一種基于氨基酸的聚兩性離子納米顆粒的制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種基于氨基酸的聚兩性離子納米顆粒的制備方法，采取兩步法合成中間段疏水、兩端鏈段含聚兩性離子的三嵌段共聚物，首先將N,N?雙丙烯?；装放c脂肪族伯胺溶解在去離子水與乙醇的混合溶劑中，通過(guò)親核加成得到交替共聚物，然后在上述共聚物中添加N,N?雙丙烯?；装放c賴(lài)氨酸的混合物溶液，繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)，得到含N,N?雙丙烯?；装?、脂肪族伯胺和賴(lài)氨酸的三嵌段共聚物，三嵌段共聚物在水溶液中自組裝形成納米顆粒，具有pH和還原敏感性，以及優(yōu)異的抗蛋白質(zhì)非特異吸附性能，納米顆粒無(wú)細(xì)胞毒性，作為抗癌藥物載體具有應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種基于氨基酸的聚兩性離子納米顆粒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于賴(lài)氨酸的聚兩性離子納米 顆粒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，納米技術(shù)在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用特別是納米藥物的發(fā)展推動(dòng)了各種各樣的納米 藥物傳輸體系的發(fā)展，尤其是以脂質(zhì)體和聚合物為基礎(chǔ)的納米顆粒。然而納米顆粒在藥物 傳輸體系上的應(yīng)用正面臨著兩種瓶頸，首先，納米顆粒在腫瘤組織的累積較差，其原因是納 米顆粒易被內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)(RES)所清除且缺少腫瘤靶向的能力，這不可避免的導(dǎo)致不良的 副作用。另一重要的問(wèn)題就是以納米顆粒為基礎(chǔ)的藥物傳輸體系的生物利用度。高的利用 度是指一旦納米顆粒被附著于固體腫瘤上，包裹藥物的納米顆粒就會(huì)以一定的速率釋放藥 物;然而，低的藥物利用度會(huì)導(dǎo)致藥物利用率下降并且也會(huì)增加多藥耐藥性發(fā)生的可能性。
[0003] 智能藥物傳輸體系越來(lái)越引起人類(lèi)的關(guān)注，它們用智能響應(yīng)性原理來(lái)實(shí)現(xiàn)藥物的 傳輸和靶向釋放，同時(shí)最大化提高了藥物利用度，最小化了一些副反應(yīng)。典型的刺激敏感性 藥物傳輸體系可大致分為兩類(lèi)，一類(lèi)是來(lái)自外界的刺激，另一類(lèi)是生物體本身的刺激。最具 代表性的生物體內(nèi)的刺激有pH的變化，氧化還原的變化，離子強(qiáng)度和酶的作用。所有的這些 刺激中pH和還原敏感性備受世人的青睞，一方面，在生物體內(nèi)不同部位pH具有明顯的變化， 如血液pH 7.4，早期內(nèi)涵體pH為6.0~6.5，晚期內(nèi)涵體pH為5.0~6.0，腫瘤細(xì)胞外pH為6.5-7.2，正常組織細(xì)胞外pH為7.4;因此，智能藥物載體一旦被被捕獲，將經(jīng)歷pH從7.4到5.0甚 至4.5的下降。通過(guò)利用pH的不同，藥物會(huì)盡可能的釋放到靶向位點(diǎn)。另外，智能藥物載體利 用pH的改變，來(lái)改變自身的表面的電荷，這樣更有利于載體的利用度。因?yàn)榧?xì)胞膜帶負(fù)電， 如果載體在此時(shí)帶上正電有利于腫瘤細(xì)胞的攝取，而在血液中載體帶有負(fù)電有利于載體在 血液中停留，且不易被RES清除。因而制備表面電荷可轉(zhuǎn)化的智能藥物載體將顯得尤為重 要。另一方面，還原型谷胱甘肽在生物體內(nèi)不同部位也有明顯的變化，在細(xì)胞內(nèi)的濃度為2-10mM，明顯高于細(xì)胞外的濃度(2-20iiM)。而且，還原型谷胱甘肽在癌細(xì)胞中的濃度是正常細(xì) 胞的幾倍，利用其濃度變化，可促使藥物載體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而將藥物盡可能釋放在腫瘤 革巴向位點(diǎn)。
