一種草酸脫羧酶及草酸脫羧酶的重組表達(dá)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種新的低抑環(huán)境下穩(wěn)定且高效的草酸脫簇酶，W及草酸脫簇酶的重 組表達(dá)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 草酸(oxalic acid)是一種分子式為C2〇邊2、分子量為90.04的二元有機(jī)酸，存在于 常見(jiàn)的絕大多數(shù)食物中，在特定食物(如渡菜或其它綠色蔬菜、綠茶、可可豆，豆?jié){，咖啡等） 中含量很高。草酸在生物體內(nèi)為最終產(chǎn)物，不能被進(jìn)一步分解，主要排泄方式是隨尿液一起 排出。人體中的草酸包括外源性草酸和內(nèi)源性草酸，外源性草酸是指通過(guò)飲食攝入的草酸， 內(nèi)源性草酸是指人體肝臟自身代謝產(chǎn)生的草酸，正常人體內(nèi)的外源性草酸和內(nèi)源性草酸的 含量基本相同。某些腎結(jié)石高發(fā)人群則外源性草酸遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于內(nèi)源性草酸。
[0003] 人體內(nèi)血液和尿液中的草酸含量過(guò)高時(shí)，容易與巧離子形成不溶性的草酸巧晶 體，草酸巧晶體很容易在膀脫、腎臟等器官內(nèi)沉積形成結(jié)石。n型高草酸尿癥是指食源性草 酸吸收異常，導(dǎo)致尿草酸較正常人偏高，是原發(fā)性高草酸尿癥外導(dǎo)致結(jié)石的重要因素，因 此，控制從飲食中攝取的草酸，很大程度上就可W降低尿草酸量，從而降低患結(jié)石風(fēng)險(xiǎn)。低 草酸飲食或降解食物中草酸的防治草酸巧結(jié)石的策略在醫(yī)學(xué)界已成為共識(shí)。飲食中草酸主 要在胃中被釋放出來(lái)，濃度也相對(duì)較高，非常有利于酶法降解去除，但是胃中的低pH環(huán)境及 胃蛋白酶對(duì)草酸降解酶的活力有很大的挑戰(zhàn)，因此尋找在低pH條件下能高效降解草酸的酶 成為此治療技術(shù)的關(guān)鍵。
[0004] 目前已發(fā)現(xiàn)的具有分解草酸功能的酶，有草酸脫簇酶（W下簡(jiǎn)稱"0XDC")、草酸氧 化酶和草酷CoA脫簇酶。OXDC的作用是催化草酸分解為甲酸和二氧化碳。迄今已知，已有報(bào) 道的OXDC主要來(lái)自芽抱桿菌（Ba Ci Ilus)屬、曲霉（Aspergillus)屬、金針茹 (Flammulinavelutipes)，云芝（Coriolus versicolor)，白腐菌（Trametes versicolor) 等。草酸脫簇酶在上述物種中的表達(dá)量極低，而且多數(shù)菌種生長(zhǎng)緩慢，成分復(fù)雜，分離提取 純化十分困難，不具備商業(yè)化應(yīng)用可能，所W將草酸脫簇酶進(jìn)行重組表達(dá)生產(chǎn)成為其商業(yè) 化應(yīng)用的必然選擇。目前草酸脫簇酶中實(shí)現(xiàn)原核重組表達(dá)的是枯草芽抱桿菌屬的Yv巧基因 來(lái)源0XDC，并對(duì)其進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的解析，但是其酶活力范圍為PH3.0~6.0,低于3.0無(wú)活力。 金針茹來(lái)源的OXDC有通過(guò)煙草表達(dá)成功過(guò)報(bào)道，但表達(dá)量極低，同時(shí)也進(jìn)行了原核 化.coli)表達(dá)但無(wú)酶活力（參見(jiàn)文獻(xiàn)：Meenu Kesa;rwani，et.al Oxalate Decarboxylase from Collybia velutipes，T肥 J抓RNAL OF BIOLOGICAL C肥MISTRY，2000)，其他種屬或 基因來(lái)源OXDC，尤其是真核生物的OXDC，尚未發(fā)現(xiàn)有成功進(jìn)行重組表達(dá)的報(bào)道，尤其是用大 腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行重組表達(dá)的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中低抑(抑<3.0)穩(wěn)定且有活力的OXDC無(wú)法進(jìn)行大腸桿菌重組 表達(dá)運(yùn)一技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)高通量篩選，獲得了多個(gè)在胃腸道環(huán)境下(pH 1.5~7.5)均 有較高草酸降解酶活力，且在低抑胃環(huán)境(pH 1.5~3.0)有高活力的草酸脫簇酶，并克隆得 到其編碼基因通過(guò)改造實(shí)現(xiàn)了其重組表達(dá)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了低抑穩(wěn)定且有活 力的OXDC的大腸桿菌重組表達(dá)方法。
