一種嬰兒配方奶粉中克羅諾桿菌的溯源方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種嬰兒配方奶粉中克羅諾桿菌的溯源方法，該方法利用多位點序列分型技術(shù)，對PIF原料、半成品、成品及其加工環(huán)境的克羅諾桿菌進行分子分型研究，揭示其種群特征，明確克羅諾桿菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并通過生物信息學(xué)對克羅諾桿菌進行系統(tǒng)發(fā)育分析，從而系統(tǒng)的揭示上述環(huán)境中克羅諾桿菌的遺傳特征；在克羅諾桿菌MLST分型的基礎(chǔ)上，以該致病菌的ST和環(huán)境來源為變量進行相關(guān)性分析，確定PIF加工過程中最易污染克羅諾桿菌的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和分布規(guī)律，從而追溯嬰兒配方奶粉中克羅諾桿菌的來源。從而實現(xiàn)從根本上監(jiān)控PIF生產(chǎn)過程，保證PIF質(zhì)量的目的。
【專利說明】
一種嬰兒配方奶粉中克羅諾桿菌的溯源方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全領(lǐng)域，追溯PIF中克羅諾桿菌的污染來源具體涉及一種嬰兒 配方奶粉中克羅諾桿菌的溯源方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 克羅諾桿菌（Cronobacter spp·)是嬰兒配方乳粉（powdered infant formula， PIF)中最具危害性的機會性致病菌之一，嬰兒尤其是出生28天內(nèi)的體重較輕的新生兒攝入 被克羅諾桿菌污染的PIF后，會導(dǎo)致嚴(yán)重的壞死性小腸結(jié)腸炎、菌血癥和腦膜炎等惡性疾 病，死亡率高達40%-80%?？肆_諾桿菌是腸桿菌科中環(huán)境適應(yīng)性最強的種屬，因此雖然PIF 的加工環(huán)境(包括原輔料、預(yù)處理、噴霧干燥、流化床和包裝等環(huán)節(jié))已經(jīng)得到了嚴(yán)格的監(jiān)管 和控制，但是目前市售的PIF中克羅諾桿菌的污染率仍高達4.3%，可見該致病菌的污染已 經(jīng)嚴(yán)重影響和制約了我國PIF行業(yè)的健康發(fā)展。
[0003] 目前對PIF中克羅諾桿菌的防控主要是對成品的檢驗和對生產(chǎn)原料、生產(chǎn)環(huán)境的 監(jiān)管，這種分離的檢驗監(jiān)管方法并不能從根本上針對性的對PIF中克羅諾桿菌進行防控。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對上述問題，本發(fā)明提供一種嬰兒配方奶粉中克羅諾桿菌的溯源方法。
[0005]克羅諾桿菌是一個新興的多樣性豐富的屬，目前在克羅諾桿菌多位點序列分型數(shù) 據(jù)庫（Multilocus Sequence Typing，MLST，http: //www.pubmlst ·org/cronobacter)中已 包含1090株不同來源的克羅諾桿菌，這些菌株被分為336個序列型（sequence types，STs)， 這顯示了其高度的遺傳多樣性。同時，克羅諾桿菌高度的遺傳多樣性增加了其在不良環(huán)境 中存活的可能性，即一些在種群結(jié)構(gòu)中占優(yōu)勢的克羅諾桿菌更能夠適應(yīng)不良的環(huán)境，因此 系統(tǒng)的研究PIF及其加工環(huán)境中克羅諾桿菌的遺傳多樣性，可以追溯PIF成品中的克羅諾桿 菌來源，更有針對性的進行該致病菌的防控，從而制定切實有效的防控措施。
[0006] 該方法利用多位點序列分型技術(shù)，對分離自相同品牌相同批次的PIF原輔料、半成 品、成品及其加工環(huán)境的克羅諾桿菌進行分子分型研究，在此基礎(chǔ)上，以該致病菌的ST和環(huán) 境來源為變量進行相關(guān)性分析，確定PIF加工過程中最易污染克羅諾桿菌的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和分 布規(guī)律，達到追溯該致病菌的目的，從而實現(xiàn)從根源上對PIF中克羅諾桿菌進行針對性防 控。
[0007] 步驟為：
[0008] 1)將從相同品牌相同批次的PIF、PIF原輔料、半成品、成品及其加工環(huán)境采集樣品 中得到的克羅諾桿菌，提取DNA，對提取的DNA的16SrRNA序列進行擴增，對得到的16SrRNA的 PCR產(chǎn)物進行基因測序，并將得到的序列在GENBANK數(shù)據(jù)庫中進行比對，完成分子鑒定；
