsiRNA、lsiRNA、ss_siRNA、piRNA、end〇-siRNA 或 asiRNA 等核酸序列的 全部或一部分相同的多聚核苷酸。
[0057]本發(fā)明的術語"間隔物（spacer)"是指可以代替單一核苷酸來維持其空間的取代 體，可以維持空間的形狀，并不限于哪一個，優(yōu)選是有機化合物，更優(yōu)選是包含或連接磷酰 基(-H2P04)或者磺?；?-H2PS04)的羥基碳鏈，最優(yōu)選是碳原子數(shù)至少為3的烷基鏈。此外， 所述間隔物，包含非堿基形狀的核苷酸，此類非堿基核苷酸形狀的間隔物，一般來說作為完 全沒有堿基的形狀的單一核苷酸類似體，可以表示包含dSpacehrSpacer的概括地無法與 以RNA為代表的所有其他生物體堿基相結合的形狀的所有變形。
[0058] 在上面，雙鏈中成為對象的單鏈，可具有與引起RNA干擾現(xiàn)象的AGO(argonaute)蛋 白質(zhì)結合的能力。
[0059] 在上面，RNA干擾誘導核苷酸，可以是從5'端第六個核苷酸被間隔物取代，從3'端 第1個和第2個核苷酸被間隔物取代的變形一起被應用的。
[0060] 此外，本發(fā)明可以提供含有所述RNA干擾誘導核苷酸的基因表達抑制用化合物和/ 或試劑盒。
[0061] 在本發(fā)明中，所述"化合物"，可以指在抑制目標基因的表達的同時，還可以起到減 少脫靶效果的作用的用途的化合物。
[0062] 所述"試劑盒"，具有包括用于抑制目標基因的表達的含有RNA干擾誘導核苷酸或 盛放著含有所述RNA干擾誘導核酸的化合物的容器的結構，所述容器可以采取瓶、桶、香囊、 信封、管、安瓶(ampoule)等類似形狀，其可部分或全部由塑料、玻璃、紙、箱、蠟等來形成。容 器最初可以裝備有一個完全或部分可拆卸的蓋子，其可以是容器的一部分或者可以通過機 械、粘合或其他方式被固定到容器上，或者還可以安裝有可通過注射器針頭來存取內(nèi)容物 的止動件。所述試劑盒可包括外部包，外部包可包含構成元件的使用說明書。
[0063]在此之上，確認到，根據(jù)本發(fā)明的RNA干擾誘導核酸可以從本發(fā)明的一個實施例有 效抑制目標基因的表達，因此，可提供一種抑制細胞內(nèi)目標基因的表達的方法，其包含將所 述RNA干擾誘導核酸導入細胞內(nèi)部的步驟，并提供一種抑制細胞內(nèi)目標基因的表達的方法， 其包含使所述RNA干擾誘導核酸在細胞內(nèi)表達的步驟。
[0064] 在本發(fā)明中，所述目標基因可以是內(nèi)源性（endogeneous)基因或轉(zhuǎn)基因 (transgene)，但不限于此。
[0065] 更進一步，通過實施例我們確認到，根據(jù)本發(fā)明的RNA干擾誘導核酸，可以有效抑 制目標基因的表達，并且同時阻止脫靶效應，因此，本發(fā)明作為用于抑制由所述RNA干擾誘 導核酸的介導鏈(guide strand)或過客鏈(passenger strand)造成的脫革E效應的方法，可 提供包括將RNA干擾誘導核酸導入細胞內(nèi)的步驟的方法。此外，本發(fā)明作為用于抑制由所述 RNA干擾誘導核酸的介導鏈(guide strand)或過客鏈(passenger strand)造成的脫革E效應 的方法，可提供包括使RNA干擾誘導核酸在細胞內(nèi)表達的步驟的方法。
[0066]本發(fā)明的術語"脫革E效應(Off-target effect)"，是為了獲得siRNA誘導與介導鏈 具有相輔序列的mRNA的分解從而抑制相關mRNA的基因表達的效果而使用的，不僅如此，還 包括因 s iRNA的過客鏈造成的其他mRNA的分解發(fā)生時因過客鏈造成的這種沒有預料到的其 他mRNA的分解乃至相關基因的表達抑制效果，及SiRNA的介導鏈與錯誤的目標配對，使得其 他mRNA的分解發(fā)生的介導鏈造成其他mRNA分解以及相關基因的表達抑制效果。
[0067]下面將展示一些優(yōu)選實施例來幫助本發(fā)明的理解。但是，下面的實施例不過是為 了幫助容易理解本發(fā)明而提供，本發(fā)明的內(nèi)容并不限于下面的實施例。
[0068]【實施例1】
[0069]用脫氧核糖核苷酸間隔物(dSpacer)取代的SiRNA分子的目標基因表達抑制效果 及脫靶效應對比
[0070] 如圖1圖表所示實施例，本發(fā)明人推測，將無法堿基配對的間隔物變形應用于與 AGO蛋白質(zhì)結合的所有RNA干擾誘導核酸的5'種子區(qū)域，可完全阻止脫靶效應，同時提高目 標基因的抑制作用（中靶效果），本發(fā)明人基于微RNA識別機制的模型，即過渡核模型（Nat Struct Mol Biol.2012Feb 12; 19(3) :321-7)，側重于5'種子區(qū)域，尤其是被稱之為"樞軸 (pivot)"的從5'末端起的第6個核苷酸位置的堿基配對，從而發(fā)明了本RNA干擾誘導核酸。
