W例 1. 3. 1菌株的紫外誘變
[0050] 將待誘變菌株-產(chǎn)航假絲酵母培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，500化/min離屯、5min，去上清 液，菌體用無(wú)菌水再次離屯、洗涂，將菌體加入到含有玻璃珠的15mL無(wú)菌生理鹽水中振蕩 20min，然后用無(wú)菌生理鹽水稀釋至108c化/mU將2血稀釋的菌液加至無(wú)菌平皿中，放入無(wú) 菌磁力攬拌子，再將平皿放在操作臺(tái)紫外燈下照射20s、40s、60s，照射后吸取菌體進(jìn)行逐級(jí) 稀釋?zhuān)⑼科桨暹M(jìn)行培養(yǎng)，挑取長(zhǎng)得快、菌落大的進(jìn)行斜面保存。
[0051]1.3. 2菌株的培養(yǎng)方法
[0052]采用上述種子培養(yǎng)基先將各試驗(yàn)菌株活化后接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，液體發(fā)酵 培養(yǎng)基中加入800μgAiL硫酸亞鐵（W鐵計(jì)），28°C搖床發(fā)酵2地，測(cè)定生物量及酵母細(xì)胞 中的鐵含量。酵母細(xì)胞中鐵含量的測(cè)定采用鄰二氮菲比色法。 陽(yáng)05引 2結(jié)果與討論
[0054] 2. 1菌株篩選 陽(yáng)化5] 產(chǎn)航假絲酵母經(jīng)過(guò)紫外線(xiàn)誘變，再經(jīng)過(guò)純化和搖瓶發(fā)酵后，4株誘變菌株的生物 量都比出發(fā)菌株（編號(hào)CK)有所提高，但菌株間富鐵能力有一定差異，結(jié)果見(jiàn)表1。其中，C-21菌株酵母細(xì)胞中的鐵含量及鐵轉(zhuǎn)化率均較出發(fā)菌株有明顯提高。根據(jù)高鐵含量、高 富集率的原則，選擇C-21號(hào)菌株為試驗(yàn)用菌株，命名為產(chǎn)航假絲酵母（Candidautilis) BLCC4-0021。
[0056] 表1菌種篩選結(jié)果
[0057]
[0058] 2. 2產(chǎn)航假絲酵母（Candidautilis)MXC4-0021的遺傳穩(wěn)定性
[0059] 將產(chǎn)航假絲酵母（Candidautilis化LCC4-0021連續(xù)斜面?zhèn)鞔?0次，并將每一代 分別接種一環(huán)于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入800yg/mL硫酸亞鐵鐵 計(jì)），28°C搖床發(fā)酵2地，測(cè)定生物量及酵母細(xì)胞中的鐵含量。同時(shí)W1代的產(chǎn)航假絲酵母 (Candidautilis)MXC4-0021 作對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表 2。
[0060] 表2產(chǎn)航假絲酵母（Candida utilis)BLCC4-00211~10代生物量及細(xì)胞中的鐵 含量
[0061]
[0062] 由表2可W看出，產(chǎn)航假絲酵母（Candidautilis)I3LCC4-0021經(jīng)過(guò)斜面?zhèn)鞔?0 次后，運(yùn)10代的生物量和酵母細(xì)胞中鐵含量均保持在較高水平，說(shuō)明該菌株是一株非常理 想的富鐵酵母產(chǎn)品生產(chǎn)用菌株。
[0063] 將上述獲得的產(chǎn)航假絲酵母（Candidautilis)MXC4-0021于2015年10月16日 保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、，其保藏編號(hào)為CCTCCN0:M2015611。
[0064] 實(shí)施例2:菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化 陽(yáng)0化]1材料與方法
[0066] 1. 1材料
[0067] 菌種：經(jīng)紫外誘變篩選得到的產(chǎn)航假絲酵母（Candidautilis)BLCC4-0021。
[0068] 試劑：硫酸亞鐵、硝酸鐵、Ξ氯化鐵、硫酸鐵、硫酸鐵錠、鹽酸徑胺、鄰二氮菲、醋酸 鋼、硝酸、高氯酸，均是分析純。
[0069] 液體發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏5g，蛋白腺lOg，葡萄糖20g，KH2P〇42g，蒸饋水1000血。 陽(yáng)070] 1. 2方法
[007U 比較不同鐵源、接種量、培養(yǎng)時(shí)間、發(fā)酵初始抑值、不同加鐵時(shí)間、通氣量對(duì)富鐵 酵母生物量及鐵含量的影響，確定合適的發(fā)酵條件。
[0072] 1. 2. 1不同鐵源對(duì)比試驗(yàn)
[0073] 在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加5種不同的鐵源，即硫酸亞鐵、硝酸鐵、Ξ氯化鐵、 硫酸鐵、硫酸鐵錠，使其鐵離子濃度為800μg/mU培養(yǎng)基初始抑值5. 0,121°C滅菌30min， 當(dāng)溫度降至28°C接種，接種量為4%，每500血Ξ角瓶裝液量為50血，于28°C、200巧m搖床 培養(yǎng)24h結(jié)束。
[0074] 1. 2. 2接種量的確定 陽(yáng)0巧]選取溫度28°C，培養(yǎng)基中的化2+濃度800μg/mU搖床轉(zhuǎn)速20化pm，培養(yǎng)時(shí)間2地， 做不同接種量的單因素試驗(yàn)。