[0009] 2)看家基因的特異性擴增:合成看家基因的引物，以克羅諾桿菌DNA為模板進行特 異性擴增；
[0010] 3)看家基因測序:將克羅諾桿菌看家基因的PCR產(chǎn)物測序，獲得克羅諾桿菌看家基 因的核酸序列；
[0011] 4)克羅諾桿菌MLST序列型的確定:登錄克羅諾桿菌MLST數(shù)據(jù)庫，對每株克羅諾桿 菌的看家基因等位基因進行序列查詢，獲得每株菌的等位基因號，并根據(jù)等位基因號確定 克羅諾桿菌最終的序列型；
[0012] 5)克羅諾桿菌的溯源分析:利用SPSS軟件，以分離自PIF加工環(huán)境的株克羅諾桿菌 的MLST序列型和加工過程關(guān)鍵控制點為變量進行相關(guān)性分析，得到克羅諾桿菌MLST序列型 與關(guān)鍵控制點之間的相關(guān)性，從而追溯克羅諾桿菌的污染源頭，確定克羅諾桿菌的污染途 徑。
[0013] 具體步驟為：
[0014] 1)將從相同品牌相同批次的PIF、PIF原輔料、半成品、成品及其加工環(huán)境采集樣品 中得到的克羅諾桿菌，提取DNA，選取27-F和1492-R引物對提取的DNA的16SrRNA序列進行擴 增，PCR擴增體系為 10 X rTaq Buffer (含 15mmo 1 /L MgCl 2) 5 · OyL，dNTP(2 · 5mM) 4 · OyL，模板 DNA2 · OyL，27-F1 · OyL，1492-R1 · OyL，Taq DNA聚合酶0 · 5yL，ddH2036 · 5yL;擴增條件為95°C 預(yù)變性5min，95°C變性lmin，58°C退火30s，72°C延伸lmin，循環(huán)30次，最后72°C延伸5min;利 用瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行驗證，并在UVP紫外呈相系統(tǒng)下觀察實驗結(jié)果；對 16SrRNA的PCR產(chǎn)物進行基因測序，選擇雙向測通，并將得到的序列在GENBANK數(shù)據(jù)庫中進行 比對，完成分子鑒定；其中27-F、1492-R引物序列見SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2;
[0015] 2)看家基因的特異性擴增:合成7對看家基因3七口0、;1^184、81113、8]^13、85^13、;[1^13和 PPsA的引物，引物序列見SEQ ID NO: 3-SEQ ID NO: 16,以克羅諾桿菌DNA為模板進行特異性 擴增，7對引物的PCR擴增體系和條件相同，PCR擴增體系為lOXrTaq Buffer(含15mmol/L MgC12)5.0yL，dNTP(2.5mM)4.0yL，模板DNA5.0yL，上游引物l.OyL，下游引物 1.0yL，Taq DNA 聚合酶 1. OyL，ddH2033. OyL;擴增條件為 94°C 預(yù)變性 2min，94°C 變性 lmin，58°C 退火 lmin，72 °C延伸2min，循環(huán)30次，最后72°C延伸5min;PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗，并在 UVP紫外凝膠呈相系統(tǒng)下觀察記錄結(jié)果；
[0016] 3)看家基因測序:將克羅諾桿菌7對看家基因的PCR產(chǎn)物送樣、純化，單向測通，獲 得克羅諾桿菌7個看家基因的核酸序列；
[0017] 4)克羅諾桿菌MLST序列型的確定：登錄克羅諾桿菌MLST數(shù)據(jù)庫，對每株克羅諾桿 菌的7個等位基因進行序列查詢，獲得每株菌的等位基因號，并根據(jù)7個等位基因號確定克 羅諾桿菌最終的序列型；
[0018] 5)克羅諾桿菌的溯源分析:利用SPSS軟件，以分離自PIF加工環(huán)境的克羅諾桿菌的 MLST序列型和加工過程關(guān)鍵控制點為變量進行相關(guān)性分析，得到克羅諾桿菌MLST序列型與 關(guān)鍵控制點之間的相關(guān)性，從而追溯克羅諾桿菌的污染源頭，確定克羅諾桿菌的污染途徑。
[0019] 表1 16S rRNA PCR擴增體系和參數(shù)
[0021 ]表2 7對看家基因擴增體系和擴增條件和參數(shù)
[0022]
[0023]表3試驗中的引物序列
[0024]

【附圖說明】
[0025] 圖1 7個看家基因的PCR結(jié)果；
[0026]圖2 PIF及其加工環(huán)境中克羅諾桿菌STs的組成；