[0071] 首先，為將根據(jù)本發(fā)明的變形后的SiRNA分子和以往的未施加變形的SiRNA分子所 媒介的中祀與脫祀效果進行對比，進行了下列實驗。首先，合成包含介導鏈(guide strand) RNA上的種子區(qū)域(seed region)的5'末端區(qū)域（1號至11號）上被無法進行堿基配對的脫氧 核糖核苷酸間隔物(dSpacer)取代(pi)的RNA，合成為過客鏈(passenger strand)未施加任 何變形，以往的結構，即與19個完美反向互補(perfect reverse complement)-起，3'末端 上具有兩個dT(Deoxy Thymine Nucleotide)的突起的雙鏈被產(chǎn)生制造出。此類RNA分子由 ST Pharma，Tri I ink Techno Iogies或Bioneer公司化學合成，通過HPLC分離，然后根據(jù)這些 公司提供的方法，作為在介導鏈和過客鏈的雙體(duplex )，被制作成如圖1的左邊面板一樣 (在5'末端起第6個上被非堿基核苷酸取代的例子，6pi)。同時，作為對照群(NT;非靶向），只 在漂亮小線蟲(c.elegans)中表達的微RNA(miRNA)，即cel-miR-67的序列，使用以siRNA的 形狀合成的。
[0072] 上述變形，被應用于設計的SiRNA(SiRL)，目的在于抑制海腎熒光素酶(海腎熒光 素酶產(chǎn)生于Promega公司psi_check2矢量中）。具體來說，75nM siRNAs的產(chǎn)生是由于上述的 雙鏈體按照生產(chǎn)商的方案采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染劑（Invitrogen)共轉(zhuǎn)染HeLa細胞(ATCC CCL-2)同時帶有p Si-check2載體，該載體就是表達海腎熒光素酶的，然后檢測效果。在測量 siRL介導的祀向效應時，psi_check2載體被完整使用，而測量脫革E效應時，psi_check2載體 中的海腎熒光素酶基因被不能對靶向效應起反應的pRL-TK(pr〇mega)的海腎熒光素酶所取 代，之后構建RL-Seed和RL-Nuc，該載體包含與SiRL(種子位點；種子)種子區(qū)域(5 '末端起1-8位)完美互補的2組序列，以及成核凸起位點，其可通過在位點5和6之間形成凸起與miRNA 結合，化合為DNA并重復植入3 'UTR( 3 'untranslated region)。如此，HeLa細胞在DMEM培養(yǎng) 基（Invitrogen)中被培育了出來，補充以10%FBS(胎牛血清），100U/ml盤尼西林，以及100μ g/ml鏈霉素，而沒有抗生素在完全培養(yǎng)基中會發(fā)生轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染24小時后，通過使用 Promega公司的雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，按照生產(chǎn)商的方案對熒光素酶活性進行測 量，可檢測出siRNA的效果。這里的海腎熒光素酶的活性預測至少是副本的三倍，采用 Promega公司的Glomax發(fā)光檢測儀進行測量，然后按照螢火蟲(firefly)焚光素酶活性進行 標準化。
[0073]結果，如圖2a所示，在5'末端區(qū)域起的第1與11位點之間擁有一個dSpacer替代物 的siRNA表現(xiàn)出小于或等于60%的活性(相對于螢火蟲熒光素酶標計的標準化數(shù)值而言）， 此時靶向效應測量為75nM。尤其是，雖然位點2，4，5或6的替代降至小于或等于活性的30 %， 其表現(xiàn)不如未變形過的，但是其效果仍然非常顯著。但是，當使用螢光素酶報告基因，插入 之前已知位點，例如種子位點(RL-種子)或成核凸起位點，以便估算微RNA類似脫靶效應，該 脫靶抑制作用僅在位點2和7之間的dSpacer替代的情況下被消除，如圖2b所示。
[0074]如上所述，5 '末端起2-7位點之間的dSpacer替代被證明可消除微RNA類似脫靶效 應，同時顯示靶向活性，此時非堿基脫氧核苷酸是一個不能作堿基配對的變形物。
[0075]此外，為了進一步調(diào)查siRNA中2-7位點之間的dSpacer替代所顯示出來的優(yōu)秀的 上靶效果，靶向抑制活性在各濃度中進行估算以便測量IC50 (抑菌濃度50 )，從而確認位點5 或6上的替代是最有效的，如圖2c和2d所示，此時位點6上的替代在所有消除脫靶效應的變 形中表現(xiàn)出了最佳的最大抑菌率(Imax) 〇
[0076]上述結果非常符合過渡成核模型，這是一種新的miRNA目標識別模式，如圖2e和2f 所示，此結果也符合前面5 '末端6位上的堿基配對研究報告，尤其是被稱為"支點"的，對識 別miRNA目標(Nat Struct Mol Biol.2012Feb 12; 19(3) :321-7)至關重要。
[0077] 此外，如圖2g所示，在5'末端起3至6位上擁有單一非堿基脫氧核苷酸替代的介導 鏈，使得由對面的過客鏈介導的微RNA類似脫靶效應降低，通過在過客鏈上的相同的變形實 現(xiàn)完全的防止，替代了 5'末端區(qū)域起的2-7位上的一個核苷酸。
[0078] 基于上述描述，我們可知siRNA分子的介導鏈應被適當?shù)厥褂茫ㄟ^替代5'末端區(qū) 域起的2-7位為在堿基配對方面擁有缺陷的脫氧核苷酸間隔物(dSpacer)，考慮到對目標基 因抑制的作用和避免脫靶效應，這里最合適的使用方法是替代位點6為dSpa Cer(6pi)。
[0079] 【實施例2】
[0080]目標基因抑制和由siRNA分子核糖核苷酸間隔物(rSpacer)替代所導致的脫靶效 應的對比
