大腸桿菌漆酶突變體及其編碼基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及漆酶突變體，尤其設及大腸桿菌漆酶的突變體，本發(fā)明還設及所述漆 酶突變體的應用，屬于大腸桿菌漆酶的突變體領域。
【背景技術】
[0002] 漆酶化accase，苯二醇：氧氧化還原酶，EC1. 10. 3. 2)是一種含銅的多酪氧化 酶，和植物中的抗壞血酸氧化酶、哺乳動物的血漿銅藍蛋白同屬藍色多銅氧化酶化lue multicopperoxidase)家族。漆酶最早發(fā)現(xiàn)于日本漆樹煙1USvenicifera)的汁液中，后來 證實，漆酶除了存在于植物中，還更廣泛地存在于真菌（尤其是白腐真菌）和細菌中。由于 漆酶具有特殊的催化性能和寬泛的作用底物，其在生物制漿，生物漂白W及有毒化合物的 降解等方面具有潛在應用價值，因而成為環(huán)境保護用酶研究的熱點。
[0003] 漆酶按其來源主要分為漆樹漆酶、真菌漆酶和細菌漆酶Ξ大類。由于漆酶來源很 多，不同來源的漆酶在結構和性質方面存在一定差別，因此不同來源的漆酶表現(xiàn)出來的催 化特性相差較大。即便是同一來源，如同一白腐菌菌種，可分泌出不同性質的漆酶組分，其 催化氧化作用也各不相同。
[0004] 大腸桿菌漆酶化eO蛋白在大腸桿菌中由長155化P的一段基因編碼（cueo基因， 又名化cK基因），全長516個氨基酸，其中1-28個氨基酸為信號膚區(qū)段（大腸桿菌漆酶 (化eO)的結構與功能研究，李旭，中國科學技術大學，博±學位論文，2006.)。但是野生型大 腸桿菌漆酶的催化效率較低，限制了其在造紙、食品或環(huán)保等行業(yè)中的應用。因此，開發(fā)催 化效率更高的大腸桿菌漆酶突變體，將具有重要的市場價值和應用前景。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種大腸桿菌漆酶突變體，該突變體的酶活高 于野生型大腸桿菌漆酶（化eO);
[0006] 本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是將所述大腸桿菌漆酶突變體應用于造紙、紡 織、環(huán)?；蜥t(yī)用傳感器、洗涂劑、食品、飲料或化妝品工業(yè)等領域。
[0007] 為解決上述技術問題，本發(fā)明所采取的技術方案是：
[0008] 本發(fā)明首先公開了一種大腸桿菌漆酶突變體，所述突變體是將野生型大腸桿菌漆 酶的第276位的甘氨酸（G)突變?yōu)楣劝彼崆?、酪氨酸燈)、天冬酷胺（腳或精氨酸（時中 的任意一種。
[0009] 根據(jù)側鏈基團的極性進行分類，甘氨酸似、谷氨酸巧)、酪氨酸燈)、天冬酷胺（腳 和精氨酸（時均屬于極性氨基酸（親水氨基酸）；其中，甘氨酸佑)、酪氨酸燈）和天冬酷胺 (腳為極性不帶電荷的氨基酸；精氨酸（時為極性帶正電荷的氨基酸（堿性氨基酸）；谷氨 酸巧）為極性帶負電荷的氨基酸（酸性氨基酸）。
[0010] 其中，所述野生型大腸桿菌漆酶的氨基酸序列為SEQIDNO. 3所示；其編碼基因的 核巧酸序列為SEQIDNO. 4所示。
[0011] 本發(fā)明優(yōu)選將野生型大腸桿菌漆酶的第276位的甘氨酸（G)突變?yōu)榫彼幔≧)獲 得的大腸桿菌漆酶突變體，其氨基酸序列為SEQIDNO. 1所示。
[0012] 本發(fā)明還公開了編碼所述大腸桿菌漆酶突變體的基因；優(yōu)選的，編碼SEQIDNO. 1 所示氨基酸序列的基因的核巧酸序列為SEQIDNO. 2所示。
[0013] 本發(fā)明提取±壤宏基因組并設計引物擴增大腸桿菌漆酶基因cueo,克隆獲得了大 腸桿菌漆酶突變體G276R。該突變體與野生型大腸桿菌漆酶（化eO)相比在只有一個氨基酸 的差異，在G276位突變?yōu)镽。本發(fā)明通過對大腸桿菌漆酶突變體G276R進行蛋白質性質的 測定，結果表明，突變體G276R的最適溫度為60°C，最適抑為3. 5 (野生型大腸桿菌漆酶的 最適條件為70°C，P冊.5)，且突變體G276R的反應抑范圍較野生型寬。突變體G276R的Tm 值為76. 2°C;從酶的動力學參數(shù)看，突變體G276R與底物的親和能力更強，總體來看突變體 的酶學性質要優(yōu)于野生型。