[0027]圖3 7個看家基因最小似然系統(tǒng)發(fā)育樹：圖3 a:atpD基因最小似然系統(tǒng)發(fā)育樹；圖 3 b:fusA基因最小似然系統(tǒng)發(fā)育樹；圖3 c:glnS基因最小似然系統(tǒng)發(fā)育樹；圖3 d:gltB基 因最小似然系統(tǒng)發(fā)育樹；圖3 e:gyrB基因最小似然系統(tǒng)發(fā)育樹；圖3 f:infB基因最小似然 系統(tǒng)發(fā)育樹;圖3 g: infB基因最小似然系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0028] 圖4 70株克羅諾桿菌最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0029] 圖5 PIF加工環(huán)境與克羅諾桿菌序列型相關(guān)性分析。
【具體實施方式】
[0030] 主要試劑：
[0033]實施例1克羅諾桿菌的活化、純化及鑒定
[0034]供試菌株為80株克羅諾桿菌，其中43株分離自PIF，27株分離自PIF的加工環(huán)境，4 株為克羅諾桿菌參考菌株（C.sakazakii ATCC BAA-894，C.sakazakii ATCC 29004， C.sakazakii ATCC 29544和C.sakazakii ATCC 12868)，6株為克羅諾桿菌模式株 (C.malonaticus CDC105877T,C.dublinensis LMG23823T,C.turicensis LMG23827T, C.universalis NCTC9529T，C.condimenti LMGT和C.腿ytjensii ATCC 51329T)。此外 E.aerogenes ATCC 13048、E.cloacae ATCC 35030、Escherichia CMCCB 44113和 Escherichia 0157作為外參菌株。具體情況如表4所不，且上述供試菌株均來自于東北農(nóng)業(yè) 大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室503實驗室。
[0035] 表4供試菌株及其來源
[0036] Table 2-1 The strains and their sources

[0040] (1)克羅諾桿菌的活化
[0041 ] 按照25g(LB): 1 OOOmL(蒸餾水）的比例配置LB液體培養(yǎng)基，并采用121°C下高溫滅 菌30min后冷卻，并按照10mL的量分裝在無菌試管中待用。從深冷冰箱中取出80株甘油保存 的克羅諾桿菌，先在4 °C冰箱中解凍，再在室內(nèi)恢復(fù)到室溫。按照1 %的接種量將1 OOyL的克 羅諾桿菌菌液接種到lOmLLB培養(yǎng)基中，在37°C中培養(yǎng)12h達到活化的目的。
[0042] (2)克羅諾桿菌的純化
[0043] 按照40g(TSA): 1 OOOmL(蒸餾水）的比例配置TSA培養(yǎng)基，采用121°C，30min的條件 下高溫滅菌，并在無菌培養(yǎng)皿中倒平板，冷卻后對克羅諾桿菌進行三區(qū)劃線。在37°C培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)24h，挑取克羅諾桿菌單菌落并接種到LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12h得到克羅諾桿 菌的純培養(yǎng)液。
[0044] (3)克羅諾桿菌DNA的提取
[0045]吸取純化后的克羅諾桿菌菌懸液2mL，按照天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒使用說 明對80株克羅諾桿菌進行DNA的提取，提取后的DNA存放在-20 °C待用。
[0046] (4)克羅諾桿菌的分子鑒定
[0047] 按照表3中的引物序列，選取27-F和1492-R引物對克羅諾桿菌DNA的16SrRNA序列 進行擴增，反應(yīng)體系和擴增條件見表5。利用1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行驗證， 并在UVP紫外呈相系統(tǒng)下觀察實驗結(jié)果。最后將克羅諾桿菌16SrRNA的PCR產(chǎn)物送往北京諾 賽基因組研究中心有限公司進行基因測序，選擇雙向測通，并將得到的序列在GENBANK數(shù)據(jù) 庫中進行比對，完成克羅諾桿菌的分子鑒定結(jié)果表明待測的70株菌株均屬于克羅諾桿菌 屬，相似程度均彡99 %。
[0048] 表5 16S rRNA PCR擴增體系和參數(shù)
[0050]實施例2克羅諾桿菌的多位點序列分型 [0051 ] (1 )7對看家基因特異PCR擴增及基因測序
[0052] (1)7對看家基因的特異性擴增