[0006] 本發(fā)明提供的一種草酸脫簇酶，其為通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組表達(dá)，并在 pH<3.0時(shí)穩(wěn)定且有活力;表達(dá)過(guò)程中該草酸脫簇酶的蛋白序列較原生酶蛋白序列缺失信 號(hào)膚片段。重組表達(dá)時(shí)，將運(yùn)些草酸脫簇酶信號(hào)膚部分的DNA序列去除，使得改造后的基因 不含信號(hào)膚編碼序列，實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌重組表達(dá)，克服了現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于pH<3.0時(shí)穩(wěn)定且 有活力的草酸脫簇酶無(wú)法通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的問(wèn)題，降低了生產(chǎn)成本。
[0007] 所述的pH<3.0時(shí)穩(wěn)定且有活力，是指在抑低于3.0的環(huán)境下仍然有活力，并且酶 功能穩(wěn)定。該草酸脫簇酶，優(yōu)選在抑<2.8,抑<2.6, pH< 2.4,抑<2.2,抑<2.0,抑<1.8或 抑<1.5環(huán)境下穩(wěn)定且有活力。
[0008] 本發(fā)明還提供一種可食用組合物，其含W上所述的草酸脫簇酶，用于預(yù)防和/或治 療原發(fā)性高草酸尿癥、II型高草酸尿癥、腸源性高草酸尿癥及含草酸巧泌尿結(jié)石疾病中的 一種或多種。由于本發(fā)明的草酸脫簇酶在低抑(抑<3.0)環(huán)境下仍然具有較高的酶活且活 性穩(wěn)定，因此可W用于制備預(yù)防和/或治療上述多種疾病的可食用組合物。
[0009] 優(yōu)選地，上述可食用組合物為藥物組合物、保健食品或特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品。所 述的特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品主要是為了滿足進(jìn)食受限、消化吸收障礙、代謝素亂或特定疾 病狀態(tài)人群對(duì)營(yíng)養(yǎng)素或膳食的特殊需要，?？诩庸づ渲贫傻呐浞绞称?。該類產(chǎn)品必須在 醫(yī)生或臨床營(yíng)養(yǎng)師指導(dǎo)下，單獨(dú)食用或與其他食品配合食用。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種食品添加劑，其含W上所述的草酸脫簇酶，用于制備低草酸/ 無(wú)草酸的食品或飲料。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種草酸脫簇酶的重組表達(dá)方法，適用于pH<3.0時(shí)仍有活力的 草酸脫簇酶的表達(dá)生產(chǎn)，其是將優(yōu)化后草酸脫簇酶編碼基因的DNA片段與大腸桿菌表達(dá)載 體按照3~9:1的摩爾比混合進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體，重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化D冊(cè)a感受態(tài) 細(xì)胞;通過(guò)PCR及測(cè)序驗(yàn)證來(lái)篩選構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化菌，培養(yǎng)后抽取重組表達(dá)載 體，轉(zhuǎn)化含有分子伴侶的大腸桿菌表達(dá)菌株，進(jìn)行15~3(TC的低溫培養(yǎng)并誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。 [00 12] 該重組表達(dá)方法，優(yōu)選適用于在抑<2.8,抑<2.6，pH<2.4,抑<2.2,抑<2.0,抑 <1.8，pH<l. 5環(huán)境下穩(wěn)定且有活力的草酸脫簇酶的表達(dá)生產(chǎn)。
