人乳頭瘤病毒的核酸檢測試劑盒及其使用方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種核酸檢測試劑盒及其使用方法和應(yīng)用，特別是涉及一種人乳頭瘤 病毒的核酸檢測試劑盒及其使用方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 人乳頭瘤病毒（HPV)是一種屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A屬，是球形DNA 病毒，具有高度的特異性，可定向感染皮膚黏膜的鱗狀上皮并引起增殖。目前已分離出130 多種，不同的型別引起不同的臨床表現(xiàn)，根據(jù)侵犯的組織部位不同可分為：
[0003] 皮膚低危型（HPV1、2、3、4、7、10、12、15等），其與尋常巧、扁平巧、妬巧等相關(guān)；
[0004] 皮膚高危型（HPV5、8、14、17、20、36、38);
[0005] 黏膜低危型（HPV6、11、13、32、：M、40、42、43、44、53、54 等）；
[0006] 黏膜高危型（HPV16、18、30、31、33、35、39)。
[0007] 2004年發(fā)布的HPV hanclbook中提出HPV高危型別中有18個型別（HPV16、18、26、 31、33、35、39、51、53、56、59、66、68、73、82)可導(dǎo)致宮頸癌，而低危型別中6、11型別的感染 概率也很高，能夠?qū)е录怃J濕巧等疾病。
[0008] 另外，目前發(fā)現(xiàn)的HPV型別中，約40多種可特異性的感染肛口生殖器部位的皮膚 和粘膜。按照HPV所導(dǎo)致皮膚損傷的性質(zhì)，可將HPV型別分為高危型化i曲Risk, HR)和低 危型化0W Risk, LR)。同時，大量研究表明，宮頸HR-HPV感染是宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌 發(fā)病的必要條件。女性宮頸持續(xù)感染高危型HPV不但為宮頸癌的發(fā)生埋下隱患，而且增加 了病毒在性伴侶之間相互傳播的機會。經(jīng)研究，HPV的感染在人群中普遍存在，女性的一生 至少有80%感染HPV的風(fēng)險，在臨床觀察中，注意控制HPV的持續(xù)感染，可控制宮頸癌的發(fā) 生。有研究發(fā)現(xiàn)，70% W上有性生活的婦女會感染HPV。因此，對預(yù)防和治療性HPV疫苗的 研究在防治宮頸癌及其他惡性腫瘤方面具有極其重要的意義。雖然人們已經(jīng)認(rèn)識到HPV感 染的危害性，但是目前并沒有一種被證實有效的方法來消除宮頸HPV的感染，提前注射HPV 部分亞型的疫苗，是目前唯一用于預(yù)防HPV感染的方法。因此，快速、準(zhǔn)確、高效的對HPV亞 型進行檢測，對預(yù)防和治療HPV感染具有重要意義。
[0009] 另外，目前HPV的檢測診斷方法有宮頸細胞學(xué)檢測、病理檢查、核酸雜交檢測、雜 交捕獲法、分子導(dǎo)流雜交法、液態(tài)芯片法、免疫色譜層析試紙檢測、實時英光PCR法、PCR+基 因測序法、ELISA+雜交捕獲法等，主要的幾種如下：
[0010] 1)子宮頸細胞學(xué)檢測；液基為主的細胞學(xué)檢測如CCT，TCT，LCT，CCT-傳統(tǒng)制片， 自動閱片系統(tǒng)；TCT -自動制片系統(tǒng)，人工閱片；LCT -自動制片系統(tǒng)+自動輔助閱片系統(tǒng)+ 人工閱片，其特點是鏡下挖空細胞，檢出率28 %。
[0011] 2)顯微鏡下病理檢查；病理科制片后，鏡下觀察檢出率34%，受病理制片因素影 響及病理科醫(yī)師水平影響。
[001引扣第二代雜交捕獲，HCII ;第1個抑A批準(zhǔn)臨床檢測應(yīng)用的方法，能區(qū)分高低危， 可W相對定量，缺點是；無內(nèi)標(biāo)，檢測時間較長值NA分解45min、DNA-RNA雜交60min、抗體 捕獲60min、化學(xué)發(fā)光30min、計算機判讀15min)，靈敏度低，成本高，和檢測范圍外的HPV亞 型存在交叉反應(yīng)，造成假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。
[0013] 4)分子導(dǎo)流雜交（凱譜）：利用了小通量核酸芯片的原理，定性，能夠一次性確定 單種或多種的具體型別HPV感染情況，有內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)，控制了 PCR的高敏感性及假陽性高的缺 點，而且檢測型別可W根據(jù)平臺要求有擴展空間。凱普生物使用該種技術(shù)已開發(fā)多種HPV 檢測試劑盒，其中37種（HPV)分型檢測試劑盒可對37種HPV型別精確分型，包括HPV6U1、 42、43、44、16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、81、26、34、40、54、55、57、 61、67、69、70、71、72、73、82、83及84。優(yōu)點；可對型別具體分型。缺點；靈敏度低，開蓋操作 易污染，價格昂貴。
[0014] 5)液態(tài)芯片法（luminex);利用液相芯片的原理可進行定性和定量分型，而且可 W具體分型。目前上海透景生命科技有限公司使用luminex平臺已開發(fā)出HPV檢測試劑 盒，可對 19 種高危亞型 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、26、53、55、68、82、8 和 7種低危亞型6、11、40、42、44、61、73進行有效擴增。優(yōu)點：能夠具體分型；缺點；手工操作 繁瑣、開蓋操作易污染、價格昂貴。
