利用枸杞茉莉酸代謝途徑重要酶基因提高植物抗逆性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[000。 本發(fā)明設(shè)及一種構(gòu)杞（ZjrciiWcAinease必/心化)萊莉酸生物合成途徑丙二締氧 化物合酶基因心WK、丙二締氧化物環(huán)化酶基因化;和OPDA還原酶基因心?0化釣克隆。 具體是利用構(gòu)杞萊莉酸代謝途徑重要酶基因提高植物抗逆性的方法，屬于分子生物學(xué)和生 物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物萊莉酸（jasmonicacid，JA，化學(xué)名稱為3-氧-2-(2' -戊締基）-環(huán)戊燒乙 酸）生物合成途徑為a-亞麻酸經(jīng)脂肪氧合酶（LOX)催化形成13(S)-HP0T，13(巧-HPOT 經(jīng)丙二締氧化物合成酶（Alleneoxidesynthase,A0S)催化形成不穩(wěn)定12, 13 (巧-EOT， 12, 13(巧-EOT經(jīng)丙二締氧化物環(huán)化酶（Alleneoxide巧clase，A0C)催化形成穩(wěn)定巧S, 13 S) -0PDA。再經(jīng)OPDA還原酶（OPDAreductase, 0PR，）催化形成0PC-8:0,經(jīng)過后續(xù)幾部反應(yīng) 形成萊莉酸類化合物（jiasmonicacids,Jas)。AOS和AOC的作用部位為葉綠體，OPR的作 用部位為過氧化物酶體，=種酶都是萊莉酸（jasmonicacid，JA)生物合成途徑中的關(guān)鍵中 間酶。已從番茄、馬鈴馨等中克隆得到AOS、A0C基因，已從煙草、番茄等植物克隆得到OPR 基因。丙二締氧化物合酶可W認(rèn)為是JA合成途徑中第1個特異性的酶，它催化13-HP0T合 成一種不穩(wěn)定的丙二締氧化物12,13 (巧一巧O巧Iinolenicacid。丙二締氧化物環(huán)化酶的 催化作用對于代謝流通向最后的萊莉酸產(chǎn)物至關(guān)重要。它可W環(huán)化在AOS催化反應(yīng)下成生 成的不穩(wěn)定化合物一一丙二締氧化物，生成萊莉酸產(chǎn)物的最終前體一一 12.氧-植物二締 酸（巧S，13巧-1 2-〇X〇-(l0, 15z)-phytodienoicacid)，l2-氧-植物二締酸是由AOC立 體特異性環(huán)化生成的一個具有手性光學(xué)活性的環(huán)戊締酬衍生物。AOC的催化特性比AOS嚴(yán) 格，它只識別12,13(巧-epo巧-9狂），11, 15(幻-octadecatrienoicacid作為底物，而不能 催化 1 2, 13(巧-epo巧-9 狂），ll-〇ctadecat;rienoicacid。OPDA還原酶催化OPDA的還原 反應(yīng)，最終生成 3-〇x〇-2-(2-(幻-pentenyl)-cyclopentane_l-〇ctanoicacid(0PC. 8 :0)。 在擬南芥中，確實OPR基因時，植物缺失合成JAs的功能。
[0003] 萊莉酸類化合物（jasmonates，JAs)包括萊莉酸、萊莉酸甲醋W及其它衍生物，廣 泛存在于自然界，是許植物體內(nèi)產(chǎn)生的天然化合物。大量研究表明，JAs具有廣譜的生理效 應(yīng)，它不僅調(diào)節(jié)的生長和發(fā)育，如萌發(fā)、衰老、果實成熟、根的生花粉發(fā)育和球莖的形成、卷 須的纏繞等，還參與植物對機械傷害、病害、蟲害等環(huán)境的脅迫做出防御響應(yīng)，和經(jīng)典植物 激素或植物生長調(diào)節(jié)劑相似。近年來，JAs得到了植物學(xué)家廣泛的關(guān)注，并把它們作為一類 新型的植物激素，關(guān)于運一類物質(zhì)在植物中的生理效應(yīng)及作用機理的研究也逐漸展開，尤 其是JAs作為內(nèi)源信號分子參與生物因子（如昆蟲、真菌激發(fā)子等）防御和非生物因子（如 傷害、滲透脅迫、低溫等）逆境應(yīng)答的信號傳遞研究進(jìn)展很快。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種構(gòu)杞丙二締氧化物合酶、丙二締氧化物環(huán)化酶和OPDA 還原酶基因序列。
[0005] 本發(fā)明的第二個目的是提供構(gòu)杞丙二締氧化物合酶、丙二締氧化物環(huán)化酶基因和 OPDA還原酶基因編碼的蛋白質(zhì)。
