一種大腸桿菌的微離心式培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大腸桿菌的微離心式培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大腸桿菌是與我們?nèi)粘Ｉ铌P(guān)系非常密切的一類細(xì)菌，屬于腸道桿菌大類中的一種。各種動(dòng)物大腸桿菌滅活疫苗的制備中，首要環(huán)節(jié)就是大腸桿菌的培養(yǎng)。為了獲得理想的活菌濃度，業(yè)界對(duì)大腸桿菌培養(yǎng)工藝進(jìn)行了大量研究。影響大腸桿菌培養(yǎng)菌濃度的因素有很多，如培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)時(shí)間、菌種接種量以及細(xì)菌生長(zhǎng)環(huán)境等一般情況下，生物藥物的產(chǎn)率與大腸桿菌發(fā)酵密度密切相關(guān)，大腸桿菌的收率直接關(guān)系到生物藥物的產(chǎn)率。所以在菌體表達(dá)蛋白效率相當(dāng)?shù)那闆r下，大腸桿菌的發(fā)酵密度直接影響到生物藥物的生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種大腸桿菌的微離心式培養(yǎng)方法。
[0004]—種大腸桿菌的微離心式培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0005]I)將大腸桿菌菌種接種于第一培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基固定在離心旋轉(zhuǎn)機(jī)中，轉(zhuǎn)速3?4秒/轉(zhuǎn)，36.5?37.5°C條件下培養(yǎng)16?24小時(shí)，在瓊脂平板上劃線接種，37.5?38.5°C條件下培養(yǎng)15?20小時(shí)，得到一級(jí)培養(yǎng)種子；
[0006]2)將步驟I)得到的一級(jí)培養(yǎng)種子接種到第二培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基固定在離心旋轉(zhuǎn)機(jī)中，轉(zhuǎn)速2?3秒/轉(zhuǎn)，34.5?35.5°C條件下培養(yǎng)12?15小時(shí)，得到二級(jí)培養(yǎng)種子；
[0007]3)將步驟2)得到的二級(jí)培養(yǎng)種子接種于菌液中，再導(dǎo)入至離心管中，加入15?20%的瓊脂，搖床過(guò)夜，再加入氯化鈣溶液，混懸菌液，離心分離，將上層清液去除，即得。
[0008]具體的，步驟I)中，所述的第一培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分包括:硫酸銨、磷酸氫二鈉、七水硫酸鎂、酵母提取物、甘油、二水鉬酸鈉、五水硫酸銅、生物素、硫酸錳、六水氯化鈷和蒸餾水。
[0009]具體的，步驟2)中，所述的第二培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分包括:葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鉀、檸檬酸、硫酸鎂、鎂、酵母提取物、六水氯化鐵、硼酸、七水硫酸鋅、谷氨酸鈉和蒸餾水。
[0010]優(yōu)選的，步驟3)中，所述搖床的轉(zhuǎn)速為90?150轉(zhuǎn)/分鐘。
[0011]優(yōu)選的，步驟3)中，所述氯化鈣溶液的濃度為2?3%。
[0012]本發(fā)明所提供的大腸桿菌的微離心式培養(yǎng)方法能穩(wěn)定的對(duì)大腸桿菌進(jìn)行快速培養(yǎng)，顯著的縮短的培養(yǎng)時(shí)間的消耗，能夠獲得符合實(shí)驗(yàn)室使用標(biāo)準(zhǔn)的高濃度活菌。
【具體實(shí)施方式】
[0013]以下對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0014]實(shí)施例1
[0015]—種大腸桿菌的微離心式培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0016]I)將大腸桿菌菌種接種于第一培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基固定在離心旋轉(zhuǎn)機(jī)中，轉(zhuǎn)速3秒/轉(zhuǎn)，37.0件下培養(yǎng)20小時(shí)，在瓊脂平板上劃線接種，38.0°C條件下培養(yǎng)18小時(shí)，得到一級(jí)培養(yǎng)種子。其中，第一培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分包括:硫酸銨、磷酸氫二鈉、七水硫酸鎂、酵母提取物、甘油、二水鉬酸鈉、五水硫酸銅、生物素、硫酸錳、六水氯化鈷和蒸餾水。
