一種需鈉弧菌發(fā)酵生產(chǎn)瓊膠酶的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及發(fā)酵的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種需鈉弧菌發(fā)酵生產(chǎn)瓊膠酶的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002]瓊膠是由瓊脂糖和瓊脂膠組成的海藻多糖，在生化、臨床、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域應用廣泛。瓊膠寡糖是由瓊膠降解而得，具有抗氧化、減緩淀粉水解、易于人體吸收等藥理作用和生物活性，相比瓊膠具有更廣泛的應用價值。
[0003]目前，瓊膠寡糖一般通過傳統(tǒng)的化學和物理降解的方法獲得，但是傳統(tǒng)方法制備瓊膠寡糖存在著反應條件難控制、降解產(chǎn)物不均一、損耗多、污染環(huán)境等問題，而酶法具有高效、特異、反應條件溫和、降解過程易于控制，而且對環(huán)境污染少等優(yōu)點。因此，瓊膠酶酶解瓊膠將逐漸取代傳統(tǒng)的化學等降解方法成為制備瓊膠寡糖的最佳方法。
[0004]我國擁有遼闊的海域，海洋中豐富的海藻資源為生產(chǎn)研宄提供了充足海藻多糖。由于瓊膠酶的主要來源是海洋微生物，海洋環(huán)境的特殊性導致了瓊膠酶的穩(wěn)定性不好或者活力不高，限制了其在生產(chǎn)中的應用。有鑒于此，本發(fā)明人研宄和設(shè)計了一種需鈉弧菌發(fā)酵生產(chǎn)瓊脂酶的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法，本案由此產(chǎn)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種需鈉弧菌發(fā)酵生產(chǎn)瓊膠酶的培養(yǎng)基，利用一株能降解瓊膠的需鈉弧菌(Vibr1 sp.natriegens)(來源于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，保藏編號:CICC 23820)，在采用本發(fā)明的培養(yǎng)基后，可以有效提高需鈉弧菌發(fā)酵生產(chǎn)瓊膠酶的單位產(chǎn)量。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供利用上述培養(yǎng)基進行需鈉弧菌發(fā)酵瓊膠酶的方法，通過種子活化、搖瓶發(fā)酵、罐上發(fā)酵及中試放大發(fā)酵的逐級放大培養(yǎng)步驟，確定最佳的發(fā)酵條件，進而提高最終發(fā)酵液中瓊膠酶的單位產(chǎn)量。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題的技術(shù)方案是:
一種需鈉弧菌發(fā)酵生產(chǎn)瓊膠酶的培養(yǎng)基，包括菌種活化培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基;
所述菌種活化培養(yǎng)基為:瓊脂20g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，NaCl 30 g/L,MgSO4*7H20 5 g/L, KCl I g/L, CaCl2 0.2 g/L, K2HPO4 0.1 g/L, FeSO4.7Η20 0.02 g/L, pH7.5，121°C 滅菌 20 min ；
所述種子培養(yǎng)基為:蛋白胨5 g/L，酵母膏I g/L,NaCl 30 g/L,MgSO4-7H20 5 g/L,KCl
Ig/L，CaCl2 0.2 g/L，K2HPO4 0.1 g/L，F(xiàn)eS04.7H20 0.02 g/L, pH 7.5，121°C滅菌 20 min ；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為:瓊脂3.4 g/L，酵母膏 6.5 g/L, NaCl 20 g/L, MgSO4-7H20 5 g/L,KCl I g/L, CaCl2 0.2 g/L, K2HPO4 0.1 g/L, FeSO4.7Η20 0.02 g/L, pH 7.5，121°C滅菌 20min0
[0008]本發(fā)明還涉及所述需鈉弧菌利用如上所述培養(yǎng)基生產(chǎn)瓊膠酶的發(fā)酵方法，包括以下步驟:
種子的活化與制備:將上述需鈉弧菌菌種接至菌種活化培養(yǎng)基中活化，活化的菌種接種至裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中培養(yǎng)，獲得搖瓶種子液；
