一種從山胡桃根中提取生物堿的制備方法及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于天然植物提取分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從山胡桃根中提取生物堿 的制備方法及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 樟科Lauraceae山胡椒屬Lindera Thunb.植物全世界約有100種，分布于亞洲、北 美溫?zé)釒У貐^(qū)。我國有40種9變種2變型。山胡椒屬是我國樟科中種類較多，分布較廣的屬之 一。山胡椒Lindera glauca (Siebold & Zucc·) Blume，生于海拔900米左右以下山坡、林 緣、路旁。在我國的山東昆崳山以南、河南嵩縣以南，陜西鄖縣以南以及甘肅、山西、江蘇、安 徽、浙江、江西、福建、臺(tái)灣、廣東、廣西、湖北、湖南、四川等省區(qū)分布較廣。木材可作家具； 葉、果皮可提芳香油;種仁油含月桂酸，油可作肥皂和潤滑油;根、枝、葉、果藥用；葉可溫中 散寒、破氣化滯、祛風(fēng)消腫;根治勞傷脫力、水濕浮腫、四肢酸麻、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷； 果實(shí)治胃痛。
[0003] 針對(duì)山胡椒生物堿類成分分離鑒定工作較多，但是針對(duì)該植物中分離得到的生物 堿抗腫瘤活性研究較少，僅見對(duì)山胡椒抗腫瘤轉(zhuǎn)移化學(xué)成分進(jìn)行了報(bào)道，但對(duì)其活性成分 的深入研究，特別是對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株增殖的抑制活性研究，尚未見有報(bào)道。
[0004] 因此，選擇適宜的提取方法制備山胡椒總生物堿，并對(duì)總生物堿中的單體化合物 進(jìn)行分離純化研究，尋找具有抗腫瘤活性的單體化合物，對(duì)合理開發(fā)利用山胡椒資源具有 有重要意義。但是，現(xiàn)有的針對(duì)山胡椒總生物堿提取純化技術(shù)工藝主要存在以下不足之處： (1)使用高濃度醇溶液作為提取介質(zhì)，成本較高，提取不夠完全;而采用水作提取介質(zhì)，雖然 經(jīng)濟(jì)，但提取有效成分的效率低，山胡椒根中生物堿類有效成分難以有效浸出。（2)傳統(tǒng)提 取方法如煎煮、回流、浸漬等，提取過程涉及到加熱處理或者耗時(shí)太長，并且提取液過濾處 理步驟多，收率也不理想。結(jié)合以上兩點(diǎn)，本發(fā)明采用酸性醇水溶液作為提取溶劑，反復(fù)回 收利用提取，能顯著提高提取效率。并采用滲漉提取，浸出液可以達(dá)到較高濃度，浸出效果 較好。此法常溫操作不需加熱，溶劑用量少，過濾要求較低，使分離操作過程簡化。且提取物 含雜質(zhì)少、提取率高、使用溶劑量少，同時(shí)節(jié)約溶劑，降低成本。
[0005] 本發(fā)明為得到純度、收率較高的生物堿總提物。在有機(jī)溶劑的選擇方面不斷優(yōu)化 有機(jī)溶劑的用量和配比。并且，本發(fā)明采用有機(jī)溶劑萃取作為初步純化手段，具有操作方 便、易于放大和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明目的在于在提供一種從山胡桃根中提取生物 堿的制備方法及其用途。
[0007] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)： 所述的一種從山胡椒根中提取生物堿的制備方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 原料處理:取山胡椒根陰干至含水量為3-8%后，粉碎，過20-80目篩，得粗粉，備用； 2) 酸性醇水溶液溶液滲漉提取:取步驟1)制得的粗粉，裝入滲漉筒中，加1-2倍量的PH 值1-2的酸性醇水溶液，其中醇的濃度為30%-80%，浸潤3-6小時(shí)后裝入滲漉桶中，用10-18 倍量上述酸性醇水溶液溶液進(jìn)行滲漉提取，調(diào)節(jié)流速，以10_20mL/min流速收集滲漉提取液 至山胡椒根粗粉中的生物堿浸提干凈為止;采用薄層層析法，在254nm下顯棕黑色斑點(diǎn)，碘 化鉍鉀溶液顯橘黃色，所得提取液中加入堿水調(diào)節(jié)PH值至9-10,然后加入有機(jī)溶劑萃取2-6 次，制得萃取液;所述提取液與有機(jī)溶劑的體積比為1:1-3;其中色譜條件為用GF254熒光硅 膠為載體，制備薄層色譜板，以氯仿：甲醇=6:1為展開劑，在254nm紫外光燈下顯色觀察； 3) 將步驟2)制得的萃取液，于水浴溫度40-55°C，真空度為0.09-0.1 Mpa的條件下進(jìn)行 減壓濃縮，濃縮至濃縮液的濃度為0.5-1. Og/ml，制得山胡椒根總生物堿提取物濃縮液； 4) 將步驟3)制得的山胡椒根總生物堿提取物濃縮液過硅膠柱色譜，用氯仿-甲醇體積 比10 :1-0:1梯度洗脫，收集洗脫液，洗脫液經(jīng)薄層色譜檢測，合并相同組分，得A-E共5個(gè)組 分，進(jìn)行抗腫瘤活性追蹤，B、C組分抗腫瘤活性較好； 5) 對(duì)B組分，經(jīng)反相柱色譜，用20-100%的甲醇-水梯度洗脫，洗脫液經(jīng)薄層色譜檢測，合 并相同組分，回收洗脫液得B1-B4共4個(gè)組分； 6) 將步驟5)制得的B2組分過硅膠柱，用氯仿-甲醇進(jìn)行純化，得棕黃色化合物1和化合 物2; 7) 將步驟4)制得的C組分，經(jīng)反相柱色譜，用30-100%的甲醇-水梯度洗脫，洗脫液經(jīng)薄 層色譜檢測，合并相同組分，回收溶劑得C1-C8共8個(gè)組分； 8) 將步驟7)制得的C4組分過凝膠柱，用30-100%的甲醇-水純化，得棕黃色化合物3; 所述化合物1為N-甲基樟蒼堿，其結(jié)構(gòu)式為：