[0081]要看上面例1中的結果是否能被相似的含有核糖核苷酸骨架的間隔物所復制， siRL的2-7位上的核苷酸被替代為核糖核酸間隔物(rSpacer)(pi-r)，該位置之前表明可消 除脫靶效應，這里SiRL的靶向活性按照例1中的相同方法通過計算IC50來進行檢測。
[0082] 結果，如圖3a和3c所示，每個5 '末端起2-7位上的rSpacer替代都顯示大于或等于 54%的最大抑菌率(Imax)，相對于未變形(WT)而言。其中，除了2pi-r(應用于位點2)之外的 每個變形物的靶向抑制活性都比6pi小。特別是2pi-r顯示出了比6pi優(yōu)秀的靶向抑制作用， 但仍然如圖3d所示抑制脫靶，此處按照例1中的方法用RL-seed測量脫靶效應進行了確認。 此外，當每個變形物的脫靶效應都測量為75nM siRNA時，可以確定除了2pi-r和7pir外每個 變形物都可阻隔脫靶效應。
[0083]基于上面所述，我們發(fā)現(xiàn)siRNA分子的介導鏈應通過替換5'末端起位點3或6為核 糖核苷酸間隔物(rSpacer)被適當使用，考慮到對目標基因抑制的作用和避免脫靶效應，最 合適的使用方法是如例1所示替換位點6為dSpacer (6p i)。
[0084]【實施例3】
[0085]目標基因抑制和由siRNA分子脫氧核苷酸間隔物(dSpacer)植入所引起的脫靶效 應的對比
[0086]在種子區(qū)域序列配置包含脫氧核苷酸間隔物(dSpacer)，當與目標基因 RNA互相作 用時，不一致配對應發(fā)生在siRNA中的一個非堿基部分里，該非堿基通過例1和例2中的替代 制成。所以，當一個dSpacer被植入siRNA的種子區(qū)域時，該非堿基可形成一個凸起，如圖4a 所示。因此，針對此類dSpacer植入的情況，調(diào)查靶向和脫靶效應中的變化。最初，通過按照 例1中的方法測量IC50可檢測SiRL的靶向效應，該SiRL包含5'末端起2-7位點之間的 dSpacer植入，這里的位點2至7在上述實施例中被報告可消除脫革巴。
[0087]因此，如圖4b所示，從5 '末端起位點2-7之間的每次dSpacer植入都顯示至少為最 大抑菌率的19%，相對于未變形的(WT)而言。此外，如圖4c和4(1所示，除了2pi-I和3pi-I外， 所有一切都顯示出不如6pi那么有效力的靶向活性。異常的是，2pi-I和3pi-I顯示出了比 6pi更好的靶向活性，但是它們?nèi)匀灰种泼摪行@可由使用例1中的RL-seed對脫靶效應 進行測量所得的結果得到證實。此外，如圖4f所示，所有的變形物(4pi-I，5pi-I，6pi-I)，除 了 2pi-I，3pi-I和7pi-I之外，都消除脫靶效應，通過測量各變形物的脫靶效應觀察到siRNA 濃度為75nM。
[0088] 基于上面所述，我們發(fā)現(xiàn)siRNA分子的介導鏈應通過植入脫氧核苷酸間隔物 (dSpacer)于5'末端起位點4或6為被適當使用，考慮到對目標基因抑制的作用和避免脫靶 效應，最合適的使用方法是如例1所示替換位點6為dSpacer (6pi)。
[0089] 【實施例4】
[0090] 目標基因抑制和由SiRNA分子核糖核苷酸間隔物(rSpacer)植入所引起的脫靶效 應的對比
[0091] 為研究核糖核苷酸間隔物(rSpacer)植入種子區(qū)域(pi-rl)對脫革E效應的作用，采 用例3中的方法對IC50進行測量。
[0092]結果，如圖5a和5c所示，種子區(qū)域每個變形物都顯示出了優(yōu)秀的靶向活性，大于最 大抑菌率的20%。特別是2pi-rl和3pi-rl顯示出的有效靶向活性要優(yōu)于6pi，但是它們?nèi)钥?如圖5d所報告的那樣抑制脫靶，這里可用與例1相同的方法對脫靶進行測量。此外，每個變 形物(4pi-rl，5pi-rl和6pi-rl)，除2pi-rl，3pi-rl和7pi-rl之外，都被觀測到如圖5e所示 那樣可消除脫靶效應，各變形物siRNA濃度為75nM此脫靶效可估算。
[0093]基于上面所述，我們發(fā)現(xiàn)siRNA分子的介導鏈應通過植入核糖核苷酸間隔物 (rSpacer)于5'末端起位點4或6為被適當使用，考慮到對目標基因抑制的作用和避免脫靶 效應，最合適的使用方法是替換位點6為(13口3〇61'(6口;〇。
[0094] 【實施例5】
[0095] 由含有替代變形5'末端起第6核苷酸為脫氧核苷酸間隔物(dSpacer)的微RNA分子 導致的目標基因調(diào)整功能的損失與2'0Me變形的對比
[0096]如例1所證，本發(fā)明帶有非堿基替代物的SiRNA分子可消除由常規(guī)的SiRNA結構所 導致的微RNA類似脫靶效應，因此為進一步通過應用于微RNA使變形生效，miR-124被變形為 在5'末端起位點6上含有脫氧核苷酸替代物，之后通過下列實驗進行檢測。最初，合成了與 人類miR-124-3p相同的序列和含有6pi的序列，位點6的dSpacer替換物，之后轉(zhuǎn)染帶psi-check2載體的HeLa細胞，其含有2個miR-124種子位點（5 '末端區(qū)域起1-8位點的完美補償序 列）。之后使用例1中的方法測量各RNA濃度下的熒光素酶活性。
[0097]其結果，如圖6a所示，我們確定含有6pi的微RNA，本發(fā)明的變形物(miR-124-6pi)， 不能在之前它們被識別的地方抑制種子位點。除了種子位點之外，我們也確認6pi變形不能 影響成核凸起位置(Nuc)，該位置已知由微RNA識別。