[0004] 但是目前文獻(xiàn)報(bào)道的同時(shí)具有pH和還原敏感性的聚兩性離子的文獻(xiàn)較少，且通常 所選用的原材料具有不可降解性，在體內(nèi)排泄困難，不滿足人體內(nèi)使用的要求，因而成為此 類(lèi)材料實(shí)際應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種基于氨基酸的聚兩性離子納米顆 粒的制備方法，該納米顆粒具有良好的生物相容性、在體內(nèi)可完全降解無(wú)殘留。
[0006] 首先將N，N_雙丙烯?；装放c脂肪族伯胺混合，通過(guò)親核加成得到交替共聚物， 所用脂肪族伯胺分別為辛胺、十二胺、十四胺或十六胺，投料時(shí)N，N_雙丙烯?；装放c脂肪 族伯胺摩爾比為1:0.8。由于在投料時(shí)將N，N-雙丙烯?；装愤^(guò)量，則在形成交替共聚物 時(shí)，聚合物末端有剩余雙鍵；
[0007] 然后在上述共聚物中添加N，N-雙丙烯?；装放c賴(lài)氨酸的混合物溶液，繼續(xù)進(jìn)行 反應(yīng)，得到含N，N-雙丙烯?；装?、脂肪族伯胺和賴(lài)氨酸的三嵌段共聚物；
[0008] 合成時(shí)的溶劑選擇體積比為1:2的去離子水與乙醇的混合溶劑，保證反應(yīng)原料脂 肪族伯胺、N，N-雙丙烯?；装泛唾?lài)氨酸具有良好的相容性，有利于反應(yīng)進(jìn)行。
[0009] 共聚物合成反應(yīng)完畢，向上述共聚物溶液中滴入超純水?dāng)嚢?，然后添加無(wú)水乙醚 萃取共聚物溶液，除去未反應(yīng)的N，N-雙丙烯?；装泛筒?；
[0010] 最后使用透析袋將水層溶液在純水中透析72小時(shí)，得到含氨基酸的聚兩性離子納 米顆粒分散液。透析的目的在于除去未反應(yīng)的小分子和低聚物，因?yàn)榉肿恿刻偷木酆衔?不易形成膠束，透析袋有各種規(guī)格，選擇3500的可達(dá)到目的。
[0011] 本發(fā)明還提供一種基于氨基酸的聚兩性離子納米顆粒在制備化療藥物載體中的 應(yīng)用，用所述任何方法所制得納米顆粒分散液，將其冷凍干燥后得到納米顆粒粉末，稱(chēng)取該 粉末加入到鹽酸阿霉素溶液中，攪拌8小時(shí)后在超純水中透析24小時(shí)，得到負(fù)載阿霉素的納 米顆粒。
[0012] 借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0013] 1.所合成的三嵌段共聚物中間段含N，N_雙丙烯?；装放c脂肪族伯胺，呈疏水 性;左右兩端含N，N-雙丙烯?；装泛唾?lài)氨酸，其中賴(lài)氨酸同時(shí)含有氨基和羧基，因而具有 兩性離子性能，呈親水性，因而三嵌段共聚物在純水中通過(guò)自組裝形成納米顆粒。
[0014] 2.納米顆粒有靈敏的pH敏感性，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的弱酸性條件下，膠束結(jié)構(gòu)發(fā)生 變化，可促使藥物釋放；
[0015] 3.共聚物中含有N，N-雙丙烯?；装方Y(jié)構(gòu)單元，其中的雙硫鍵具有還原響應(yīng)性， 能在還原型谷胱甘肽的腫瘤環(huán)境下斷裂，因而能夠?qū)⑺幬飶氐揍尫诺侥[瘤細(xì)胞靶向位點(diǎn)；
[0016] 4.納米顆粒外層的聚兩性離子賦予其優(yōu)異的抗蛋白質(zhì)非特異吸附性能，因而具有 特殊的抗污染性能，可保持納米顆粒在血液中的穩(wěn)定性；
[0017] 5.納米膠束無(wú)細(xì)胞毒性，滿足人體使用的安全性標(biāo)準(zhǔn)；