所述化合物2為樟蒼堿，其結(jié)構(gòu)式為：
所述化合物3為(+)_Boldine，其結(jié)構(gòu)式為：
[0008] 所述的一種從山胡椒根中提取生物堿的制備方法，其特征在于步驟2)中酸性醇水 溶液為濃度為〇. 5-2%的醋酸、鹽酸、硫酸或酒石酸中的任一種。
[0009] 所述的一種從山胡椒根中提取生物堿的制備方法，其特征在于步驟2)中堿水為飽 和的碳酸鈉溶液或15-25%的氨水。
[0010] 所述的一種從山胡椒根中提取生物堿的制備方法，其特征在于步驟2)中有機(jī)溶劑 為乙酸乙酯、乙醚、丙酮、正丁醇、氯仿或二氯甲烷中的一種或幾種混合。
[0011] 所述的一種從山胡桃根中提取生物堿的制備方法，其特征在于步驟4)中氯仿-甲 醇的體積比依次為10: 1、8:1、6:1、4:1、2:1、0:1進(jìn)行梯度洗脫。
[0012] 所述的一種從山胡桃根中提取生物堿的制備方法，其特征在于步驟5)中依次用 20%的甲醇-水、40%的甲醇-水、60%的甲醇-水、80%的甲醇-水、100%的甲醇依次梯度洗脫。
[0013] 所述的一種從山胡桃根中提取生物堿的制備方法，其特征在于步驟6)中氯仿-甲 醇的體積比為8:1。
[0014] 所述的一種從山胡桃根中提取生物堿的制備方法，其特征在于步驟7)中先用30% 的甲醇-水洗脫，然后依次用50%的甲醇-水、70%的甲醇-水洗脫，最后用100%甲醇洗脫;步驟 8)中現(xiàn)有30%的甲醇-水純化，然后用50%的甲醇-水、70%的甲醇-水純化，最后用100%甲醇-水純化。
[0015] 所述的一種從山胡桃根中提取的生物堿在制備抗腫瘤藥物制劑中的應(yīng)用。 本發(fā)明采用低濃度醇-酸性醇水溶液作為提取溶劑，反復(fù)回收利用提取，能顯著提高提 取效率。并采用滲漉提取，浸出液可以達(dá)到較高濃度，浸出效果較好。此法常溫操作不需加 熱，溶劑用量少，過濾要求較低，使分離操作過程簡化。且提取物含雜質(zhì)少、提取率高、使用 溶劑量少。
[0016] 本發(fā)明采用有機(jī)溶劑萃取作為總生物堿初步純化手段具有萃取方便、簡單、低成 本、易放大等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)提取的山胡椒根總生物堿，采用活性導(dǎo)向分離，鑒定了山胡椒根中具 有抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性的三個(gè)生物堿類成分，尤其是化合物1具有極強(qiáng)的抑制多種腫瘤 細(xì)胞增殖活性，特別是抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29，胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞增殖活性，在高劑量 給藥情況下，甚至優(yōu)于陽性對(duì)照藥物依托泊甙VP-16。該發(fā)明采用常規(guī)的生物堿提取分離方 法，抗腫瘤活性評(píng)價(jià)方法，技術(shù)方案操作簡單，容易推廣。對(duì)于抗腫瘤先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)，抗 腫瘤新藥的開發(fā)具有重要的意義。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 通過以下具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。
[0018] 實(shí)施例1 1)原料處理:取山胡椒根600g陰干至含水量為3-8%后，粉碎，過20-80目篩，得粗粉，備 用;2)酸性醇水溶液溶液滲漉提取:取步驟1)制得的干燥粗粉，加1.5倍量的PH值1-2的酸性 醇水溶液，其中醇的濃度為50%，浸潤3-6小時(shí)后裝入滲漉桶中，用15倍量上述酸性醇水溶 液溶液進(jìn)行滲漉提取，調(diào)節(jié)流速，以10_20mL/min流速收集滲漉提取液至山胡椒根粗粉中的 生物堿浸提干凈為止;采用薄層層析法，在254nm下顯棕黑色斑點(diǎn)，碘化鉍鉀溶液顯橘黃色， 所得提取液中加入堿水調(diào)節(jié)PH值至9-10，然后加入有機(jī)溶劑萃取2-6次，制得萃取液;其中， 提取液與有機(jī)溶劑的體積比為1: 2;其中色譜條件為用GF254熒光硅膠為載體，制備薄層色 譜板，以氯仿：甲醇=6:1為展開劑，在254nm紫外光燈下顯色觀察;酸性醇水溶液為濃度為1% 的醋酸，堿水為飽和的碳酸鈉溶液，機(jī)溶劑為乙酸乙酯;3)將步驟2)制得的萃取液，于水浴 溫度48°C，真空度為0.09-0.1 Mpa的條件下進(jìn)行減壓濃縮，濃縮至濃縮液的濃度為0.8g/ml， 制得山胡椒根總生物堿提取物濃縮液;4)將山胡椒根總生物堿提取物濃縮液過硅膠柱色 譜，用氯仿-甲醇體積