[0014]本發(fā)明進一步將野生型大腸桿菌漆酶的G276突變?yōu)槠渌被?，比較不同突 變體的酶活。結果發(fā)現(xiàn)，G276突變?yōu)镋、Y、N或R的酶活較好，在最適條件下，突變體 G276E化.5抓/mg)，G276Y化.52U/mg)，G276N化.3抓/mg)的酶活基本上都是野生型的1. 5 倍，而G276R(12. 5抓/mg)的酶活約是野生型（4. 38U/mg)的3倍。因此，突變體G276R是該 位的最優(yōu)選擇。
[0015]本發(fā)明進一步公開了含有所述大腸桿菌漆酶突變體的編碼基因的重組表達載體W及含有所述重組表達載體的重組宿主細胞。
[0016]本發(fā)明還公開了一種制備所述大腸桿菌漆酶突變體的方法，包括W下步驟：（1) 構建含有所述大腸桿菌漆酶突變體的編碼基因的重組表達載體，轉化宿主細胞；(2)誘導 表達大腸桿菌漆酶突變體，分離純化，即得。
[0017]將本發(fā)明所述的大腸桿菌漆酶突變體的編碼基因可操作的與表達調控元件相連 接，得到可W在宿主細胞中表達該編碼基因的重組表達載體。所述表達調控元件可W包括 由5'端非編碼區(qū)和3'非編碼區(qū)，其中，所述的5'端非編碼區(qū)可W包括啟動子序列、增強 子序列或/和翻譯增強序列；所述的3'非編碼區(qū)可W包含終止子序列、mRNA切割序列等。 轉化方案可視用于轉化的宿主細胞的類型而變化。將所述多核巧酸引入宿主細胞的合適方 法包括：電轉化法、原生質體法、化學轉化法等，運些操作方法通常為本領域所了解。所述宿 主細胞可為原核細胞或真核細胞，包括但不限于大腸桿菌或酵母菌。
[0018]本發(fā)明大腸桿菌漆酶突變體的酶活遠高于野生型，因此，本發(fā)明所述大腸桿菌漆 酶突變體或其編碼基因在洗涂劑、食品、飲料、環(huán)?；蚧瘖y品工業(yè)，造紙、紡織或醫(yī)用傳感器 等領域中將具有廣泛的應用前景。
[0019] 例如，在造紙工業(yè)中，將大腸桿菌漆酶突變體應用于紙漿漂白。漆酶能選擇性地催 化木質素降解，不會損傷纖維素和半纖維素，不會產生有毒物質，并且生產在常溫、常壓的 溫和條件下進行，節(jié)約設備和能耗。漆酶能夠脫甲基和部分溶解紙漿中的木素。
[0020] 在食品、飲料工業(yè)中的應用，大腸桿菌漆酶突變體能夠氧化多酪類物質生成多酪 氧化物，多酪氧化物自身能夠發(fā)生再聚合，形成可W被濾膜截留的大顆粒，最終達到凈化飲 料的目的。由于運一催化反應專一性強，污染問題少，澄清的果汁色淺且穩(wěn)定。在面包加工 方面，大腸桿菌漆酶突變體的使用可W增加面包體積，改善面包結構和柔軟性，同時可W提 高加工時面團的機械強度、穩(wěn)定性，并能降低粘性。對于質量較差的面粉，能明顯改善面團 的機械加工性能。此外，漆酶突變體還可用來測定食品中抗壞血酸的總含量。
[0021] 大腸桿菌漆酶突變體在醫(yī)用傳感器中的應用包括：利用固定化漆酶制成的電位免 疫傳感器進行膜島素或腎上腺素分析等。
[0022] 大腸桿菌漆酶突變體在環(huán)境保護中的應用，例如，將漆酶突變體吸附在炭上制成 固定化酶電極能有效地催化負極氧化還原，間接地進行環(huán)境監(jiān)測。運種方法的特點是專一 性強、速度快、可連續(xù)操作、手續(xù)簡便。
[0023] 本發(fā)明技術方案與現(xiàn)有技術相比，具有W下有益效果：