搖瓶發(fā)酵:搖瓶種子液接種至裝有適用于需鈉弧菌產(chǎn)瓊脂酶發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶之中，25°C培養(yǎng)24 h，獲得含有瓊膠酶的發(fā)酵液；
罐上發(fā)酵:搖瓶種子液接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的7 L發(fā)酵罐中，27°C培養(yǎng)36h，獲得含有瓊膠酶的發(fā)酵液；
中試放大發(fā)酵:搖瓶種子液接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的20 L和200 L發(fā)酵罐中，27°C培養(yǎng)36h，獲得含有瓊膠酶的發(fā)酵液。
[0009]作為實施例的優(yōu)選方式，所述種子的活化與制備步驟，將_20°C保藏的甘油管菌種解凍后接于裝有菌種培養(yǎng)基的試管斜面，25°C培養(yǎng)24 h，獲得活化的需鈉弧菌菌種，然后從試管斜面上挑取培養(yǎng)好的菌種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，25°C，180 r/min發(fā)酵24 h，再接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，25°C，180 r/min發(fā)酵12 h，獲得搖瓶種子液。
[0010]作為實施例的優(yōu)選方式，所述搖瓶發(fā)酵，將培養(yǎng)好的搖瓶種子液以2%的接種量接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，25°C，180 r/min發(fā)酵24 h。
[0011]作為實施例的優(yōu)選方式，所述罐上發(fā)酵，將培養(yǎng)好的搖瓶種子液按照2%的接種量接入裝有5 L發(fā)酵培養(yǎng)基的7 L發(fā)酵罐中，27 °C，500 r/min發(fā)酵36 h。
[0012]作為實施例的優(yōu)選方式，所述中試放大發(fā)酵，將培養(yǎng)好的種子按照2%的接種量接入裝有10 L發(fā)酵培養(yǎng)基的20 L罐中，27°C，150 r/min發(fā)酵36 h。
[0013]作為實施例的優(yōu)選方式，所述中試放大發(fā)酵，將培養(yǎng)好的種子按照2%的接種量接入裝有5 L種子培養(yǎng)基的7 L罐中，25°C發(fā)酵12 h，培養(yǎng)好的種子液按照2%的接種量接入裝有100 L發(fā)酵培養(yǎng)基的200 L罐中，27°C，100 r/min發(fā)酵36 h。
[0014]本發(fā)明采用上述技術(shù)方案后，在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上，對本發(fā)明人所篩選的需鈉弧菌進行了發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)，分別進行了發(fā)酵條件優(yōu)化以及補料工藝的探宄，研宄其在發(fā)酵罐中的產(chǎn)酶規(guī)律，有效提高了瓊膠酶產(chǎn)量。最后對需鈉弧菌發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶進行了中試放大試驗，為今后的大規(guī)模生產(chǎn)提供了重要的技術(shù)參數(shù)指導。
【附圖說明】
[0015]圖1需鈉弧菌培養(yǎng)平板；
圖2需鈉弧菌產(chǎn)瓊膠酶的罐上發(fā)酵曲線；
圖3需鈉弧菌產(chǎn)瓊膠酶的20L罐上發(fā)酵曲線；
圖4需鈉弧菌產(chǎn)瓊膠酶的200L罐上發(fā)酵曲線。
【具體實施方式】
[0016]下列實施例中采用的檢測方法:
生物量的測定:均勾吸取1.0 ml發(fā)酵液，12000 r/min離心10 min，去掉上清液后用蒸餾水梯度稀釋至6倍，以蒸餾水作空白，600 nm波長測吸光值。
[0017]瓊膠酶活力的測定:均勻取1.0mL發(fā)酵液，12000 r/min離心lOmin，準確吸取
0.3mL 上清液，用 50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH 7.0)稀釋 4 倍，取 50 μ? 稀釋液，添加350 μ?溶于50 mmol /L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH 7.0)的0.5%的瓊脂(高溫溶解后保溫于40°C水浴中)，40°C溫浴20 min，加0.6 mL DNS終止反應，沸水浴5 min后冷卻，稀釋到5 mL，測540 nm處的吸光值，然后依據(jù)標準曲線來計算反應液中還原糖的生成量，以檢測發(fā)酵液中瓊膠酶的活力。以沸水浴滅活5 min的酶液作為對照。以上述條件下I min催化產(chǎn)生I ymol還原糖所需的酶量為一個酶活力單位(U)。