[0006] 本發(fā)明的目的還在于提供含有構(gòu)杞丙二締氧化物合酶、丙二締氧化物環(huán)化酶和 OPDA還原酶基因重組載體和宿主細(xì)胞。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的在于提供構(gòu)杞丙二締氧化物合酶、丙二締氧化物環(huán)化酶基因 和OPDA還原酶基因的用途即通過提高萊莉酸含量提高植物的抗逆性。
[0008] 本發(fā)明提供的一種構(gòu)杞丙二締氧化物環(huán)化酶基因心?^化;如序列表中SEQIDNO. 1 所示的核巧酸序列構(gòu)成；丙二締氧化物合酶基因心?^化如序列表中SEQIDNO. 2 ;0PDA還原 酶基因Z曲0/化沈QIDNO. 3所示 本發(fā)明提供了一種上述構(gòu)杞丙二締氧化物環(huán)化酶基因心?^化;丙二締氧化物合酶基因、 化'OPDA還原酶基因Z曲6腳編碼的蛋白質(zhì)，如序列表中SEQIDNO. 4、沈QIDNO. 5、沈Q IDNO. 6所不的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
[0009] 本發(fā)明提供了一種上述構(gòu)杞丙二締氧化物合酶基因心?^化；丙二締氧化物環(huán)化 酶基因化；OPDA還原酶基因心?0化重組克隆載體PMD18-T- 做、pMD18-T-Zffl4化； pMDIS-I-LmOPRo
[0010] 本發(fā)明提供了一種上述構(gòu)杞丙二締氧化物環(huán)化酶基因丙二締氧化物合酶基 因化'、心7^化；OPDA還原酶基因心?0化重組植物表達(dá)載體PCAMBIA2300-LmAOS、PCAMBIA2300- pCAMBIA230〇-LmOPR〇
[0011] 含有上述的構(gòu)杞丙二締氧化物合酶基因、心?^化'、丙二締氧化物環(huán)化酶基因 化;OPDA還原酶基因心?0/化運些重組載體包括質(zhì)粒。
[0012] 含有上述構(gòu)杞丙二締氧化物合酶基因、心化'、丙二締氧化物環(huán)化酶基因心?^化； OPDA還原酶基因心?0化完整編碼閱讀框序列的宿主細(xì)胞，如含有上述重組載體的宿主細(xì)胞 也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013] 所述的宿主細(xì)胞選自農(nóng)桿菌細(xì)胞或擬南芥細(xì)胞。
[0014] 本發(fā)明提供了一種含有化'、心?0/%基因工程菌。
[0015] 上述構(gòu)杞丙二締氧化物合酶基因化'、丙二締氧化物環(huán)化酶基因OPDA 還原酶基因心?0/礎(chǔ)勺應(yīng)用包括該心WK、心WK、心?0化基因編碼的蛋白在植物中的應(yīng)用； 本發(fā)明的技術(shù)方案具體概述如下： 本發(fā)明提供的一種構(gòu)杞丙二締氧化物合酶基因心?^化'、丙二締氧化物環(huán)化酶基因 化;OPDA還原酶基因Z曲0/化分別如序列表中SEQIDNO. 1、沈QIDNO. 2、沈QIDNO. 3 所示的核巧酸序列；還包括所示的核巧酸序列添加、取代、插入或缺失一個或多個核巧酸的 70%W上同源序列或者其等位基因及其衍生的核巧酸序列。
[0016] 本發(fā)明提供的一種構(gòu)杞丙二締氧化物合酶基因心?^化'、丙二締氧化物環(huán)化酶基因 化;OPDA還原酶基因心?6腳編碼的蛋白，分別如序列表沈QIDNO. 4、SEQIDNO. 5、SEQ IDNO. 6所示氨基酸序列。
[0017] 本發(fā)明的克隆方法由下述步驟組成： 從構(gòu)杞葉片中提取總RNA，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組的化igene序列設(shè)計上游引物A0S-BF、A0C-BF、 OPR-BF。與3' RACE試劑盒中下游Outer引物利用RACE技術(shù)擴增得到其3'端末端全長序 列；同時根據(jù)已獲得的3'端序列設(shè)計下游特異性引物，通過PCR擴增獲得LmAOS、LmAOC、 LmOPR基因的全長序列。
