一種水產(chǎn)品中副溶血性弧菌和霍亂弧菌的雙重lamp檢測(cè)引物及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水產(chǎn)品生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種水產(chǎn)品中副溶血性弧菌和霍 亂弧菌的雙重LAMP檢測(cè)引物及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人們生活水平的提高，食品安全問題越來越受到人們的重視，已成為重大的 世界性公共問題，而病原微生物引起的食源性疾病是影響食品安全的最主要的因素之一。 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和霍亂弧菌(Vibrio cholerae)在世界范圍內(nèi) 被公認(rèn)是兩種重要的腸道致病菌。前者廣泛存在于海洋環(huán)境中，是威脅海水養(yǎng)殖業(yè)的主要 病原菌之一，能夠感染魚、蝦和貝類等，引起蝦紅體病、魚類皮膚潰瘍等疾病，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè) 造成重大經(jīng)濟(jì)損失。人類食用該菌污染的海產(chǎn)品后可引起食物中毒，會(huì)有腹瀉、惡心、嘔吐、 發(fā)熱，甚至脫水、昏迷等癥狀，嚴(yán)重的可導(dǎo)致敗血癥甚至死亡，是日本、歐美和東南亞國(guó)家食 物中毒和急性腹瀉病的重要病原菌?；魜y弧菌是環(huán)境水體自然菌群中的一種，霍亂弧菌中 的01群和0139群菌株可以引起很嚴(yán)重的人類腹瀉病，主要表現(xiàn)為劇烈的嘔吐、腹瀉、失水若 搶救不及時(shí)，病死率較高，屬于國(guó)際檢疫傳染病，在我國(guó)被列為甲類傳染病。近年來，食用鮮 活海產(chǎn)品的人群和地域在不斷增多，由此兩種病原菌引發(fā)的食品安全問題也顯得越來越重 要。
[0003] 鑒于其高度危害性，我國(guó)對(duì)人工養(yǎng)殖及海捕水產(chǎn)品中這霍亂和副溶血性弧菌有著 嚴(yán)格的限量要求。目前我國(guó)用于檢測(cè)食品中這兩種菌的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，皆屬于傳統(tǒng) 的培養(yǎng)及生化鑒定方法，檢測(cè)周期長(zhǎng)、工作量大，不能滿足水產(chǎn)品質(zhì)量安全快速反應(yīng)體系的 需求。LAMP作為一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，較其它分子生物學(xué)檢測(cè)方法而言具有實(shí)驗(yàn)條件低、 靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，在微生物的檢測(cè)中受到青睞并推廣應(yīng)用。該技術(shù)在食源性致 病菌的檢測(cè)中已有初步研究，但都是采用單一檢測(cè)，耗時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)成本高。同時(shí)檢測(cè)副溶血 性弧菌和霍亂弧菌的雙重LAMP體系未見報(bào)道。若采用多重LAMP體系，由于存在多對(duì)引物，弓丨 物之間的干擾以及引物與模板的錯(cuò)配而造成靈敏度下降與非特異性擴(kuò)增反應(yīng)增加等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于一種水產(chǎn)品中副溶血性弧菌和霍亂弧菌的雙重LAMP檢測(cè)引物， 引物之間的干擾小，非特異性擴(kuò)增反應(yīng)少，保證了檢測(cè)的靈敏度與特異性，既提高檢測(cè)速度 降又降低了檢驗(yàn)成本。
[0005] 本發(fā)明還提供了一種水產(chǎn)品中副溶血性弧菌和霍亂弧菌的雙重LAMP檢測(cè)試劑盒， 不但保持了較高的特異性和敏感性，而且更加方便、快捷和經(jīng)濟(jì)，一次反應(yīng)可檢測(cè)兩種致病 菌。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0007] -種水產(chǎn)品中副溶血性弧菌和霍亂弧菌的雙重LAMP檢測(cè)引物，包括3對(duì)霍亂弧菌 LAMP擴(kuò)增引物和3對(duì)副溶血性弧菌LAMP擴(kuò)增引物，3對(duì)霍亂弧菌LAMP擴(kuò)增引物具體如下： [0008]內(nèi)引物ompw-FIP，序列信息見SEQ ID No. 1，
[0009] 內(nèi)引物ompw-BIP，序列信息見SEQ ID Νο·2，
[0010] 外引物ompw_F3,序列信息見SEQ ID Νο.5，
[0011] 外引物〇mpw_B3,序列信息見SEQ ID Νο.6，
[0012] 環(huán)引物ompw-LF，序列信息見SEQ ID Νο·9，