[0013]感受態(tài)細(xì)胞(competent cells)是一種具有攝入外源DNA能力的受容菌，它可W攝 取外源的質(zhì)粒DNA等。
[0014] pH<3.0時(shí)仍有活力的草酸脫簇酶在大腸桿菌中通常無(wú)法表達(dá)，本發(fā)明通過(guò)對(duì)含 有其編碼基因的DNA片段進(jìn)行優(yōu)化處理，并在表達(dá)菌株中增加分子伴侶來(lái)實(shí)現(xiàn)其在大腸桿 菌中的表達(dá)，提供了另一條簡(jiǎn)便的生產(chǎn)途徑。
[0015] 優(yōu)選地，上述草酸脫簇酶的重組表達(dá)方法中，所述的優(yōu)化包括刪除草酸脫簇酶編 碼基因DNA片段的信號(hào)膚片段;或刪除草酸脫簇酶編碼基因DNA片段的信號(hào)膚片段并在C端 融合助溶標(biāo)簽;或刪除草酸脫簇酶編碼基因DNA片段的信號(hào)膚片段并在C端融合助溶標(biāo)簽W 及進(jìn)行密碼子優(yōu)化;或?qū)Σ菟崦摯孛妇幋a基因DNA片段進(jìn)行密碼子優(yōu)化和刪除信號(hào)膚片段。
[0016] 所述密碼子優(yōu)化是將其密碼子更換為更加適合于大腸桿菌表達(dá)的密碼子，信號(hào)膚 是影響低抑穩(wěn)定且有活力的草酸脫簇酶表達(dá)的關(guān)鍵因素，因此編碼信號(hào)膚部分的基因必須 去除，才能實(shí)現(xiàn)其在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的正常表達(dá);融合助溶標(biāo)簽?zāi)軌虼蟠筇岣弑磉_(dá)蛋白 的溶解性，降低包涵體的形成，提高生產(chǎn)效率。
[0017] 優(yōu)選地，上述草酸脫簇酶的重組表達(dá)方法中，所述助溶標(biāo)簽為多聚谷氨酸片段，多 聚天冬氨酸片段，多聚賴氨酸片段，多聚谷氨酷胺片段和多聚天冬酷胺片段中的任意一種， 或者由谷氨酸、天冬氨酸、天冬酷胺、賴氨酸和谷氨酷胺五種氨基酸隨機(jī)組合的片段。隨機(jī) 組合是指五種氨基酸殘基的排列和數(shù)量的隨機(jī)搭配。
[0018] 優(yōu)選地，上述草酸脫簇酶的重組表達(dá)方法中，所述表達(dá)載體為乳糖誘導(dǎo)表達(dá)載體、 半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)載體、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)載體、熱誘導(dǎo)表達(dá)載體或者冷誘導(dǎo)表達(dá)載體。通過(guò)誘導(dǎo) 表達(dá)，能夠準(zhǔn)確控制表達(dá)過(guò)程。
[0019] 優(yōu)選地，上述草酸脫簇酶的重組表達(dá)方法中，所述大腸桿菌表達(dá)菌株為化2UBL21 (DE3)、K12、K12(DE3)、0;rigami、0;rigami(DE3) 'Origami B'Origami B(DE3) 'Rosetta或 Roset1:a(DE3)。
[0020] 其中，Origami B(DE3)是衍生自IacZY突變的化21菌株，運(yùn)個(gè)突變能根據(jù)IPTG的濃 度精確調(diào)節(jié)表達(dá)產(chǎn)物，使得表達(dá)產(chǎn)物量呈現(xiàn)IPTG濃度依賴性。
[0021 ] Rosetta(DE3)(Roset1:a Competent Cell(DE3))是采用大腸桿菌Rosetta菌株經(jīng) 特殊工藝處理得到的大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，具有氯霉素抗性，補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的6種 稀有密碼子(AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA)對(duì)應(yīng)的tRNA，提高外源基因，尤其是真核來(lái)源的草 酸脫簇酶基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)水平。
[0