[0024] 本發(fā)明從±壤中克隆到了大腸桿菌漆酶突變體G276R，在最適條件下，其酶活約是 野生型的3倍。本發(fā)明進一步將野生型大腸桿菌漆酶第276位的甘氨酸突變?yōu)楣劝彼?、?氨酸、天冬酷胺或精氨酸中的任意一種，獲得的大腸桿菌漆酶突變體的酶活均高于野生型， 但突變體G276R是該位的最優(yōu)選擇。本發(fā)明所述大腸桿菌漆酶突變體及其編碼基因在洗涂 劑、食品、飲料、環(huán)?；蚧瘖y品工業(yè)，造紙、紡織或醫(yī)用傳感器等領域中將具有重要的應用前 旦 陽做]本發(fā)巧所徙及到的術語定女
[0026]除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發(fā)明所屬領域的 普通技術人員通常所了解相同的含義。
[0027] 術語"多核巧酸"或"核巧酸"意指單股或雙股形式的脫氧核糖核巧酸、脫氧核糖 核巧、核糖核巧或核糖核巧酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術語涵蓋含有天然核巧 酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結合特性并W類似于天然產生 的核巧酸的方式進行代謝。除非另外特定限制，否則所述術語也意指寡核巧酸類似物，其 包括PNA(膚核酸）、在反義技術中所用的DNA類似物（硫代憐酸醋、憐酷胺酸醋等）。除 非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體（包括（但不限于）簡 并密碼子取代）和互補序列W及明確指定的序列。特定而言，可通過產生其中一個或一個 W上所選（或所有）密碼子的第3位經混合堿基和/或脫氧肌巧殘基取代的序列來實現(xiàn)簡 并密碼子取代度atzer等人，NucleicAcidRes. 19:5081(1991) ;0htsuka等人，J.Biol. Chem. 260:2605-2608(1985);和Cassol等人，（1992);Rossolini等人，MolCell.Probes 8:91-98(1994))〇
[002引術語"重組宿主細胞"或"宿主細胞"意指包含本發(fā)明多核巧酸的細胞，而不管使用 何種方法進行插入W產生重組宿主細胞，例如直接攝取、轉導、f配對或所屬領域中已知的 其它方法。外源性多核巧酸可保持為例如質粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。 宿主細胞可為原核細胞或真核細胞。
[0029] 術語"可操作的連接"指兩個或更多個元件之間功能性的連接，可操作的連接的元 件可為鄰接或非鄰接的。
[0030] 術語"轉化"指將異源性DNA序列引入到宿主細胞或有機體的方法。
[0031] 術語"表達"意指內源性基因或轉基因在細胞中的轉錄和/或翻譯。
【附圖說明】
[0032] 圖1為大腸桿菌漆酶突變體G276R的最適溫度測定結果；
[0033] 圖2為大腸桿菌漆酶突變體G276R的最適抑測定結果；
[0034] 圖3為大腸桿菌漆酶突變體G276R的Tm值測定結果；其中，276 :大腸桿菌漆酶突 變體G276R;州eo:野生型大腸桿菌漆酶；
[0035] 圖4為野生型大腸桿菌漆酶G276位突變?yōu)椴煌被岬拿富顪y定；
[0036] 圖5為不同大腸桿菌漆酶突變體在最適條件下的酶活；
[0037] 圖6為G276R突變體與野生型大腸桿菌漆酶分別在最適條件下的酶活。
【具體實施方式】
[0038] 下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但是應理解所述實施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領 域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可W對本發(fā)明技術方案的細節(jié) 和形式進行修改或替換，但運些修改或替換均落入本發(fā)明的保護范圍。
[0039] 實施例1大腸桿菌漆酶突變體基因的克隆 W40] 1、實驗方法
[0041] 1. 1CTAB法提取江西化工廠±壤宏基因組 陽0創(chuàng) （1)稱取5g