一種羊肺腺瘤病毒的體外穩(wěn)定培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種病毒的體外培養(yǎng)方法，具體涉及一種羊肺腺瘤病毒的體外穩(wěn)定培 養(yǎng)方法，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 綿羊肺腺瘤（0ΡΑ)是由外源性綿羊肺腺瘤逆轉錄病毒（exJSRV)引起的綿羊、山羊 慢性、進行性、接觸傳染性肺臟腫瘤樣疾病。該病死亡率為100 %，每年給我國的養(yǎng)羊業(yè)帶來 了極大的損傷。
[0003] exJSRV屬于β-逆轉錄病毒屬，基因組全長約7. 5kbp，編碼4個相互重疊的基因 5'-gag-pr〇-pol-env-3'〇
[0004] exJSRV感染羊后，通過整合酶整合到宿主細胞基因組中長期存在。但是該病毒在 體外培養(yǎng)的細胞中不能增殖，目前仍未建立exJSRV體外培養(yǎng)體系，采用常規(guī)的病毒分離鑒 定方法也無法達到目的，當前對該病的診斷還主要依靠臨床癥狀和病理組織學檢查。
[0005] 內源性逆轉錄病毒（enJSRV)由于進化的結果，始終存在于綿羊、山羊體內，也許 由于enJSRV存在的特殊性，導致exJSRV不能誘導B細胞分泌對應的抗體進行體液免疫，不 能用常規(guī)的血清學方法進行診斷，因此特異性抗原的檢測是診斷0ΡΑ的有效方法。
[0006] 通過比較分析內源性逆轉錄病毒（enJSRV)與外源性逆轉錄病毒（exJSRV)的囊膜 蛋白（env)基因的二、三級蛋白結構，我們發(fā)現：它們核苷酸同源性為88%，高變區(qū)主要位 于囊膜蛋白（env)。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種羊肺腺瘤病毒的體外穩(wěn)定培養(yǎng)方法，該方法通過 siRNA技術讓exJSRV在體外培養(yǎng)的細胞中穩(wěn)定增殖。
[0008] 為了實現上述目標，本發(fā)明采用如下的技術方案：
[0009] -種羊肺腺瘤病毒的體外穩(wěn)定培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0010] -、分離患肺腺瘤的羊肺泡II型細胞；
[0011] 二、純化肺泡II型細胞；
[0012] 三、培養(yǎng)肺泡II型細胞；
[0013] 四、構建siRNA干擾載體；
[0014] 五、將siRNA干擾載體轉染肺泡II型細胞。
[0015] 前述的羊肺腺瘤病毒的體外穩(wěn)定培養(yǎng)方法，其特征在于，在步驟一中，分離患肺腺 瘤的羊肺泡II型細胞的方法為：
[0016] (1)將患肺腺瘤的羊麻醉，用導管從頸動脈放血，然后灌注含肝素的生理鹽水沖凈 全身血液；
[0017] ⑵打開胸腔，用分離液II經肺動脈沖洗肺部，然后取出完整的心肺，前述分離 液II為 145mmol/LNaCl+5. 7mmol/LKCl+10mMHEPES+4. 3mmol/LNa2HP04+l. 4mmol/L KH2P04+2.Ommol/LCaCl2+l. 3mmol/LMgS04,pH= 7. 2 ；
[0018] (3)向肺內灌注分離液I洗肺泡，然后再灌注分離液II洗肺泡，直至渾濁的 液體變成澄清透明，前述分離液I為145mmol/LNaCl+5. 7mmol/LKC1+4. 3mmol/L Na2HP04+l. 4mmol/LKH2P04+10mmol/LHEPES+6mmol/L葡萄糖 +0· 2mmol/LEGTA，pH= 7· 2 ;
[0019] (4)將37°C預溫的含酶消化液經氣管灌注到肺內，37°C水浴消化30min，前述含酶 消化液為分離液II+2500μg/mL胰蛋白酶+100μg/mLDNase;
[0020] (5)迅速剪碎肺組織，37°C振蕩孵育5min，加入5mL胎牛血清終止消化；
[0021] (6)用37°C預溫的分離液III稀釋消化終產物，雙層紗布過濾，濾液于4°C下， 1000r/min離心2min，棄上清，適量分離液III輕柔重懸，前述分離液III為分離液II+200μg/ mLDNase+4%胎牛血清；
[0022] (7)重懸液經100目濾網過濾，沉淀用DMEM培養(yǎng)液重懸并計數，調節(jié)濃度至 1. 0X106個/mL~1. 5X10 6個 /mL。
[0023] 前述的羊肺腺瘤病毒的體外穩(wěn)定培養(yǎng)方法，其特征在于，在步驟二中，純化肺泡II 型細胞的方法為：
[0024] (1)將細胞懸液加入IgG包被的培養(yǎng)瓶中，37°C，5%C0J?育2h，移出未黏附細 胞；
[0025] (2)將未黏附的細胞加入培養(yǎng)瓶，細胞懸液中加入磁化樹脂微粒，37°C孵育2h;
[0026] (3)以強力磁鐵于步驟⑵中的培養(yǎng)瓶外吸附吞噬有磁化樹脂微粒的巨噬細胞及 殘余的磁化樹脂微粒，重復吸附若干次，直至無磁化樹脂微粒殘留。
[0027] 前述的羊肺腺瘤病毒的體外穩(wěn)定培養(yǎng)方法，其特征在于，在步驟三中，培養(yǎng)肺泡II 型細胞的方法為：
[0028] (1)調節(jié)細胞濃度至0· 5X106個/mL;