[0018] 上述說(shuō)明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段， 并可依照說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容予以實(shí)施，以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說(shuō)明如下。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1本發(fā)明中一種基于氨基酸的聚兩性離子納米顆粒的制備反應(yīng)示意圖；
[0020] 圖2本發(fā)明中實(shí)施例2所得基于賴(lài)氨酸的聚兩性離子納米顆粒的透射電鏡照片；
[0021] 圖3實(shí)施例2所得基于賴(lài)氨酸的聚兩性離子納米顆粒在10mM的谷胱甘肽溶液中不 同時(shí)間下的粒徑分布；
[0022] 圖4實(shí)施例2所得基于賴(lài)氨酸的聚兩性離子納米顆粒在不同蛋白質(zhì)溶液中的粒徑 變化；
[0023] 圖5實(shí)施例2所得基于賴(lài)氨酸的聚兩性離子納米顆粒的細(xì)胞毒性結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施 例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0025]實(shí)施例1:N，N_雙丙烯?；装返暮铣桑?br>[0026]將11.6g的胱胺二鹽酸鹽加入到250mL單口燒瓶中，然后加入50mL蒸餾水將胱胺二 鹽酸鹽攪拌溶解。將燒瓶置于〇°C的冰水混合物中；另外稱(chēng)取8g的氫氧化鈉固體溶于20mL的 蒸餾水中，將溶解好的氧氧化鈉溶液一次性加入到單口燒瓶中，將預(yù)先精制好的19mL丙烯 酰氯與3mL二氯甲烷混合成溶液，通過(guò)恒壓滴液漏斗滴加到單口燒瓶中，在40分鐘內(nèi)滴加完 畢后，控制反應(yīng)在25°C下反應(yīng)16h。產(chǎn)物過(guò)濾、用去離子水洗3次，最后用乙酸乙酯重結(jié)晶，在 真空干燥箱中干燥24h得到產(chǎn)物。
[0027]實(shí)施例2:基于氨基酸的聚兩性離子納米顆粒的制備：
[0028] 在25mL的三口燒瓶中，將蒸餾水1.7mL和無(wú)水乙醇3.3mL混合，將N，N-雙丙烯?；?胱胺0.26g和辛胺0.103g溶解于上述溶液中，調(diào)節(jié)pH值范圍為9.5~10，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，通過(guò) 油浴鍋加熱反應(yīng)液到40°C，恒溫條件下攪拌反應(yīng)48小時(shí)；
[0029] 將N，N-雙丙烯酰基胱胺0.26g和賴(lài)氨酸0.175g溶于蒸餾水1.7mL和無(wú)水乙醇3.3mL 的混合溶劑，然后添加到上述共聚物溶液中，調(diào)節(jié)pH值為10~11，在55°C恒溫條件下攪拌， 繼續(xù)反應(yīng)72小時(shí)，得到含N，N-雙丙烯?；装?、辛胺和賴(lài)氨酸的三嵌段共聚物。
[0030] 向上述共聚物溶液中滴入超純水，攪拌5小時(shí)，然后用5倍于共聚物溶液體積的無(wú) 水乙醚，均分三次萃取共聚物中殘留的N，N-雙丙烯?；装泛椭咀宀?，分離棄去乙醚 層;使用截留分子量為3500的透析袋，將水層溶液在純水中在30°C溫度下透析72小時(shí)，得到 含氨基酸的聚兩性離子納米顆粒分散液。
[0031] 實(shí)施例3
[0032]同實(shí)施例2,但是用十二胺0.148g代替辛胺0.103g，其余條件和操作不變，合成得 到含N，N-雙丙烯酰基胱胺、十二胺和賴(lài)氨酸的三嵌段共聚物，進(jìn)一步合成納米顆粒。
[0033] 實(shí)施例4
[0034]同實(shí)施例2,但是用十四胺0.170g代替辛胺0.103g，其余條件和操作不變，合成得 到含N，N-雙丙烯?；装贰⑹陌泛唾?lài)氨酸的三嵌段共聚物，進(jìn)一步合成納米顆粒。
[0035] 實(shí)施例5
