粗品肝素鈉不同種屬來源的快速鑒別方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及藥物來源檢測方法，具體地說是一種粗品肝素鋼不同種屬來源的快速 鑒別方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝素鋼是黏多糖硫酸醋類物質(zhì)，因其具有抗凝血作用，廣泛應(yīng)用于血栓形成或栓 塞性疾病的臨床治療。近年來研究證明，肝素鋼還具有降血脂作用。目前，肝素鋼主要來源 于豬、?；蜓虻哪c黏膜。但是，牛源性和羊源性的肝素鋼存在被相關(guān)病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)，且導(dǎo) 致血小板減少癥及血栓綜合征等不良反應(yīng)的發(fā)生概率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于豬源性肝素鋼。因此，在 臨床使用中人們會應(yīng)盡量選擇豬源性肝素鋼。然而，實(shí)際生產(chǎn)中由于生產(chǎn)材料來源復(fù)雜等 多方面原因，往往會導(dǎo)致豬來源的生產(chǎn)原料存在被牛、羊等來源的動(dòng)物材料污染的可能性。 因此，建立豬源、羊源、牛源等動(dòng)物來源成分的鑒別方法對控制藥品質(zhì)量、防止異種動(dòng)物源 性成分的污染至關(guān)重要。
[0003] 目前，現(xiàn)有技術(shù)中檢測不同種屬來源的肝素鋼的方法主要有免疫化學(xué)和核酸檢測 等。其中巧光定量PCR方法核酸檢測使用相對更為廣泛，具體是先從粗品肝素鋼中提取動(dòng)物 殘留核酸，再采用巧光定量PCR進(jìn)行檢測。巧光定量PCR技術(shù)是利用巧光信號的變化實(shí)時(shí)檢 ^UPCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板 進(jìn)行定量分析。運(yùn)種檢測方法結(jié)果較為精準(zhǔn)，但是運(yùn)種方法檢測肝素鋼時(shí)存在一定缺陷，因 為肝素對PCR有很強(qiáng)的抑制活性，所W在做定量PCR前需要使用肝素酶對肝素鋼樣品進(jìn)行前 處理，其操作復(fù)雜繁瑣、肝素酶和定量試劑費(fèi)用高昂，運(yùn)使得該方法在技術(shù)力量薄弱的中小 企業(yè)使用受到了很大的局限?？梢姡邪l(fā)成本低、操作便捷、準(zhǔn)確度高的不同種屬來源的肝 素鋼的鑒別方法是行業(yè)內(nèi)積極探索的課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種粗品肝素鋼不同種屬來源的快速鑒別方法，W解決現(xiàn)有檢測 方法要么無法控制肝素對后期PCR的抑制導(dǎo)致檢測準(zhǔn)確性降低，要么前處理操作繁瑣復(fù)雜、 成本較高的問題。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:粗品肝素鋼不同種屬來源的快速鑒別 方法，包括W下步驟： (a) 將待測粗品肝素鋼溶于溶劑A中，再加入生物磁珠，通過磁珠法提取粗品肝素鋼中 的總DNA，得待測粗品肝素鋼總DNA;所述溶劑A為每100血水中溶解有2g氯化鋼和IOg乙醇的 混合溶液;所述粗品肝素鋼、溶劑A、生物磁珠的質(zhì)量體積比為30mg: ImL: (b) 設(shè)計(jì)豬、羊、牛源性成分鑒別引物分別為： 豬源性成分鑒別引物： 上游引物:ATCTACATGATTCATTACAATTAC， 下游引物：CTATGTTTTTGAGTTTTGAGTTCA; 羊源性成分鑒別引物： 上游引物:ACACAACTTCTACCACAACCC， 下游引物:AAACAATGAGGGTAACGAGGG; 牛源性成分鑒別引物： 上游引物:GCCATATACTCTCCTTGGTGACA， 下游引物:GTAGGCTTGGGAATAGTACGA; (C)W步驟(a)所得待測粗品肝素鋼總DNA作為DNA模板，采用步驟(b)設(shè)計(jì)的豬、羊、牛 源性成分鑒別引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增體系為:DNA模板化L、上游引物化L、下游引物 化L、2倍PCR試劑預(yù)混液2化L，用d地2〇補(bǔ)齊至50化； PCR反應(yīng)程序?yàn)?