[0098]此外，實施進行全組基因驗證以確認miR-124-6pi是否真的可避免各種基因的抑 制，這些基因通常受未變形的miR-124影響，該miR-124,miR-124-6pi，和對照被轉(zhuǎn)染miR-124 無法表達的HeLa 細胞 ，這里的同 RNA 通過使用RNAeasy kit (Qiagen) 試劑盒在轉(zhuǎn)染 24 小 時之后進行提取，從而進行RNA-Seq分析，一種基于序列分析的基因表達實驗（由 Otogenetics公司提供）。上述實驗的結果，生成FASTAQ文件并進一步使用TopHat ,Cuff link 和Cuffdiff程序進行連續(xù)地分析，通過采用原始HeLa細胞的結果將這些數(shù)值最終標準化為 Iog2比率。為了選出做分析，由Cuffdiff提供的統(tǒng)計分析該數(shù)值應被報告為非常重要。 [0099]因此如圖6b所示，我們觀察到對照顯示了基因表達在相同的程度上的上下調(diào)整， 但是miR-124增加了下調(diào)基因的重要部分，這里，在6pi變形的情況下，此類下調(diào)基因在數(shù)目 上被大大減少了。此外，如圖6c所示，熱圖表現(xiàn)明顯顯示大量miR-124相關下調(diào)基因不能被 mir-124-6pi抑制，由miR-124介導的抑制程度被分類為檢查miR-124和miR-124-6pi總基 因，最后如熱圖所不抑制。
[0100] 另外，要看6pi變形是否消除微RNA和目標mRNA之間的相互作用，上面觀察的潛在 原因，進行Ago HITS-CLIP分析miR-124轉(zhuǎn)染HeLa細胞，分析該Ago HITS-CLIP得出的序列來 生成一個mRNA所有位點結合的地圖，然后進一步與原始HeLa細胞表達對照進行對比，從而 精確辨別由miR-124在全組基因范圍上的表達所產(chǎn)生的Argonaute結合位點。此miR-124結 合位點被命名為de novo Ago-miR-124群，根據(jù)抑制程度對比分析其累計分數(shù)，關注于包含 目標miR-124種子位點的mRNA，抑制程度可由miR-124或miR-124-6pi表達HeLa細胞的mRNA 分析結果進行估算。
[0101] 其結果，如圖6d所示，由miR-124所聯(lián)結的目標mRNA相對于總mRNA表達(KS test,P 〈0.01)已經(jīng)明顯被抑制了，但是miR-124-6pi的情況統(tǒng)計并不顯著。在此基礎上，我們確認 miR-124-6pi在全組基因范圍上不能抑制miR-124常規(guī)的目標mRNA，在此，就miR-124-6pi而 言，miR-124的5'末端起位點6可被變形為被替換成非堿基單一脫氧核苷酸。
[0102] 2 ' OMe變形，由Dharmacom公司開發(fā)，已被廣泛使用于防止SiRNA脫靶。這是一個實 證方法，該方法將2'OMe變形應用于介導鏈的5'端起的第2位點以便防止相應的微RNA類似 脫靶效應。本發(fā)明人將本發(fā)明中的6pi變形應用于SiRNA以抑制海腎熒光素酶并且還應用了 2 ' OMe，在此，他們根據(jù)IC50對靶向效應的效率進行評估，IC50源于使用與例1相同的方法對 各種濃度的抑制作用進行測量。
[0103] 結果如圖6 e所示，6p i變形不僅顯示出了比2 ' OMe優(yōu)秀的抑制效率，還顯示了優(yōu)秀 的最大抑菌率。此外，全組基因脫靶效應由相同的RNA-seq方法和熱圖分析進行評估，確認 2 ' OMe變形不能像6pi-樣在siRNA消除脫祀抑制。
[0104] 此外，6pi或2'01^變形被應用于1^1?-124，其功能就是誘導神經(jīng)元分化，以便看看 是否微RNA類似定向的變形介導消除對抑制其生物功能足夠有效，帶這些變形物的miRNA轉(zhuǎn) 染N2a細胞(Neur〇-2a，ATCC CCL-131)，然后自轉(zhuǎn)染72小時后通過顯微鏡觀察它們是否可生 成末端神經(jīng)元結構。
[0105] 其結果，如圖6g所示，miR-124-2me仍擁有誘導末端神經(jīng)元結構的能力，但是miR-124-6pi則完全失去這種能力，這里的miR-124-2me是在應用2'0Me變形的情況下。
[0106] 因此，在上面所述的基礎上，對于抑制脫靶效應的作用來說，我們確定6pi變形體 現(xiàn)出了優(yōu)秀的避免結合和微RNA類似脫靶效應抑制作用，因此該6pi變形可完全阻止miRNA 中的生物功能，這里的6pi變形是替換5'端位點6為脫氧核苷酸間隔物(dSpacer)的，而傳統(tǒng) 的2 ' OMe變形的靶向效率不如6pi，這里的2 ' OMe變形僅能略微降低脫靶效應，體現(xiàn)了不能完 全阻止脫靶的局限性。
[0107] 【實施例6】
[0108] 為了減少血液中的膽固醇而開發(fā)的siRNA的脫靶效應及間隔物變形應用時的改善 效果比較