[0029] (2)將細胞轉移至培養(yǎng)瓶中，37°C孵育，12h后換液去除未貼壁的細胞。
[0030] 前述的羊肺腺瘤病毒的體外穩(wěn)定培養(yǎng)方法，其特征在于，在步驟四中，構建siRNA 干擾載體的方法為：
[0031] (1)設計并合成1對SiRNA核苷酸，
[0032]上游：
[0033] 5?-GATCCGGCCGGTGCTTCTAGGAATATTCAAGACGTAATCCTAGGAGCACCGGCATTTTTGTCGAC k-2,
[0034]下游：
[0035] 5'-AGCTTGTCGACAAAAATGCCGGTGCTCCTAGGATTACGTCTTGAATATTCCTAGAAGCACCGGC CG-3'；
[0036] (2)確定好siRNA的核苷酸后，采用常規(guī)的分子生物學技術構建干擾載體。
[0037] 前述的羊肺腺瘤病毒的體外穩(wěn)定培養(yǎng)方法，其特征在于，在步驟五中，將siRNA干 擾載體轉染肺泡II型細胞的方法為：
[0038] (1)選取步驟三培養(yǎng)的肺泡II型細胞，用0· 25 %胰蛋白酶+0· 02%EDTA消化細胞， 在鏡下觀察到少量細胞開始漂浮時，加入完全培養(yǎng)液，吹打獲得均勻分散的細胞懸液，前述 完全培養(yǎng)液為DMEM+20%胎牛血清+100U/mL青霉素+100μg/mL鏈霉素+2mmol谷氨酰胺， pH= 7. 2 ；
[0039] (2)迅速將細胞懸液移入離心管，另外加入細胞培養(yǎng)液，離心，再以1.0X10，/ ml的濃度接著6孔板培養(yǎng)；
[0040] (3)48h時，吸出細胞培養(yǎng)液，將脂質體Lipofectamine2000和質粒用培養(yǎng)液混 勻，將其滴入培養(yǎng)孔，每孔〇. 3ml;
[0041] (4)48h后，將孔內的細胞去掉培養(yǎng)液，加入等量的不含血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng) 24h，將上清液離心用于exJSRV基因組分離；或者，將孔內的細胞半量換液，待細胞完全鋪 滿孔底壁時用〇. 25%胰蛋白酶+0. 02%EDTA消化細胞，用培養(yǎng)液離心洗滌，置于液氮內冷 凍保存。
[0042] 本發(fā)明的有益之處在于：本發(fā)明的培養(yǎng)方法通過siRNA技術讓exJSRV在體外培養(yǎng) 的細胞中穩(wěn)定增殖，解決了多年來exJSRV無法體外穩(wěn)定培養(yǎng)這樣難題；此外，由于exJSRV 在體內不能誘導B細胞分泌對應的抗體進行體液免疫，導致患病羊體內未曾檢測到exJSRV 的循環(huán)抗體，不能用常規(guī)的血清學方法進行診斷，而本發(fā)明的培養(yǎng)方法將有利于進一步從 免疫學的角度研究exJSRV，為將來開發(fā)早期診斷和治療羊肺腺瘤病的藥物和方法奠定了基 礎。
【具體實施方式】
[0043] 本發(fā)明的羊肺腺瘤病毒的體外穩(wěn)定培養(yǎng)方法，主要是通過siRNA技術讓exJSRV在 體外培養(yǎng)的細胞中穩(wěn)定增殖。
[0044] 以下結合具體實施例對本發(fā)明作具體的介紹。
[0045] 第一步、分離患肺腺瘤的羊肺泡II型細胞
[0046] 將患肺腺瘤的布爾山羊用戊巴比妥鈉（30mg/kg)麻醉，放在離地面2. 5米左右的 桌面上，用導管從頸動脈放血，然后將羊放在地面上，從導管灌注含肝素的生理鹽水沖凈全 身血液。
[0047]打開胸腔，用分離液II(145mmol/LNaCl+5. 7mmol/LKCl+10mMHEPES+4. 3mmol/L Na2HP04+l. 4mmol/LKH2P04+2·Ommol/LCaCl2+l. 3mmol/LMgS04，pH= 7· 2)經肺動脈沖洗肺 部，經氣管插管向肺內通氣至肺呈蒼白色，取出完整的心肺及氣管。
[0048]向肺內灌注分離液I(145mmol/LNaCl+5. 7mmol/LKC1+4. 3mmol/L Na2HP04+l. 4mmol/LKH2P04+10mmol/LHEPES+6mmol/L葡萄糖 +0· 2mmol/LEGTA，pH= 7. 2) 洗肺泡8次，然后再灌注分離液II洗肺泡3次以上，直至渾濁的液體變成澄清透明。
[0049] 將37°C預溫的含酶消化液（分離液II+2500μg/mL胰蛋白酶+100μg/mLDNase) 經氣管灌注到肺內，37°C水浴消化30min。
[0050] 迅速剪碎肺組織，去除結締組織及支氣管，37°C振蕩孵育5min，加入5mL胎牛血清 終止消化。
[0051] 用37°C預溫的分離液III(分離液II+200μg/mLDNase+4%胎牛血清）稀釋消化 終產物，雙層紗布過濾，濾液于4°C下，1000r/min離心2min，棄上清，適量分離液III輕柔重 懸。
[0052] 重懸液經100目濾網過濾，沉淀用DMEM培養(yǎng)液重懸并計數，調節(jié)濃度至1. 0X106 個/mL~1. 5X106個 /mL。
[0053] 第二步、純化肺泡II型細胞
[0054] 將細胞懸液（濃度1.OX106個/mL)加入IgG包被的培養(yǎng)瓶（lmg山羊IgG，充分 溶解于4mLTris緩沖液中，pH9. 3)中，37°C，5%COJ?育2h，移出未黏附細