[0018]pH值測定:利用pH計檢測發(fā)酵過程的pH值。
[0019]實施例1:需鈉弧菌的篩選
本發(fā)明首先在紅樹林泥土樣品中分離得到了一株能降解瓊膠的需鈉弧菌(Vibr1 sp.)(中國工業(yè)微生物菌種保藏編號:CICC 23820)，再采用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)后，可以有效提高需鈉弧菌發(fā)酵生產(chǎn)瓊膠酶的單位產(chǎn)量。
[0020](I)取樣品紅樹林泥土 25g于225mL無菌人工海水中進行梯度稀釋，取稀釋液于以瓊脂為單一碳源的平板培養(yǎng)基中進行涂布，平板于25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h?36h。
[0021](2)挑選平板培養(yǎng)基上形成凹陷較深的菌落，如圖1所示，轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)24?36h，接種于人工海水培養(yǎng)基培養(yǎng)24?36h后，測定發(fā)酵液的瓊膠酶活力，最終篩選獲得酶活最高的菌株需鈉弧菌。
[0022]實施例2:需鈉弧菌的搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)瓊膠酶
(1)將_20°C保藏的甘油管菌種解凍后接于裝有菌種活化培養(yǎng)基的試管斜面，斜面于25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，獲得活化的需鈉弧菌菌種。所述菌種活化培養(yǎng)基為:瓊脂20g/L，蛋白胨 5g/L，酵母膏 5g/L，NaCl 30 g/L, MgSO4*7H20 5 g/L, KCl I g/L, CaCl2 0.2 g/L,K2HPO4 0.1 g/L, FeSO4.7Η20 0.02 g/L, pH 7.5，121°C滅菌 20 min ；
(2)從試管斜面上挑取培養(yǎng)好的菌種于裝有30mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，25°C，180 r/min發(fā)酵24 h，再接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，25°C，180 r/min發(fā)酵12 h，獲得搖瓶種子液。所述種子培養(yǎng)基為:蛋白胨5 g/L，酵母膏I g/L，NaCl 30 g/L,MgSO4*7H20 5 g/L, KCl I g/L, CaCl2 0.2 g/L, K2HPO4 0.1 g/L, FeSO4.7Η20 0.02 g/L, pH7.5，121°C 滅菌 20 min ；
(3)將培養(yǎng)好的搖瓶種子液以2%的接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，25°C，180 r/min發(fā)酵24 h，得到含瓊膠酶的發(fā)酵液。所述發(fā)酵培養(yǎng)基為:瓊脂3.4 g/L，酵母膏 6.5 g/L, NaCl 20 g/L，MgSO4.7Η20 5 g/L, KCl I g/L, CaCl2 0.2 g/L, K2HPO4 0.1g/L, FeSO4.7Η20 0.02 g/L, pH 7.5，121°C滅菌 20 min ；
(4)均勻取1.0mL含瓊膠酶發(fā)酵液，12000 r/min離心lOmin，測定所得清液的瓊膠酶活力為2.51 U/mL。
[0023]實施例3:需鈉弧菌的罐上發(fā)酵生產(chǎn)瓊膠酶
(1)將_20°C保藏的甘油管菌種解凍后接于裝有菌種活化培養(yǎng)基的試管斜面，斜面于25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，獲得活化的需鈉弧菌菌種。所述菌種活化培養(yǎng)基為:瓊脂20g/L，蛋白胨 5g/L，酵母膏 5g/L，NaCl 30 g/L, MgSO4*7H20 5 g/L, KCl I g/L, CaCl2 0.2 g/L,K2HPO4 0.1 g/L, FeSO4.7Η20 0.02 g/L, pH 7.5，121°C滅菌 20 min ；
(2)從試管斜面上挑取培養(yǎng)好的菌種于裝有30mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，25°C，180 r/min發(fā)酵24 h，再接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，25°C，180 r/min發(fā)酵12