[0109] 以實驗用為目的，可以擴張到以治療用為目的，將根據(jù)本發(fā)明的變形應用至siRNA 序列并評判其效果，在Alnylam公司，為降低血液中膽固醇的數(shù)值，用RNA干涉現(xiàn)象妨礙肝細 胞的PCSK9基因而開發(fā)的siRNA，SPPCS-Al(Al)，PCS-A2(A2)(Proc Natl Acad Sci U S A. 2008Aug 19; 105(33): 11915-20)，以這種siRNA為對象完成了實驗。Al的情況，以和實施 例1同樣的方法，通過對熒光酶活性度的測定，比較了在多個位置上的非堿基變形的命中目 標效果的時候，如圖7a所不，Al_6pi有著最優(yōu)秀的目標基因抑制效率，如圖7b所不，種子序 列造成的脫靶效應也完全被抑制了。A2的情況，為改善擁有與Al相同的序列或引起免疫反 應的問題以及RNA的穩(wěn)定化，對多個位置施加了2 ' OMe變形，在這樣的A2siRNA分子中，用和 實施例1相同的方法測定的熒光酶素報告活性測定中，也如圖7c所示，顯示出6pi變形抑制 了脫靶。而且，如圖7所示，A2的情況，即使施加6pi變形，在使用熒光素酶報告的IC50測定 中，呈現(xiàn)出和未變形形狀的A2幾乎類似的水準的命中目標抑制效率。
[0110] 將關于PCSK9基因 SiRNA全部呈現(xiàn)微RNA類似脫靶的現(xiàn)象，以熒光素酶報告實驗進 行觀察后，為了確認實際上在肝細胞中也會出現(xiàn)這樣的脫靶效應，使用了人類肝癌細胞主 人HepG2(ATCC HB-8065)實施了追加實驗。首先，為了確認對于PCSK9基因，通過siRNA、A2能 否有效的減少PCSK9mRNA的量，對HepG2細胞將A2、A2-6pi siRNA分子使用Lipofectamine RNAiMAX( Invi trogen公司）試劑，根據(jù)相關協(xié)議轉(zhuǎn)染，24小時后將總RNA用RNeasy試劑盒 (Qiagen公司）提取，根據(jù)有關協(xié)議逆轉(zhuǎn)寫至Superscript III RT(Invitrogen)，用SYBR? Green PCR Master Mix(Applied Biosystems公司）執(zhí)行qPCR，測定PCSK9的mRNA，用GAF1DH mRNA值將其標準化。
[0111] 其結果，如圖7d右邊的圖表所示，確認到，A2，A2-6pi兩個都能有效抑制PCSK9的上 靶效果。
[0112]以后，從總RNA使用NSR RNA_Seq(Nat Methods.2009sep;6(9):647-9)方法制作 庫，用illumina公司的HiSeq2000序列分析機器分析上述庫，調(diào)查所有mRNA的表達之后，通 過和上述實施例2相同的方法，以熱度圖的方式，在基因體水平上進行了分析。
[0113]結果是，如圖7e所示，被A2抑制的脫靶基因的mRNA的量，因為6pi變形得到了恢復。 [0114]而且，將顯示出這這種差異的脫靶基因的功能，使用DAVID程序（Nature Protoc.2009;4(1) :44-57)進行G0(gene ontology)分析的結果表明，具有和細胞周期關聯(lián) 的功能的很多基因，因脫靶效應被致命性的抑制了。為了確定這種被發(fā)現(xiàn)的脫靶效應，向 HepG2轉(zhuǎn)染相關siRNA之后，去除放入了培養(yǎng)基24小時的10%血清(FBS)，在細胞周期被統(tǒng)一 之后，48小時之后用FACS裝備實施使用Propodium Iodide的細胞周期分析。
[0115]結果是，如圖7f所示，A2siRNA分子被表達的情況，跟預期的一致，細胞周期出現(xiàn)了 異常，尤其是觀察到G1/G2細胞周期停止的現(xiàn)象增加，還確認到，這種現(xiàn)象在導入6pi變形時 消失。
[0116] 如上所述，確認到，對于PCSK9，SiRNA因沒有預想到的脫靶效應出現(xiàn)了在肝細胞里 細胞周期停止的副作用，這種脫靶副作用，通過導入根據(jù)本發(fā)明的6pi變形，可以在對PCSK9 維持中靶抑制效率的同時阻止脫靶副作用的發(fā)生。
[0117]【實施例7】
[0118]通過從小鼠中的PCSK9siRNA的生體轉(zhuǎn)達進行的脫靶效應和間隔物變形應用時的 改善效果評價
[0119]為在生體內(nèi)確認在上述實施例6中分析的對PCSK9的siRNA的脫靶效果，使用出生7 周的實驗用小鼠（C57/BL6)，在肝組織轉(zhuǎn)達SiRNA后，執(zhí)行了評價。SiRNA的肝組織轉(zhuǎn)達，使用 一種叫做in vivo-jetPEI的轉(zhuǎn)達物質(zhì)，根據(jù)提供的協(xié)議，在5只小鼠的尾巴血管里各注入 (tail-vein injection)5mg/kg siRNA轉(zhuǎn)達，48小時后犧牲小鼠，提取其血液和肝組織進行 了實驗。首先，在摘除的一部分肝組織內(nèi)，使用miRNeasy試劑盒(Qiagen公司）分離出包含小 的RNA(smallRNAs)的總RNA，在這里，通過qPCR來測定各個被轉(zhuǎn)達的siRNA和目標即 PCSK9mRNA的量。關于siRNA的測定，根據(jù)協(xié)議(Biotechniques .20050ct;39(4) :519-25)使 用Poly(A)Tailing Kit(Ambion公司）來執(zhí)行，首先，在RNA的3'末端上連接多個腺苷，使用 包含特定序列的〇1 ig〇-dT向Superscript III RT(invitrogen公司）實施逆轉(zhuǎn)錄之后，將識 別oligo-dT上附著的特定sequence的序列，和與想要測定的siRNA具有相同序列的DNA引物 作為一對，用SYBR?Green PCR Master Mix(Applied Biosystems公司）實施了qPCR〇 PCSK9mRNA測定，使用與上述實施例6相同的方法實行。血液中膽固醇的總含量，使用Wako公 司的試劑盒，通過ELI SA方法根據(jù)提供協(xié)議進行了測定。