[0053] 合成7對看家基因（atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB和ppsA)的引物(基因序列見 表3)，以克羅諾桿菌DNA為模板進行特異性擴增，7對引物的PCR擴增體系和條件相同，如表6 所示。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗，并在UVP紫外凝膠呈相系統(tǒng)下觀察記錄結(jié) 果，結(jié)果如圖1所示。7個看家基因的目的條帶清晰，根據(jù)條帶位置判斷其產(chǎn)物序列大小為7 個看家基因的目的條帶。
[0054]表6 7對看家基因擴增體系和擴增條件和參數(shù)
[0056] (2)看家基因的基因測序
[0057] 將克羅諾桿菌7對看家基因的PCR產(chǎn)物送樣、純化，單向測通，獲得克羅諾桿菌7個 看家基因的核酸序列。
[0058] (3)克羅諾桿菌的MLST分型
[0059] (1)克羅諾桿菌MLST序列型的確定
[0060] 登錄克羅諾桿菌MLST數(shù)據(jù)庫(http ://pubmlst · org/cronobacter/)，選擇等位基 因序列查詢，輸入基因測序序列，對每株克羅諾桿菌的7個等位基因進彳丁序列查詢，獲得每 株菌的等位基因號、克隆復(fù)雜度(CC)和序列型（ST)，并將序列信息提交到MLST數(shù)據(jù)庫中得 到每株克羅諾桿菌在克羅諾桿菌數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)識碼(ID)，結(jié)果如表7所示。
[0061 ] 表7 70株克羅諾桿菌MLST信息表
[0064] (1)等位基因
[0065] 通過數(shù)據(jù)庫比對，得到7個看家基因的等位基因號如下：
[0066] atpD:atpDl、atpD3、atpD5、atpD10、atpDll、atpD16、atpD18、atpD19、atpD55、 atpD89;
[0067] fusA: fusAl、fusA7、fusA8、fusAl 1、fusA12、fusA13、fusA14、fusA15、fusA16、 fusA17、fusA37;
[0068] glnS:glnSl、glnS3、glnS6、glnS7、glnS9、glnS10、glnS13、glnS16、glnS19、 glnS28、glnS37、glnS59、glnS107、glnS108;
[0069] gltB:gltBl、gltB3、gltB5、gltB8、gltB12、gltB15、gltB18、gltB19、gltB22、 gltB40、gltB41、gltB99、gltB109、gltB127、gltB128;
[0070] gyrB:gyrBl、gyrB5、gyrB8、gyrB9、gyrB10、gyrBll、gyrB15、gyrB16、gyrB18、 gyrB19、gyrB22、gyrB26、gyrB29、gyrB70、gyrB74、gyrB125;
[0071] infB:infBl、infB3、infB5、infB14、infB15、infB17、infB20、infB24、infB35、 infB36、infB38、infB56、infB70;
[0072] ppsA:ppsAl、ppsM、ppsA9、ppsA10、ppsA13、ppsA14、ppsA18、ppsA19、ppsA21、 ppsA23、ppsA26、ppsA32、ppsA80、ppsA102、ppsA160、ppsA161。
[0073] 其中發(fā)現(xiàn)了8個新的等位基因，分別為：atpD89、glnS107、glnS108、gltB127、 gltB128、gyrB125，ppsA160和ppsA161。
[0074] (2)MLST序列型的確定
[0075] 70株克羅諾桿菌被分為了 19個序列型，分別為：ST1、ST4、ST8、ST12、ST17、ST21、 ST22、ST31、ST40、ST50、ST64、ST83、ST201、ST258、ST259、ST268、ST260、ST269 和 ST261，其中 5丁258、5了259、5了268、5了260、5了269和5了261是新的序列型，且5了201和5了258為丙二酸陽性克 羅諾桿菌的序列型。
[0076] (2)基于MLST的克羅諾桿菌的系統(tǒng)發(fā)育分析