[0017]2)將步驟I)得到的一級(jí)培養(yǎng)種子接種到第二培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基固定在離心旋轉(zhuǎn)機(jī)中，轉(zhuǎn)速3秒/轉(zhuǎn)，35.(TC條件下培養(yǎng)13小時(shí)，得到二級(jí)培養(yǎng)種子。第二培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分包括:葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鉀、檸檬酸、硫酸鎂、鎂、酵母提取物、六水氯化鐵、硼酸、七水硫酸鋅、谷氨酸鈉和蒸餾水。
[0018]3)將步驟2)得到的二級(jí)培養(yǎng)種子接種于菌液中，再導(dǎo)入至離心管中，加入18%的瓊脂，搖床過(guò)夜，再加入氯化鈣溶液，混懸菌液，離心分離，將上層清液去除，即得。其中，搖床的轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘。氯化鈣溶液的濃度為2.5%。
[0019]所得活菌濃度為8.5 X 109CFU/ml。
[0020]實(shí)施例2
[0021]—種大腸桿菌的微離心式培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0022]I)將大腸桿菌菌種接種于第一培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基固定在離心旋轉(zhuǎn)機(jī)中，轉(zhuǎn)速4秒/轉(zhuǎn)，37.5°C條件下培養(yǎng)24小時(shí)，在瓊脂平板上劃線接種，37.5°C條件下培養(yǎng)20小時(shí)，得到一級(jí)培養(yǎng)種子。其中，第一培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分包括:硫酸銨、磷酸氫二鈉、七水硫酸鎂、酵母提取物、甘油、二水鉬酸鈉、五水硫酸銅、生物素、硫酸錳、六水氯化鈷和蒸餾水。
[0023]2)將步驟I)得到的一級(jí)培養(yǎng)種子接種到第二培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基固定在離心旋轉(zhuǎn)機(jī)中，轉(zhuǎn)速2秒/轉(zhuǎn)，35.5°C條件下培養(yǎng)12小時(shí)，得到二級(jí)培養(yǎng)種子。第二培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分包括:葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鉀、檸檬酸、硫酸鎂、鎂、酵母提取物、六水氯化鐵、硼酸、七水硫酸鋅、谷氨酸鈉和蒸餾水。
[0024]3)將步驟2)得到的二級(jí)培養(yǎng)種子接種于菌液中，再導(dǎo)入至離心管中，加入20%的瓊脂，搖床過(guò)夜，再加入氯化鈣溶液，混懸菌液，離心分離，將上層清液去除，即得。其中，搖床的轉(zhuǎn)速為90轉(zhuǎn)/分鐘。氯化鈣溶液的濃度為3 %。
[0025]所得活菌濃度為1.2 X 1010CFU/ml。
[0026]實(shí)施例3
[0027]—種大腸桿菌的微離心式培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0028]I)將大腸桿菌菌種接種于第一培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基固定在離心旋轉(zhuǎn)機(jī)中，轉(zhuǎn)速3秒/轉(zhuǎn)，37.5°C條件下培養(yǎng)16小時(shí)，在瓊脂平板上劃線接種，38.5°C條件下培養(yǎng)15小時(shí)，得到一級(jí)培養(yǎng)種子。其中，第一培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分包括:硫酸銨、磷酸氫二鈉、七水硫酸鎂、酵母提取物、甘油、二水鉬酸鈉、五水硫酸銅、生物素、硫酸錳、六水氯化鈷和蒸餾水。
[0029]2)將步驟I)得到的一級(jí)培養(yǎng)種子接種到第二培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基固定在離心旋轉(zhuǎn)機(jī)中，轉(zhuǎn)速3秒/轉(zhuǎn)，34.5°C條件下培養(yǎng)5小時(shí)，得到二級(jí)培養(yǎng)種子。第二培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分包括:葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鉀、檸檬酸、硫酸鎂、鎂、酵母提取物、六水氯化鐵、硼酸、七水硫酸鋅、谷氨酸鈉和蒸餾水。
[0030]3)將步驟2)得到的二級(jí)培養(yǎng)種子接種于菌液中，再導(dǎo)入至離心管中，加入15%的瓊脂，搖床過(guò)夜，再加入氯化鈣溶液，混懸菌液，離心分離，將上層清液去除，即得。其中，搖床的轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘。氯化鈣溶液的濃度為2%。