[0076] 1. 2. 3不問(wèn)抬養(yǎng)溫度試驗(yàn) 陽(yáng)077] 在培養(yǎng)基中的化2+濃度800 μ g/mU其他培養(yǎng)條件相同的條件下，分別在23°C、 28°C、30°C、32°C下培養(yǎng)該酵母菌24h，測(cè)定酵母生物量和酵母細(xì)胞內(nèi)鐵含量。 陽(yáng)078] 1.2. 4通氣量（裝液量）試驗(yàn)
[0079] 每500血Ξ角瓶裝液量分別為25血、50血、75血、100血、125血，培養(yǎng)基中的Fe2+濃 度為800μg/mU初始抑值為5.0,接種量為2%，培養(yǎng)2地，測(cè)定酵母生物量及酵母細(xì)胞中 鐵的含量。
[0080] 1.2. 5不同加鐵時(shí)間的影響
[0081] 在其他條件相同的情況下，分別在發(fā)酵化、1化、24h往培養(yǎng)基中加入硫酸亞鐵至 濃度為800μg/mU培養(yǎng)2化后測(cè)定酵母生物量及酵母細(xì)胞中鐵的含量。
[0082] 1. 2. 6發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH的確定
[0083] 采用上述液體發(fā)酵培養(yǎng)基，加入硫酸亞鐵，化2+濃度為800μg/mU初始pH值分別 調(diào)為4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、7. 0,每500血Ξ角瓶裝液量在50血，接種量為2%，培養(yǎng) 2地，測(cè)定其生物量和酵母細(xì)胞內(nèi)的鐵含量。
[0084] 2結(jié)果與討論
[00化]2.1產(chǎn)航假絲酵母對(duì)不同鐵源的轉(zhuǎn)化結(jié)果
[0086] 產(chǎn)航假絲酵母對(duì)不同鐵源的轉(zhuǎn)化結(jié)果見(jiàn)表3。
[0087] 表3產(chǎn)航假絲酵母對(duì)不同鐵源的轉(zhuǎn)化結(jié)果
[0088]
[0090] 由表3可見(jiàn)，產(chǎn)航假絲酵母對(duì)不同鐵源的轉(zhuǎn)化能力有很大的不同，而W硫酸亞鐵 量最高，故試驗(yàn)確定硫酸亞鐵作為酵母富鐵用鐵源。
[0091] 2. 2接種量對(duì)產(chǎn)航假絲酵母生物量和酵母細(xì)胞中鐵含量的影響結(jié)果
[0092] 接種量對(duì)產(chǎn)航假絲酵母生物量和酵母細(xì)胞中鐵含量的影響結(jié)果見(jiàn)表4.
[0093] 表4接種量對(duì)產(chǎn)航假絲酵母生物量和酵母細(xì)胞中鐵含量的影響
[0094]
[0095] 從表4可見(jiàn)，接種量對(duì)鐵酵母的生物量和酵母細(xì)胞中的鐵含量有一定影響，生物 量W接種量6%最高，而酵母細(xì)胞內(nèi)鐵含量W接種量2%最高，經(jīng)比較各組數(shù)值后確定其最 適接種量為2%。
[0096] 2. 3培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)航假絲酵母生物量和酵母細(xì)胞中鐵含量的影響結(jié)果
[0097] 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)航假絲酵母生物量和酵母細(xì)胞中鐵含量的影響結(jié)果見(jiàn)表5。
[0098] 表5培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)航假絲酵母生物量和酵母細(xì)胞中鐵含量的影響
[0099]
[0100] 由表5可見(jiàn)，發(fā)酵溫度對(duì)富鐵酵母細(xì)胞內(nèi)鐵含量有較大影響。產(chǎn)航假絲酵母在 23°C發(fā)酵時(shí)，酵母細(xì)胞內(nèi)鐵含量最高，在28°C發(fā)酵時(shí)生物量最高，故可W將發(fā)酵溫度控制在 23Γ~28Γ。 陽(yáng)101] 2. 4通氣量對(duì)產(chǎn)航假絲酵母生物量和酵母細(xì)胞中鐵含量的影響結(jié)果 陽(yáng)102] 本試驗(yàn)利用不同的裝液量模擬溶解氧條件的影響。通氣量對(duì)產(chǎn)航假絲酵母生物量 和酵母細(xì)胞內(nèi)鐵含量的影響結(jié)果見(jiàn)表6。 陽(yáng)103] 表6通氣量對(duì)產(chǎn)航假絲酵母生物量和酵母細(xì)胞中鐵含量的影響 陽(yáng)104]
[0106] 由表6知，在500mLS角瓶中，裝液量大（低溶氧）有利于菌株對(duì)鐵的吸收，而裝液 量?。ǜ呷苎酰?duì)菌株生物量的提高比較明顯。綜上，在500血Ξ角瓶中，裝液量在50~75mL時(shí)酵母細(xì)胞中鐵含量較高。 陽(yáng)107] 2. 5不同加鐵時(shí)間對(duì)產(chǎn)航假絲酵母生物量和酵母細(xì)胞中鐵含量的影響結(jié)果
[010引不同加鐵時(shí)間對(duì)產(chǎn)航假絲酵母生物量和酵母細(xì)胞中鐵含量的影響見(jiàn)表7。 陽(yáng)109] 表7不同加鐵時(shí)間對(duì)產(chǎn)航假絲酵母生物量和酵母細(xì)胞中鐵含量的影響 陽(yáng)110]
陽(yáng)111] 由表7知，不同加鐵時(shí)間對(duì)酵母細(xì)胞中的鐵含量影響很大。產(chǎn)航假絲酵母的生物 量隨加鐵時(shí)間的延