[0120] 結果是，如圖8a所示，以A2siRNA為代表，施加間隔物變形的A2-6pi也在肝組織內(nèi) 被轉(zhuǎn)達，而且PCSK9mRNA也得到了抑制，因此血液中的膽固醇總含量表達出得到降低的效 果。
[0121] 而且，各SiRNAden轉(zhuǎn)達，使用從被確認的肝組織中獲取的總RNA，使用和上述實施 例5相同的方法執(zhí)行了RNA-Seq分析。
[0122] 此外，以熱度圖表示和分析的結果，如圖8b所示，確認到，使用6pi變形時的脫靶在 遺傳體上減少。
[0123] 不僅如此，通過GO分析，對通過A2siRNA脫靶被抑制的基因主要具有何種機能進行 了分析，發(fā)現(xiàn)這種基因是在肝細胞中對銅離子代謝起作用的基因，因此，使用叫做NCTC clonel469(韓國細胞株銀行）的小鼠肝細胞，來確認預期的銅離子代謝異?，F(xiàn)象。也就是 說，在NCTC clonel469上，使用lipofectamine2000,轉(zhuǎn)染對照群、A2、A2-6pi siRNA分子，72 小時后，使用Quanti Chrom Copper Assay Kit(bio systems)測定銅電離子的量，結果是， 確認到，如圖8c所示，在A2中細胞內(nèi)的銅電離子增加了，A2-6Pi沒有增加。眾所周知，肝細胞 里的銅離子的增加會導致細胞死亡，相同地，將對照群、A2、A2-6pi向NCTC clone 1469表達 后，72小時后，使用Annexin V:FITC Apoptosis Detection Kit II(BD Pharmingen公司）， 根據(jù)提供的協(xié)議使用PI和annexin V染色后，使用FACS測定細胞死亡的結果，如圖8d所示， 觀察到，A2的情況，與處理32nM CuS04的結果類似導致了細胞死亡，但是A2-6pi的情況，導 致細胞死亡的現(xiàn)象消失。
[0124] 通過上述結果，我們可以知道，關于PCSK9，在s iRNA注入小鼠生體內(nèi)被轉(zhuǎn)達至肝細 胞時，由于沒有預想到的脫靶效應，出現(xiàn)了銅代謝基因被抑制的現(xiàn)象，因此，因為肝細胞內(nèi) 的銅增加，出現(xiàn)了沒有預想到的導致細胞死亡的副作用。但是，即使在生體內(nèi)，通過導入根 據(jù)本發(fā)明的6pi變形，這種脫靶副作用，可以在維持對PCSK9的上靶抑制效果的同時還可以 有效阻止脫靶副作用。
[0125] 【實施例8】
[0126] 脫氧核糖核苷酸用隔物取代的取代體和現(xiàn)有的脫靶效應抑制用變形取代體的目 標基因表達抑制效果及脫靶效果比較
[0127] 用與上述實施例1相同的方法，對上述實施例1中確認到了具有目標基因表達抑制 效果和阻止脫靶效應的效果的、根據(jù)本發(fā)明的用脫氧核糖核苷酸間隔物把5'末端起第6個 核苷酸取代的取代體，和以往的用于抑制脫靶效應的變形取代體的性能，測定IC50進行了 比較。
[0128] 首先，作為用于減少以往脫靶效應的取代體，運用在5'末端起第2個到第8個位置 上導入不一致堿基配對(mismatch)的方法，向miR-124的5'末端起第6個上導入不一致堿基 配對(mismatch)后測定了 IC50。結果是，如圖9a所不，miR-124-6mm的情況，對于完美的匹配 目標(perfect match target)，其顯示出了與沒有施加變形的miR-124同樣優(yōu)秀的抑制效 果（兩個都是IC50 = 0.02nM)，但是如圖9b所示，對于miR-124的種子結合目標（seed target，5 '末端起第2個到第8個），其顯示為不能抑制。
[0129] 但是，沒有配對的導入，有可能根據(jù)變化的核苷酸堿基，將新的序列識別為種子結 合目標，因此對新的不一樣的種子配對序列有可能會出現(xiàn)脫靶效應。因此，在miR-124的5 '末端起第6個上導入沒有配對之后，對有可能被識別為新的5 '末端起第2個到第8個連續(xù)堿 基對配對的種子結合目標，測定IC50對其抑制效果進行了調(diào)查。其結果，如圖9c所示，有可 能被識別為新的5 '末端起第2個到第8個連續(xù)堿基對配對的種子結合目標，與沒有施加變形 的m i R-124觀察到了同樣的抑制。
[0130] 而且，如圖9c所示，IC50的測定結果發(fā)現(xiàn)，將以往的2'0Me變形施加在miR-124的5 '末端起第6個位置上時，依然與沒有施加變形的miR-124-樣，siRNA的情況，被觀察到，抑 制作用為脫靶的種子結合目標。
[0131] 通過上述結果，當將以往的不匹配變形施加到5'末端起第6個上時，以往的種子結 合目標的相關脫靶效果雖被阻止，但是對于因不匹配導入而新出現(xiàn)的種子結合目標，仍然 出現(xiàn)脫靶效應，這就是其局限。而且，可以知道，以往的2'OMe變形的情況，被施加至5'末端 起第6個上時，完全不能減少脫靶效應。