[0031]所得活菌濃度為1.3X1010CFU/mlo
[0032]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施方式，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種大腸桿菌的微離心式培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將大腸桿菌菌種接種于第一培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基固定在離心旋轉(zhuǎn)機(jī)中，轉(zhuǎn)速3?4秒/轉(zhuǎn)，36.5?37.5°C條件下培養(yǎng)16?24小時(shí)，在瓊脂平板上劃線接種，37.5?38.5°C條件下培養(yǎng)15?20小時(shí)，得到一級(jí)培養(yǎng)種子； 2)將步驟I)得到的一級(jí)培養(yǎng)種子接種到第二培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基固定在離心旋轉(zhuǎn)機(jī)中，轉(zhuǎn)速2?3秒/轉(zhuǎn)，34.5?35.5°C條件下培養(yǎng)12?15小時(shí)，得到二級(jí)培養(yǎng)種子； 3)將步驟2)得到的二級(jí)培養(yǎng)種子接種于菌液中，再導(dǎo)入至離心管中，加入15?20%的瓊脂，搖床過(guò)夜，再加入氯化鈣溶液，混懸菌液，離心分離，將上層清液去除，即得。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌的微離心式培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟I)中，所述的第一培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分包括:硫酸銨、磷酸氫二鈉、七水硫酸鎂、酵母提取物、甘油、二水鉬酸鈉、五水硫酸銅、生物素、硫酸錳、六水氯化鈷和蒸餾水。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大腸桿菌的微離心式培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟2)中，所述的第二培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分包括:葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鉀、檸檬酸、硫酸鎂、鎂、酵母提取物、六水氯化鐵、硼酸、七水硫酸鋅、谷氨酸鈉和蒸餾水。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述的大腸桿菌的微離心式培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟3)中，所述搖床的轉(zhuǎn)速為90?150轉(zhuǎn)/分鐘。5.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述的大腸桿菌的微離心式培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟3)中，所述氯化鈣溶液的濃度為2?3%。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大腸桿菌的微離心式培養(yǎng)方法。該方法包括步驟：1)將大腸桿菌菌種接種于第一培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基固定在離心旋轉(zhuǎn)機(jī)中培養(yǎng)，在瓊脂平板上劃線接種，得到一級(jí)培養(yǎng)種子；2)接種到第二培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基固定在離心旋轉(zhuǎn)機(jī)中，得到二級(jí)培養(yǎng)種子；3)接種于菌液中，再導(dǎo)入至離心管中，加入15～20％的瓊脂，搖床過(guò)夜，再加入氯化鈣溶液，混懸菌液，離心分離，將上層清液去除，即得。本發(fā)明所提供的大腸桿菌的微離心式培養(yǎng)方法能穩(wěn)定的對(duì)大腸桿菌進(jìn)行快速培養(yǎng)，顯著的縮短的培養(yǎng)時(shí)間的消耗，能夠獲得符合實(shí)驗(yàn)室使用標(biāo)準(zhǔn)的高活菌濃度。
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/19
【公開號(hào)】CN105255764
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510710362
【發(fā)明人】林炳營(yíng)
【申請(qǐng)人】桂林瑞豐環(huán)保微生物應(yīng)用研究所
【公開日】2016年1月20日
【申請(qǐng)日】2015年10月27日