在95 °C下預(yù)變性5min;在95 °C下變性15s;在63 °C下退火30s;在72 °C下 延伸30s;熱循環(huán)次數(shù)為40次;得擴(kuò)增產(chǎn)物； (d)將所述擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，如得到了分子量大小為15化P的特異性 條帶，則表明該待測粗品肝素鋼中含有豬源性肝素鋼成分;如獲得了分子量大小為14化P的 特異性條帶，則表明該待測粗品肝素鋼中含有羊源性肝素鋼成分;如獲得了分子量大小為 271bp的特異性條帶，則表明該待測粗品肝素鋼中含有牛源性肝素鋼成分。
[0006] 本發(fā)明步驟(a)中所述生物磁珠是指磁珠MGlOl，為天根生化科技(北京)有限公司 的市售產(chǎn)品。所述生物磁珠是指能夠吸附DNA的磁珠，由特殊工藝對磁性納米顆粒的表面進(jìn) 行修飾，在一定條件下對核酸具有很強(qiáng)的親和力，而當(dāng)條件改變時(shí)，磁珠釋放吸附的核酸， 能夠達(dá)到快速分離純化核酸的目的。
[0007] 本發(fā)明步驟(a)所述的通過磁珠法提取粗品肝素鋼中的總DNA的具體步驟是:①將 加入生物磁珠的待測粗品肝素鋼溶液置于離屯、管中振蕩10s，置于室溫解育lOmin，期間每 隔3min振蕩混勻IOs;②將離屯、管放置于磁力架上靜置Imin,待磁珠完全吸附時(shí)除去液體； ③將離屯、管從磁力架上取下，加入6倍所述生物磁珠體積的漂洗液A，振蕩混勻Imin;④將離 屯、管放置于磁力架上靜置1 min,待磁珠完全吸附后，除去液體;⑤將離屯、管從磁力架上取 下，再加入6倍所述生物磁珠體積的漂洗液B，振蕩混勻1 min;⑥將離屯、管放置于磁力架上 靜置1 min,磁珠完全吸附后，除去液體;⑦重復(fù)步驟⑤-⑥一次;⑧再將離屯、管置于于磁力 架上，56°C驚干5-10 min;⑨將離屯、管從磁力架上取下，加入20化的dd出0,56°C振蕩混勻5 min;⑩將離屯、管放置于磁力架上靜置2 min，待磁珠完全吸附后，將得到的DNA轉(zhuǎn)移至一個(gè) 新離屯、管中即可;所述漂洗液A為每IL水中溶有O.Smol的LiCl、0.5mol的NaCl和200g的PEG, 其pH值為7.0;所述漂洗液B為質(zhì)量百分比濃度為80%的乙醇。
[000引本發(fā)明步驟(d)中所述的2倍PCR試劑預(yù)混液是指:Tris-HCKpH值為8.3)20mmol/ UdNTP 0.4mmol/L、KCl 100mmol/L、MgCl2 3mmol/L、taq酶0.05U/mL，溶劑為(1地20。
[0009]本發(fā)明步驟(d)中所述擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的具體工藝為:取20化 所述擴(kuò)增產(chǎn)物加入上樣緩沖液化L，采用質(zhì)量百分比濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓 100V，電泳20min。上樣緩沖液是指IL水中溶解有O.Olmol的抓TA、0.25g的漠酪蘭、0.25g的 二甲苯氯和50g的甘油的混合溶液。