[0013] 環(huán)引物ompw-LB，序列信息見SEQ ID No. 10;
[0014] 3對(duì)副溶血性弧菌LAMP擴(kuò)增引物具體如下：
[0015] 內(nèi)引物toxR-FIP，序列信息見SEQ ID Νο·3，
[0016] 內(nèi)引物toxR-BIP，序列信息見SEQ ID Νο·4，
[0017] 外引物toxR-F3,序列信息見SEQ ID Νο·7，
[0018] 外引物toxR-B3,序列信息見SEQ ID Νο·8，
[0019] 環(huán)引物toxR-LF，序列信息見SEQ ID No.ll，
[0020] 環(huán)引物toxR-LB，序列信息見SEQ ID Νο·12。
[0021] 本發(fā)明首次開發(fā)了雙重LAMP技術(shù)快速檢測(cè)水產(chǎn)品中副溶血性弧菌和霍亂弧菌。針 對(duì)副溶血性弧菌、霍亂弧菌分別設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，引物之間的干擾小，非特異性擴(kuò)增反 應(yīng)少，保證了檢測(cè)的靈敏度與特異性，既提高檢測(cè)速度降又降低了檢驗(yàn)成本。本發(fā)明特別在 雙重LAMP擴(kuò)增時(shí)引入了特定的環(huán)引物，大大提高了擴(kuò)增效率，縮短了檢測(cè)時(shí)間。
[0022] -種水產(chǎn)品中副溶血性弧菌和霍亂弧菌的雙重LAMP檢測(cè)試劑盒，包括雙重LAMP擴(kuò) 增反應(yīng)液，所述雙重LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液以總體積25yL計(jì)由以下組分混合而成：
[0023] 包括雙重LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液，所述雙重LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液以總體積25yL計(jì)由以下組分 混合而成：
[0024] 反應(yīng)緩沖液 12.5yL，內(nèi)引物ompw-FIP lyL，內(nèi)引物ompw-BIP lyL，內(nèi)引物toxR-FIP lyL，內(nèi)引物toxR-BIP lyL，外引物ompw-F3 0.125yL，外引物ompw-B3 0.125yL，外引物 toxR_F3 0.125yL，外引物toxR_B3 0.125yL，環(huán)引物ompw-LF 0.5yL，環(huán)引物ompw-LB 0·5μ L，環(huán)引物toxR-LF 0.5yL，環(huán)引物toxR-LB 0.5yL，Bst DNA聚合酶lyL，鈣黃綠素 lyL，DNA模 板 2yL，ddH20 余量。
[0025] 本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒中包含熒光試劑，可實(shí)現(xiàn)熒光可視化檢測(cè)，更快速直觀。
[0026] 作為優(yōu)選，所述反應(yīng)緩沖液各組分如下：20mmol/L Tris-HCl (pH8.8)，6.5mmol/L MgS04, lOmmol/L KC1，10mmol/L(NH4)2S〇4,0 · 1 %Triton X-100，1 · 6mol/L甜菜喊，1.4mmo1 / L dNTPs，ddH20余量。
[0027] 作為優(yōu)選，內(nèi)引物ompw-FIP、內(nèi)引物ompw-BIP、內(nèi)引物toxR-FIP及內(nèi)引物toxR-BIP 的濃度均為20ymol/L。
[0028] 作為優(yōu)選，外引物ompw_F3、外引物ompw_B3、外引物toxR_F3及外引物toxR_B3的濃 度均為20ymol/L。
[0029] 作為優(yōu)選，環(huán)引物ompw-LF、環(huán)引物ompw-LB、環(huán)引物toxR-LF及環(huán)引物toxR-LB的濃 度均為20ymol/L。
[0030] 作為優(yōu)選，所述Bst DNA聚合酶的濃度為8U/yL。
[0031] 作為優(yōu)選，所述鈣黃綠素的濃度為25ymol/L。
[0032] 一種水產(chǎn)品中副溶血性弧菌和霍亂弧菌的雙重LAMP檢測(cè)方法，提取樣品DNA，將樣 品DNA作為模板放入雙重LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液中進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，反應(yīng)時(shí)間60min，反應(yīng)溫度61°C， 反應(yīng)結(jié)束后72°C滅活5min。在61°C，反應(yīng)60min條件下引物的擴(kuò)增值最高，擴(kuò)增效果最好。 [0033]本發(fā)明的有益效果是：
[0034] 1、引物之間的干擾小，非特異性擴(kuò)增反應(yīng)少，保證了檢測(cè)的靈敏度與特異性，既提 高檢測(cè)速度降又降低了檢驗(yàn)成本。