[0077]拼接克羅諾桿菌的7個看家基因，得到長度為3036bp的基因序列。利用Mega6.0軟 件，對70株克羅諾桿菌進行系統(tǒng)發(fā)育分析，選擇最大似然算法（Minimum like 1 ihood algorithm)，程序重復(fù)1000次，構(gòu)建克羅諾桿菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，并選擇C. sakazakii ATCC BAA-894，C.sakazakii ATCC 29004，C.sakazakii ATCC 29544、C.sakazakii ATCC 12868、 C.malonaticus CDC105877T,C.dublinensis LMG23823T,C.turicensis LMG23827T, C.universalis NCTC9529T，C.condimenti LMGWPC.muytjensii ATCC 51329T作為參考和 模式菌株。
[0078]通過餅狀圖展現(xiàn)PIF及其加工環(huán)境中克羅諾桿菌的種群特征，如圖2所示。
[0079] 70株克羅諾桿菌中阪崎克羅諾桿菌66株，丙二酸陽性克羅諾桿菌4株，這說明在 PIF及其加工環(huán)境中阪崎克羅諾桿菌是克羅諾桿菌屬的優(yōu)勢種。在ST方面，ST4的菌株為18 株，占總數(shù)的27 % ; ST1的菌株為14株，占總數(shù)的21 % ; ST64的菌株為11株，占總數(shù)的16 % ;之 后為ST12(3株，5%)、ST21(3株，5%)和ST258(3株，5%)、ST22(2株，3%)、ST8(2株，3%)、 ST261(2株，3%)和ST260(2株，3%);其他9個ST都只有1株克羅諾桿菌，分別為:ST17、ST31、 ST40、ST51、ST83、ST201、ST259、ST268和ST260?？梢奝IF及其加工環(huán)境中克羅諾桿菌的優(yōu)勢 序列型為ST4、ST1和ST64,此外ST258(3/4,75%)是數(shù)量最多的丙二酸陽性克羅諾桿菌ST。
[0080] (4)克羅諾桿菌看家基因的系統(tǒng)發(fā)育分析
[0081] 以E.aerogenes ATCC 13048、E.cloacae ATCC 35030、Escherichia CMCCB 44113 和Escherichia 0157作為外參菌株，利用Mega6.0軟件對不同的等位基因進行系統(tǒng)發(fā)育分 析，得到7個看家基因的最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。
[0082]圖3(a_g)展現(xiàn)出了 7個看家基因清晰的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，7個看家基因都沒有出現(xiàn)明 顯的水平基因轉(zhuǎn)移，這說明7個看家基因比較保守。其中atpD、fusA、gyrB和infB的系統(tǒng)發(fā)育 樹中的外參菌株遠(yuǎn)離其他序列，而glnS中E.cloacae ATCC 35030和克羅諾桿菌有相近的系 統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，gltB中E.cloacae ATCC 35030和克羅諾桿菌有相近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，ppsA中 E. aerogenes ATCC13048和克羅諾桿菌有相近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。
[0083] (5)克羅諾桿菌不同MLST序列型的系統(tǒng)發(fā)育分析
[0084] 70株克羅諾桿菌（具有19個不同的MLST序列型）的最小似然系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所 示。C.sakazakii ATCC BAA-894，C.sakazakii ATCC 29004，C.sakazakii ATCC 29544和 C.sakazakii ATCC 12868為參考菌株，C.malonaticus CDC105877T，C.dublinensis LMG23823T，C.turicensis LMG23827T，C.universalis NCTC9529T，C.condimenti LMGT和 C.muytjensii ATCC 5132#為克羅諾桿菌模式株。