[0132] 接下來，為了比較在除5'末端起第6個以外的位置上，將以往的阻止微RNA類似脫 靶效應有效的變形的效果，與本發(fā)明相比較，對miR-124應用5'末端起第2個2'OMe變形 (2me)和5'末端起第7個UNA(7UNA)變形，使用與上述實施例1相同的方法，測定IC50進行比 較調(diào)查。結果是，如圖9e所示，與2me(IC50 = 0.9nM和7UNA(IC50 = 7.2nM)都沒有施加變形的 miR-124相比，雖然（IC50 = 0.7nM)脫靶效應多少有些減少，但是，在5'末端第6個上用非堿 基脫氧核糖核酸取代的根據(jù)本發(fā)明的變形(6pi)，觀察到了完全去除脫靶效應的現(xiàn)象。
[0133] 而且，如圖9f所示，可以知道，向抑制中靶PCSK9基因的s iRNA即A2序列上施加7UNA 時，脫靶效應多少有些減少，但是不能完全消失。而且，為阻止脫靶效應，在A2上運用在 siRNA雙鏈結構中施加介導鏈的5'末端起第2個單一核苷酸形成凸起的變形的以往的方法， 觀察其結果，同樣的，雖然脫靶效應多少被減少，但是不能完全被阻止。
[0134] 綜上所述，可以知道，現(xiàn)有的抑制脫靶效應用途的變形方法，雖然多少可以減少脫 靶效應，但是不能被完全消除，但是本發(fā)明可以完全阻止脫靶效應。
[0135] 【實施例9】
[0136] 將從5'末端起第6個取代為以沒有堿基的形狀，第5個和第7個核苷酸被取代為C3 共價結合的siRNA分子的目標基因表達抑制效果和脫靶效應比較
[0137]像上述實施例8觀察的那樣，用dSpacer取代從5 '末端起第6個核苷酸的（6pi ) siRNA，徹底地去除了脫靶效應，從這一點上可以推測，其是因為第6個堿基消失因此通過這 一部分脫靶效應和堿基配對無法再發(fā)生。所以從理論上講，從5 '末端起第6個核苷酸上不存 在堿基的話，其骨架即使不是核苷酸的任何變形，只要其變形是可與單一核苷酸取代的相 同大小的間隔物變形，就可以呈現(xiàn)出相同的脫靶去除效果。以此，發(fā)明人根據(jù)圖10里出現(xiàn)的 被公式化的例子，從圖1的5'末端起第6個位置dSpacer取代擴張，設計為，作為以5'末端起 第6個位置上沒有堿基的形狀維持骨骼的最小間隔物(spacer)，第5個和第7個核苷酸共價 結合。也就是說，設計為，作為在第6個位置上維持核苷酸占據(jù)空間的間隔物的最小大小，達 到磷?；吞荚訛?個(spacer)的變形。將沒有核苷酸的C3變形為最小基準，無論哪種沒 有堿基的共價結合變形，在5 '末端起第6個位置上被運用的話，像非堿基核苷酸取代一樣， 可以預想，在維持中靶抑制效率的同時，脫靶效應將完全地清除，新的RNA干擾誘導核酸被 發(fā)明出來。
[0138] 首先，如圖Ila所示，以沒有堿基的形狀共價結合的變形中，選擇最小形狀的C3間 隔物，如圖Ilb所示，將其應用于miR-124的5'末端起第6個位置上，在(miR-124-6c3)第5個 和第7個核苷酸共價結合變形后，為了 了解中靶和脫靶效果，用和上述實施例8同樣的方法 測定IC50并且做了比較調(diào)查。
[0139] 結果是，如圖 IlC 所示，觀察到，miR-124-6c3(IC50 = 0.15nM)和 miR-124 的從5'末 端起第6個用dSpacer取代的miR-124-pi(IC50 = 0.15nM)相比更優(yōu)秀，和沒有變形的miR-124(IC50 = 0.15nM)一樣，相當于siRNA的中革E，有效的降低了完美匹配(perfect match)的 目標。
[0140] 而且，如圖IId所示，觀察到，對于出現(xiàn)siRNA的脫靶效應的種子結合目標，將C3在 miR-124的從5'末端起第6個上應用的時候，基因抑制效果完全地消失了。
[0141 ] 此外，將對從5 '末端起第6個C3間隔物變形，應用到PCSK9基因抑制用siRNA的A2， MAPK12基因抑制用siRNA的siMAPK14-l(Jackson，A.L.，et al.，Rna,12(7) :1179)和siRL 時，如圖lie和圖Ilj所示，通過對IC50的測定，可以確認到所有優(yōu)秀的中靶抑制效果，而且 完全阻止了脫靶效應。
[0142] 從上面可以看到，可以知道，從siRNA的5'末端的第5個和第7個核苷酸，以在第6個 位置上以沒有堿基的形狀發(fā)生共價結合的變形，在C3間隔物的情況來看，其骨架即使不是 核苷酸的任何變形，只要其變形是可與單一核苷酸取代的相同大小的共價結合變形，就可 以呈現(xiàn)出比6pi優(yōu)秀或相同的上靶抑制效率，并且脫靶抑制效果可完全地被阻止。
[0143] 【實施例10】
[0144] 從3'末端起第1個和第2個核苷酸被取代成間隔物的siRNA分子的基因表達抑制效 果和微RNA類似脫靶中3'末端補償結合的相關效果及瞄中目標基因表達抑制效果的評價
[0145] siRNA使用時出現(xiàn)的脫靶效果，像微RNA-樣，主要通過種子位置的堿基配對識別 目標基因，而且依附于其序列和堿基配對結合出現(xiàn)。微RNA在生命體上識別目標的情況，通 過這種種子結合的目標基因抑制現(xiàn)象，種子部分和目標的結合較弱時，通過在3 '末端部分 形成的附加堿基配對的3'末端補償配對（3'-compensatory pairing)，報告表明出現(xiàn)了目 標基因降低的現(xiàn)象(Cell. 2009; 136:215-233)。因此，微RNA類似脫靶現(xiàn)象，也會作為這種3 '末端補償結合機制呈現(xiàn)一部分，因此需要可以阻止這些現(xiàn)象發(fā)生的方法。