[0035] 2、與常規(guī)LAMP相比，本發(fā)明的雙重LAMP不但保持了較高的特異性和敏感性，而且 更加方便、快捷和經(jīng)濟(jì)，一次反應(yīng)可檢測(cè)兩個(gè)致病菌。
【附圖說明】
[0036]圖1是不同菌種的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物特異性檢測(cè)的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0037] 圖中：M.Marker DL2000; 1 ·黃色葡萄球菌；2 ·單增李斯特菌;3 ·哈維氏弧菌;4 ·創(chuàng) 傷弧菌；5.鰻弧菌;6.霍亂弧菌；7.副溶血弧菌，8.霍亂弧菌和副溶血弧菌DNA混合模板(霍 亂弧菌DNA模板lyL+副溶血性弧菌DNA模板lyL)。
[0038]圖2是不同濃度DNA模板的LAMP擴(kuò)增曲線圖；
[0039] 圖中：1.DNA稀釋液 10-S2.DNA稀釋液 10-2;3.DNA稀釋液 10-3;4.DNA稀釋液 10一4; 5. DNA 稀釋液 10-5; 6. DNA 稀釋液 10-6; 7. DNA 稀釋液 10-7; 8. DNA 稀釋液 10-8。
[0040] 圖3是不同濃度DNA模板的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物靈敏度檢測(cè)的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0041 ]圖中：M:Marker DL 2000;1.DNA稀釋液 10-S2.DNA稀釋液 10-2;3.DNA稀釋液 10-3; 4 · DNA 稀釋液 10-4; 5 · DNA 稀釋液 10-5; 6 · DNA 稀釋液 10-6; 7 · DNA 稀釋液 10-7; 8 · DNA 稀釋液 10-8。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 下面通過具體實(shí)施例，并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。
[0043] 本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本領(lǐng)域常用的。 下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0044] 實(shí)施例：
[0045] -種水產(chǎn)品中副溶血性弧菌和霍亂弧菌的雙重LAMP檢測(cè)試劑盒，包括雙重LAMP擴(kuò) 增反應(yīng)液，所述雙重LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液以總體積25yL計(jì)由以下組分混合而成：
[0046] 反應(yīng)緩沖液12.5yL，濃度20ymol/L的內(nèi)引物ompw-FIP lyL，濃度20ymol/L的內(nèi)引 物ompw-BIP lyL，濃度20ymol/L的內(nèi)引物toxR-FIP lyL，濃度20ymol/L的內(nèi)引物toxR-BIP lyL，濃度20μπιο 1/L的外引物ompw-F3 0 · 125yL，濃度20ymo 1/L的外引物ompw-B3 0 · 125yL， 濃度20ymol/L的外引物toxR-F3 0.125yL，濃度20ymol/L的外引物toxR-B3 0.125yL，濃度 20ymol/L的環(huán)引物ompw-LF 0 · 5yL，濃度20ymol/L的環(huán)引物ompw-LB 0 · 5yL，濃度20ymol/L 的環(huán)引物toxR-LF 0.5yL，濃度20ymol/L的環(huán)引物toxR-LB 0.5yL，濃度8U/yL的Bst DNA聚 合酶(市售）lyL，濃度為25μπιο 1/L的鈣黃綠素 lyL，DNA模板2yL，ddH20余量。
[0047] 所述反應(yīng)緩沖液各組分如下：20mmol/L Tris-HCl，6.5mmol/L MgS04,10mmol/L KC1，10mmol/L(NH4)2S〇4,0 · 1 % (體積分?jǐn)?shù)）Triton X-100，1 · 6mol/L甜菜喊，1 · 4mmol/L dNTPs，ddH20 余量。
[0048] 1、引物設(shè)計(jì)
[0049] 通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分析副溶血性弧菌的toxR(SEQ ID化.14)和霍亂弧菌的〇111?￥ (SEQ ID No. 13)種特異性基因，分別在其保守區(qū)設(shè)計(jì)引物。利用Primer premier 5.0軟件 設(shè)計(jì)針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物并合成，引物合成委托生物公司完成。
[0050] 霍亂弧菌LAMP引物序列見表1