[0036]同實(shí)施例2,但是用十六胺0.193g代替辛胺0.103g，其余條件和操作不變，合成得 到含N，N-雙丙烯?；装?、十六胺和賴(lài)氨酸的三嵌段共聚物，進(jìn)一步合成納米顆粒。
[0037] 實(shí)施例6
[0038]同實(shí)施例2,但是用十六胺0. 193g代替辛胺0. 103g，并且改變賴(lài)氨酸的量為 0.204g，其余條件和操作不變，合成得到含N，N-雙丙烯酰基胱胺、十六胺和賴(lài)氨酸的三嵌段 共聚物，進(jìn)一步合成納米顆粒。
[0039]表1三元共聚物合成配方一覽表
[0041 ] 實(shí)施例7
[0042]將實(shí)施例2所得納米顆粒分散液20此滴到銅網(wǎng)上，然后往銅網(wǎng)上滴加一滴1%磷鎢 酸溶液進(jìn)行染色，銅網(wǎng)在室溫下自然干燥后，用透射電子顯微鏡在高真空狀態(tài)下觀察納米 顆粒的形貌，透射電鏡加速電壓為120kV。圖2中顯示實(shí)施例2所得納米顆粒形貌呈球形，可 見(jiàn)粒徑分布較均一。
[0043] 實(shí)施例8:載藥納米顆粒的制備
[0044] 用權(quán)利要求1~5所述任何一種方法所制得納米顆粒分散液，將其冷凍干燥3天，得 到納米顆粒粉末，稱(chēng)取該粉末20mg，加入到5mL濃度為2mg/mL的鹽酸阿霉素溶液中，攪拌8小 時(shí)后在超純水中透析24小時(shí)，得到負(fù)載阿霉素的納米顆粒。
[0045] 實(shí)施例9:納米顆粒的抗牛血清白蛋白的非特異吸附性能
[0046] 將實(shí)施例2中所得納米顆粒分散液分別置于pH = 7.4的PBS緩沖溶液、含有濃度為 45g/L的牛血清白蛋白（BSA)和10%胎牛血清(FBS)溶液中，分別孵育12h，24h和48h，利用激 光光散射儀監(jiān)控納米顆粒粒徑的變化，觀察抗牛血清白蛋白非特異吸附性能。
[0047] 實(shí)施例10:聚兩性離子納米顆粒的生物相容性
[0048] 在溫度為37 °C的水浴鍋中，迅速解凍-80 °C凍存的3T3細(xì)胞和He la細(xì)胞，將其移入 到含有711^的1^〇-1640培養(yǎng)液的離心管中，以800印111速度離心，用含有10%小牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)液吹打細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，將其移入到50mL的培養(yǎng)瓶中，在37°C，5%⑶ 2 孵箱中培養(yǎng)。采用MTT法對(duì)其形成的納米粒子的細(xì)胞毒性進(jìn)行測(cè)試，以約2.0X104/mL將小 鼠成纖維細(xì)胞接種于96孔板，每孔100yL，培養(yǎng)24h，吸出每孔中的原培養(yǎng)液，每孔加入100yL 的陰性對(duì)照液(pH= 7.4的10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液）、陽(yáng)性對(duì)照液(0.64%苯酚培 養(yǎng)基）、樣品組(樣品組含pH=7.4的10 %小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液），繼續(xù)置于37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。每組設(shè)4個(gè)平行孔。取出培養(yǎng)板后通過(guò)倒置顯微鏡觀察、評(píng)價(jià)細(xì)胞生 長(zhǎng)狀況。后加入MTT 20yL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，將培養(yǎng)板中的小孔內(nèi)的液體吸盡后，加入二甲基 亞砜，用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)其吸光度值(A)，計(jì)算細(xì)胞存活率。3T3和Hela兩種細(xì)胞在不同 濃度的納米膠束溶液中的存活率在95%以上，符合生物相容性的標(biāo)準(zhǔn)。