[0018] 本發(fā)明構(gòu)建含構(gòu)杞丙二締氧化物合酶基因心?^化'、丙二締氧化物環(huán)化酶基因 化;OPDA還原酶基因Z曲0化釣植物表達(dá)載體PCAMBIA2300- 化；pCAMBIA2300-Z/s4化； pCAMBIA23O〇-Z?0/%也下述步驟組成： 《1;構(gòu)建含有構(gòu)杞丙二締氧化物合酶基因心?^化'、丙二締氧化物環(huán)化酶基因心?^化；OPDA還原酶基因Z曲6腳釣中間載體pMD 18-T -么做、pMD 18-T -么化;pMD 18-T -Z曲仿化 設(shè)計引物對A0SP1:、A0SP2和A0CP6、A0CP7、0PRP10、0PRP11，W cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物連接于PMD18-T載體，獲得含有分別如序列表中SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、沈Q ID NO. 3所示的化'、化巧Z曲6腳基因的中間載體pMD18-T-Zffl4化'、 pUrnS-T-LmAOC^UpMD18-T-LmAOC〇
[0019] 巧構(gòu)建植物表達(dá)載體：pCAMBIA2300 化/^4化/ 0娜 設(shè)計引物對A0SP3、A0SP4, W質(zhì)粒pMDlS-T-LmAOS為模板，進(jìn)行PCR擴增，將PCR擴增 產(chǎn)物經(jīng)巧日描〇/酶切后，將大腸桿菌表達(dá)載體PCAMBIA2300經(jīng)巧日乂如巧X酶切，二 者進(jìn)行連接反應(yīng)，得到植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-Zffl4化；
[0020] 設(shè)計引物對A0CP8、A0CP9，W質(zhì)粒pMD 18-T-Zffl4化為模板，進(jìn)行PCR擴增，將PCR擴 增產(chǎn)物經(jīng)尸別巧日&7I酶切后，將大腸桿菌表達(dá)載體PCAMBIA2300經(jīng)尸別巧日&刀雙酶切， 二者進(jìn)行連接反應(yīng)，得到植物表達(dá)載體pCAMBIA23O〇-Zffi40C。
[0021] 將pMDlS-T-Z曲0/?和PCAMBIA2300- Z曲0化載體同時經(jīng)BamHI和Sail酶切，然后 將目的片段連接轉(zhuǎn)化，得到植物表達(dá)載體PCAMBIA2300-心?0/化
[0022] 本發(fā)明通過提取新鮮構(gòu)杞葉片總RNA，通過3' RACE技術(shù)克隆構(gòu)杞丙二締氧 化物合酶基因心化；丙二締氧化物環(huán)化酶基因化;和OPDA還原酶基因心?0/化得 到完整的編碼基因序列分別為1533bp、744bp、1203bp。構(gòu)建了雙元植物表達(dá)載體 pCAMBIA2300-Lffi4化；pCAMBIA2300-Lffi4化；PCAMBIA2300-心?0/化電擊法將載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 C58細(xì)胞，用運種細(xì)胞轉(zhuǎn)化擬南芥，得到轉(zhuǎn)基因擬南芥，用于后續(xù)有關(guān)抗逆性等的研究，特別 是通過提高萊莉酸含量可W提高植物的抗逆性。
【附圖說明】
[002引圖1盛因全長電泳圖。
[0024]圖2 : Z皿4化基因全長電泳圖。
[00巧]圖3 : Z曲0化基因全長電泳圖。
[0026]圖 4 : pMD18-T-ZaW?5載體示意圖。
[0027] 圖5 :pMD18-T-Z曲^化載體示意圖。
[0028] 圖6 :pMD18-T-Z曲6腳載體示意圖。
[0029] 圖7 :pCAMBIA2300-Z皿4化載體示意圖。
[0030] 圖8 :pCAMBIA2300-Z皿4化載體示意圖。
[0031] 圖9 :pCAMBIA2300-Z曲6腳載體示意圖。
[003引圖10 :轉(zhuǎn)盛因擬南芥基因組PCR驗證結(jié)果。
[003引圖11 :轉(zhuǎn)Z曲W盛因擬南芥基因組PCR驗證結(jié)果。
[0034]圖12 :轉(zhuǎn)心?0化基因擬南芥基因組PCR驗證結(jié)果。
[003引圖13:提高擬南芥抗逆性驗證結(jié)果，白色代表AOS基因，虛線代表AOC基因，黑色 代表OPR基因。
[0036] 圖14 :擬南芥受傷處理后=種基因表達(dá)隨時間變化；白色代表AOS基因，虛線代表 AOC基因，黑色代表OPR基因。
[0037] 圖15:擬南芥4°C低溫處理后立種基因表達(dá)隨時間變化，白色代表AOS基因，虛線 代表AOC基因，黑色代表OPR基因。
【具體實施方式】
[0038] 實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件W及手冊中所述的條 件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0039] 實施例1 構(gòu)杞丙二締氧化物環(huán)化酶基因心?^化前克隆：