[0010]本發(fā)明通過從粗品肝素鋼中提取總DNA、設(shè)計(jì)特異性引物、PCR擴(kuò)增反應(yīng)W及電泳 數(shù)據(jù)分析等一系列步驟準(zhǔn)確地檢測了粗品肝素鋼的不同種屬來源，同時(shí)也快速鑒別了該粗 品肝素鋼是否為混雜有羊源性或牛源性成分的產(chǎn)品，運(yùn)為醫(yī)藥采購把關(guān)及臨床醫(yī)用提供了 可靠的檢驗(yàn)結(jié)果。本發(fā)明的特別創(chuàng)新之處在于對待測樣品總DNA采用的是特定磁珠提取法， 該方法有效解決了傳統(tǒng)方法中存在的肝素對PCR抑制的問題，而且大大降低了成本，方法簡 潔明了，快速簡便，重復(fù)性好，易操作，準(zhǔn)確性高，適于在鑒定肝素粗品質(zhì)量中推廣應(yīng)用。
【附圖說明】
[0011] 圖1為鑒別豬、羊、牛源性粗品肝素鋼的電泳圖譜。圖中1為分子量標(biāo)準(zhǔn)；2.為牛源 性成分陰性對照;3為1000 pg/化牛源性成分?jǐn)U增產(chǎn)物特異性條帶;4為10000 pg/化豬源性 成分?jǐn)U增產(chǎn)物特異性條帶;5為1000 pg/化豬源性成分?jǐn)U增產(chǎn)物特異性條帶；，6為100 PgAi L豬源性成分?jǐn)U增產(chǎn)物特異性條帶;7為豬源性成分陰性對照;8為羊源性成分陰性對照;9為 10000 pg/化羊源性成分?jǐn)U增產(chǎn)物特異性條帶；10為lOOOpg/化羊源性成分?jǐn)U增產(chǎn)物特異性 條帶；11為100 PgAiL羊源性成分?jǐn)U增產(chǎn)物特異性條帶。
[0012] 圖2為鑒別豬源性粗品肝素鋼中混雜羊源性成分的電泳圖譜。圖中1為分子量標(biāo) 準(zhǔn)，2為產(chǎn)品含有質(zhì)量百分比為10%的羊源性肝素鋼的電泳條帶;3為產(chǎn)品含有質(zhì)量百分比為 1%的羊源性肝素鋼的電泳條帶;4為產(chǎn)品含有質(zhì)量百分比為0.1%的羊源性肝素鋼的電泳條 帶;5為陰性對照。
[001引圖3為本發(fā)明與對比例提取粗品肝素鋼中總DNA數(shù)量電泳圖譜。圖中巧分子量標(biāo) 準(zhǔn)，2為樣本A電泳條帶，3為樣本B電泳條帶。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面實(shí)施例用于進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限 定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。但 不W任何形式限制本發(fā)明。
[0015] 本發(fā)明中所述使用的生物磁珠來自天根生化科技（北京）有限公司市售的磁珠 MGlOlo
[0016] 實(shí)施例1豬源性粗品肝素鋼樣品的檢測 (1)提取豬源性粗品肝素鋼的總DNA:飯稱取豬源性粗品肝素鋼30mg溶于ImL的溶劑A中 (1 OOmL水中溶解有2g化Cl和1 Og乙醇的混合溶液），置于離屯、管中；?向樣本溶液中加入30 化生物磁珠，蓋上管蓋，振蕩混勻10 S;③室溫解育10 min,期間每3 min上下顛倒混勻10 S，使磁珠和核酸充分結(jié)合，離屯、收集附著在管壁及管蓋的液體;戚將離屯、管放置于磁力架 上靜置1 min，待磁珠完全吸附時(shí)，小屯、吸去液體;霞將離屯、管從磁力架上取下，加入500 iiL 漂洗液A(漂洗液A為IL水中溶解有0. Smol的LiCl、0.5mol的化Cl W及200g的PEG的混合溶 液，pH 7.0)，振蕩混勻1 min;風(fēng)將離屯、管放置于磁力架上靜置1 min,磁珠完全吸附后，小 屯、吸去液體;逆將離屯、管從磁力架上取下，加入500化漂洗液B(漂洗液B為質(zhì)量百分比濃度 為80%的乙醇），振蕩混勻1 min;厳將離屯、管放置于磁力架上靜置1 min,磁珠完全吸附后， 小屯、吸去液體;?:重復(fù)步驟?-敏一次;⑩離屯、管于磁力架上，56°C驚干10 min;?將離屯、管