[0049]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技 術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和 變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于氨基酸的聚兩性離子納米顆粒的制備方法，其特征是采取兩步法合成三嵌 段共聚物，中間段疏水，兩端鏈段含聚兩性離子，具有親水性，三嵌段共聚物在水溶液中自 組裝形成納米顆粒，制備依次包括以下步驟： 1) 將N，N-雙丙烯?；装放c脂肪族伯胺溶解在體積比為1:2的去離子水與乙醇的混合 溶劑中，濃度為6.8wt %~8.3wt %，調(diào)節(jié)pH值為9.5~10，通過(guò)親核加成得到交替共聚物，使 聚合物末端有剩余雙鍵； 2) 在上述共聚物中添加 N，N-雙丙烯酰基胱胺與賴(lài)氨酸的混合物溶液，繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)， 得到含N，N-雙丙烯?；装?、脂肪族伯胺和賴(lài)氨酸的三嵌段共聚物； 3) 向上述共聚物溶液中滴入超純水，攪拌5小時(shí)，然后添加無(wú)水乙醚萃取共聚物溶液3 次，分離棄去乙醚層； 4) 使用截留分子量為3500的透析袋，將水層溶液在純水中在30°C溫度下透析72小時(shí)， 得到含賴(lài)氨酸的聚兩性離子納米顆粒分散液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于氨基酸的聚兩性離子納米顆粒的制備方法，其特征是 在步驟1)中，所用脂肪族伯胺分別為辛胺、十二胺、十四胺或十六胺，投料時(shí)N，N-雙丙烯酰 基胱胺與脂肪族伯胺摩爾比為1:0.8。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于氨基酸的聚兩性離子納米顆粒的制備方法，其特征是 在步驟1)中，共聚反應(yīng)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下、在40°C恒溫條件下攪拌反應(yīng)48小時(shí)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于氨基酸的聚兩性離子納米顆粒的制備方法，其特征是 在步驟2)中，N，N-雙丙烯酰基胱胺與賴(lài)氨酸按摩爾比為1:1.2~1:1.4,溶解在體積比為1:2 的去離子水與乙醇的混合溶劑中，濃度為8. Owt %~8.5wt %，調(diào)節(jié)pH值為10~11，在55°C恒 溫條件下攪拌反應(yīng)72小時(shí)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于氨基酸的聚兩性離子納米顆粒的制備方法，其特征是 在步驟3)中，用5倍于共聚物溶液體積的無(wú)水乙醚，均分三次萃取共聚物中殘留的N，N-雙丙 烯酰基胱胺和脂肪族伯胺。6. -種基于氨基酸的聚兩性離子納米顆粒在制備化療藥物載體中的應(yīng)用，其特征是用 權(quán)利要求1~5所述任何一種方法所制得納米顆粒分散液，將其冷凍干燥3天，得到納米顆粒 粉末，稱(chēng)取該粉末20mg，加入到5mL濃度為2mg/mL的鹽酸阿霉素溶液中，攪拌8小時(shí)后在超純 水中透析24小時(shí)，得到負(fù)載阿霉素的納米顆粒。
【文檔編號(hào)】A61K9/14GK105820334SQ201610333883
【公開(kāi)日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年5月19日
【發(fā)明人】倪才華, 吳魯艷, 張麗萍, 石剛
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)