[0015] 6)英光PCR法：利用英光PCR法檢測HPV病毒，所需的檢測時間較短，靈敏度高， 可有效降低漏檢的的可能，成本相對較低，無需PCR后開蓋操作，防污染系統(tǒng)完善，可預(yù)防 由于污染產(chǎn)生假陽性結(jié)果。然而英光PCR法受到檢測通道的限制，一般只對16、18、6、11進 行分型，其他型別不能具體分型。同時目前大多數(shù)PCR分型產(chǎn)品目標(biāo)序列為L區(qū)，對某些型 別不能準(zhǔn)確區(qū)分。
[0016] 綜上所述，宮頸細胞學(xué)檢測、病理學(xué)檢查受主觀因素影響較大，靈敏度也較低，所 W臨床應(yīng)用中存在一定的漏檢率；核酸雜交法、雜交捕獲法、分子導(dǎo)流雜交法、液態(tài)芯片法 相對于前者，靈敏度有所提高，對HPV型別檢測的覆蓋范圍較大，但由于在操作過程中容易 產(chǎn)生污染，導(dǎo)致假陽性結(jié)果的產(chǎn)生；實時英光PCR法具有更高的靈敏度及特異性，可W極大 的降低假陽率和漏檢率，檢測過程可全自動化進行，降低人力的投入，但由于英光通道數(shù)量 的制約和多重PCR技術(shù)的難度，在HPV型別確定方面存在一定的限制。
[0017] 上述的檢測方法均存在自身的缺陷，為臨床HPV的診斷和治療帶來一定困難。因 此，對已有技術(shù)所存在的缺陷進行改進，使其在HPV臨床檢測時能夠發(fā)揮更為有效的作用 至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種人乳頭瘤病毒（HPV)的核酸檢測試劑盒及 其使用方法和應(yīng)用。本發(fā)明利用多重實時英光PCR法作為技術(shù)平臺，W HPV基因組E區(qū)基 因為目標(biāo)序列進行引物探針設(shè)計，并綜合HPV在中國的主要感染型別及最新相關(guān)疫苗的研 制情況進行試劑盒的開發(fā)，使其可對多種高危型別及低危型別進行檢測，并同時對多種HPV 亞型進行分型鑒別，對于HPV感染跟蹤監(jiān)測、治療W及HPV相關(guān)疫苗的注射起到一定的輔助 作用。同時，該試劑盒具有能對HPV相對病毒載量進行推算、避免污染、提高樣本處理通量、 避免檢漏等優(yōu)點。
[0019] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的人乳頭瘤病毒（HPV)的核酸檢測試劑盒，包括：核 酸擴增試劑；
[0020] 其中，所述核酸擴增試劑包括；引物對、與引物對相對應(yīng)的探針；
[0021] 所述引物對包括；如沈Q ID NO. 1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12、13-14、15-16、 17-18、19-20、21-22、23-24、25-26、27-28、29-30、31-32、33-34、35-36、37-38、39-40、 41-42、43-44、45、46、47-48所示的引物對和如沈9 10^.73-74所示的內(nèi)標(biāo)（人類看家基 因目-globin)引物對；引物對中的引物濃度優(yōu)選為80~140nmol/L ;
[0022] 所述與引物對相對應(yīng)的探針包括；與如沈Q ID NO. 1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、 11-12、13-14、15-16、17-18、19-20、21-22、23-24、25-26、27-28、29-30、31-32、33-34、 35-36、37-38、39-40、41-42、43-44、45、46、47-48 所示的引物對分別相對應(yīng)的如沈Q ID NO. 49-72所示的探針，W及如SEQ ID NO. 75所示的內(nèi)標(biāo)（人類看家基因目-globin)探針； 探針的濃度優(yōu)選為20~50nmol/L。
[0023] 所述探針的兩端（5'端和3'端）還分別連接有英光基團和渾滅基團；其中，女口 SEQ ID NO. 49-72所示的探針的5'端的英光基團可W選用FAM、肥X、CY5或R0X，如SEQ ID NO. 49-72所示的探針3'端的渾滅基團可W選用非英光渾滅基因，包括；B冊1或B冊2 ;
[0024] 內(nèi)標(biāo)探針的5'端還可標(biāo)記有TAMARA英光基團，3'端標(biāo)記有B冊1或B冊2渾滅基 團。
[00巧]如SEQ ID N0.51-52、69-72所示的探針（針對低危型人乳頭瘤病毒的特異性探 針）的5'端標(biāo)記有FAM、R0X或CY5英光基團，3'端標(biāo)記有B冊1或B冊2渾滅基團。
[0026] 如SEQ ID NO. 49-50、53-68所示的探針（針對高危型人乳頭瘤病毒的特異性探 針）的5'端標(biāo)記有FAM、R0X、CY5或肥X英光基團，3'端標(biāo)記有B冊1或B冊2渾滅基團。
[0027] 在本發(fā)明中，如沈Q ID NO. 49、51、53所示的探針（分別針對HPV16、HPV6和HPV31 型的特異性探針）的5'端優(yōu)選使用R0X英光基團標(biāo)記；
[0028] 如沈Q ID NO. 50、52、54所示的探針（分別針對HPV18、HPV11和HPV33型的特異 性探針）的5'端優(yōu)選使用CY5英光基團標(biāo)記；
[0029] 如SEQ ID NO. 57、62所示的探針（分別針對HPV45和HPV58型的特異性探針）的 5'端優(yōu)選使用肥X英光基團標(biāo)記；
[0030] 如沈Q ID NO. 55-56、58-61、63-72 所示的探針（分