[0146] 現(xiàn)有的siRNA，在3'末端起第1個和第2個上一般帶有脫氧核糖核苷酸硫銨(dT)，其 主要在s iRNA雙重聚合物中以凸出（overhang)的結構出現(xiàn)。dT的情況，因為RNA的腺苷酸(A) 和堿基配對是可以的，所以其參與3'末端補償結合并可以呈現(xiàn)出微RNA類似脫靶效應效果。 因此，為了阻止這種3'末端補償結合造成的脫靶效應，如圖12a所示，對在3'末端起第1個和 第2個核苷酸應用無法進行堿基配對的間隔物取代變形。即，發(fā)明人注意到，當將3 '末端的 第1個和第2個核苷酸用沒有堿基的間隔物形狀應用dSpacer或者C3間隔物變形時，維持現(xiàn) 有的siRNA雙重結構，因此其中靶抑制效率很高，同時3 '末端補償結合造成的脫靶效應可以 清除，從而發(fā)明了本RNA干擾誘導核酸。
[0147] 為此，miR-124的3'末端起第1個和第2個核苷酸被取代成沒有堿基的間隔物變形 形狀之后，和上述實施例8用同一方法測定IC50,對中靶效果和3'末端補償結合，造成的脫 靶效應進行了調(diào)查。結果是，如圖12b和圖12c所示，沒有變形的miR-124的3 '末端補償結合 造成的目標降低的siRNA脫靶效應雖然被觀察到了，但是3'末端的第1個和第2個核苷酸被 取代為dSpacer或者C3間隔物的情況下，可以觀察到這樣的脫靶效應完全消失了。
[0148] 如上所述，siRNA雙重聚合體結構的miR-124的3'末端起第1個和第2個核苷酸被取 代成沒有堿基的間隔物變形形狀dSpacer(pi)或者C3spacer的情況（IC50 = 0.15nM)，如圖 12d和12e所示，即使對siRNA中靶對應的完全匹配結合目標，也呈現(xiàn)出了與沒有變形的miR-124(IC50 = 0.15nM)相同的中靶抑制效果。此外，將3'末端起第1個和第2個，以間隔物形狀 的pi或C3應用至siRNA即siMAPKH-l和SiRL時，如圖12f和12h所示，觀察到了和沒有發(fā)生變 形的s iRNA同樣的抑制中靶效果。
[0149] 通過上述結果，3'末端起第1個和第2個核苷酸被沒有堿基的共價結合形狀的變形 間隔物取代的RNA干擾誘導核酸，可以呈現(xiàn)出，在維持抑制目標基因的表達效果的同時，呈 現(xiàn)出由3 '末端補償結合來避開脫靶效應的效果。
[0150]上述本發(fā)明的說明只不過是為了舉例，本發(fā)明所屬技術領域的一般技術人員應該 理解，在不改變本發(fā)明的技術思想或必須特征的前提下，其可以容易地被變形成為其他具 體形狀，因此，應當理解，上面陳述的實施例，在所有方面都是示例性的，并不是用來限定 的。
【主權項】
1. 一種RNA干擾誘導核酸，其特征在于，在RNA干擾誘導核酸的雙鏈的至少一個單鏈中， 包括至少一個從5'末端起第六個核苷酸或從3'末端起第一個和第二個核苷酸被取代為間 隔物的變形。2. 如權利要求1所述的RNA干擾誘導核酸，其特征在于，所述雙鏈中，成為變形對象的單 鏈，具有可與引起RNA干擾現(xiàn)象的AGO蛋白結合的能力。3. 如權利要求1所述的RNA干擾誘導核酸，其特征在于，所述間隔物，是包括磷酰基或磺 ?；牧u基碳鏈。4. 如權利要求1所述的RNA干擾誘導核酸，其特征在于，所述間隔物，是從由脫氧核糖核 苷酸、核糖核苷酸和碳原子數(shù)為3的烷基鏈組成的組中選擇出來的骨架，無法形成堿基對。5. 如權利要求1所述的RNA干擾誘導核酸，其特征在于，所述RNA干擾誘導核酸，進一步 包括:通過由取代引起的與目標基因的RNA的不匹配堿基配對或通過由插入引起的凸起生 成。6. 如權利要求1所述的RNA干擾誘導核酸，其特征在于，所述核酸，從由siRNA、miRNA、 shRNA、DsiRNA、1811?熟、88-811?熟、口11?熟、611(1〇-811?熟和&811?熟組成的組中選擇。7. 如權利要求1所述的RNA干擾誘導核酸，其特征在于，所述RNA干擾誘導核酸，抑制目 標基因的表達。8. -種用于抑制基因的表達的化合物，其含有權利要求1所述的RNA干擾誘導核酸。9. 一種用于抑制基因的表達的試劑盒，其含有權利要求1所述的RNA干擾誘導核酸。10. -種用于抑制細胞內(nèi)目標基因的表達的方法，其包括將權利要求1所述的RNA干擾 誘導核酸導入細胞內(nèi)的步驟。11. 一種用于抑制細胞內(nèi)目標基因的表達的方法，其包括使權利要求1所述的RNA干擾 誘導核酸在細胞內(nèi)表達的步驟。12. -種用于抑制RNA干擾誘導核酸的介導鏈引起的脫靶效應的方法，其包括將權利要 求1所述的RNA干擾誘導核酸導入細胞內(nèi)的步驟。13. -種用于抑制RNA干擾誘導核酸的過客鏈引起的脫靶效應的方法，其包括將權利要 求1所述的RNA干擾誘導核酸導入細胞內(nèi)的步驟。14. 一種用于抑制RNA干擾誘導核酸的介導鏈引起的脫靶效應的方法，其包括使權利要 求1所述的RNA干擾誘導核酸在細胞內(nèi)表達的步驟。15. -種用于抑制RNA干擾誘導核酸的過客鏈引起的脫靶效應的方法，其包括使權利要 求1所述的RNA干擾誘導核酸在細胞內(nèi)表達的步驟。
【文檔編號】C12N15/113GK105829535SQ201480068785
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2014年12月8日
【發(fā)明人】池晟旭, 張恩淑
【申請人】英科德甘公司