[0085]圖4顯示了克羅諾桿菌清晰的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，克羅諾桿菌屬的7個種都相互保持了 一定的距離，而在這7個種中，阪崎克羅諾桿菌和丙二酸陽性克羅諾桿菌顯示了更近的系統(tǒng) 關(guān)系。在阪崎克羅諾桿菌種內(nèi)，ST4和ST258、ST64和ST261具有更近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系;在丙二 酸陽性克羅諾桿菌種內(nèi)ST201和ST7(C.malonaticus CDC 105877)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較近。而 根據(jù)MLST數(shù)據(jù)庫比對的結(jié)果，這些相近ST之間只相差一個堿基，由于MLST分型能夠反應(yīng)整 個基因組的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，因此ST4和ST268、ST64和ST261、ST201和ST7的菌株很可能在整 個基因組層面的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系也比較相近。
[0086] (6)克羅諾桿菌的溯源分析
[0087] 利用SPSS軟件，以分離自PIF加工環(huán)境的27株克羅諾桿菌的MLST序列型和加工過 程關(guān)鍵控制點（原輔料、巴殺濃縮后、噴霧干燥后、流化床出口、車間終產(chǎn)品等)為變量進行 相關(guān)性分析，得到克羅諾桿菌MLST序列型與關(guān)鍵控制點之間的相關(guān)性，從而追溯克羅諾桿 菌的污染源頭，確定克羅諾桿菌的污染途徑，結(jié)果如圖5所示。
[0088]參與分析的克羅諾桿菌共計27株，均分離自某PIF工廠關(guān)鍵生產(chǎn)環(huán)節(jié)的生產(chǎn)環(huán)境 及原輔料和終產(chǎn)品中，這些檢測到克羅諾桿菌的關(guān)鍵控制點包括噴霧干燥、流化床、固定 床。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)原輔料與克羅諾桿菌ST17和ST258相關(guān)、固定床與克羅諾桿菌 ST269相關(guān)、然而ST17、ST258和ST269型的克羅諾桿菌并沒有出現(xiàn)在車間終產(chǎn)品中，因此雖 然在原輔料和固定床上分離到了克羅諾桿菌，但是這兩個環(huán)節(jié)并不是克羅諾桿菌的污染途 徑；同時，ST1與噴霧干燥、流化床和車間終產(chǎn)品都相關(guān)，ST64與流化床和車間終產(chǎn)品相關(guān)， 這說明噴霧干燥和流化床是克羅諾桿菌的污染途徑;此外，ST4與車間終產(chǎn)品具有相關(guān)性， 雖然ST4型的克羅諾桿菌沒有出現(xiàn)在加工環(huán)節(jié)中，但是卻在車間終產(chǎn)品中出現(xiàn)，這說明ST4 型的克羅諾桿菌是通過PIF的包裝環(huán)節(jié)污染產(chǎn)品的。
【主權(quán)項】
1. 一種嬰兒配方奶粉中克羅諾桿菌的溯源方法，其特征在于：利用多位點序列分型技 術(shù)，對市售PIF、PIF原料、半成品、成品及其加工環(huán)境的克羅諾桿菌進行分子分型研究，揭示 其種群特征，明確克羅諾桿菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并通過生物信息學(xué)對克羅諾桿菌進行系統(tǒng) 發(fā)育分析，從而系統(tǒng)的揭示上述環(huán)境中克羅諾桿菌的遺傳特征;在克羅諾桿菌MLST分型的 基礎(chǔ)上，以該致病菌的ST和環(huán)境來源為變量進行相關(guān)性分析，確定PIF加工過程中最易污染 克羅諾桿菌的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和分布規(guī)律，從而追溯嬰兒配方奶粉中克羅諾桿菌的來源。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟為： (1) 將從相同品牌相同批次的PIF、PIF原輔料、半成品、成品及其加工環(huán)境采集樣品中 得到的克羅諾桿菌，提取DNA，對提取的DNA的16SrRNA序列進行擴增，對得到的16SrRNA的 PCR產(chǎn)物進行基因測序，并將得到的序列在GENBANK數(shù)據(jù)庫中進行比對，完成分子鑒定； (2) 看家基因的特異性擴增:合成看家基因的引物，以克羅諾桿菌DNA為模板進行特異 性擴增； (3) 看家基因測序:將克羅諾桿菌看家基因的PCR產(chǎn)物測序，獲得克羅諾桿菌看家基因 的核酸序列； (4) 克羅諾桿菌MLST序列型的確定:登錄克羅諾桿菌MLST數(shù)據(jù)庫，對每株克羅諾桿菌的 看家基因等位基因進行序列查詢，獲得每株菌的等位基因號，并根據(jù)等位基因號確定克羅 諾桿菌最終的序列型； (5) 克羅諾桿菌的溯源分析:利用SPSS軟件，以分離自PIF加工環(huán)境的株克羅諾桿菌的 MLST序列型和加工過程關(guān)鍵控制點為變量進行相關(guān)性分析，得到克羅諾桿菌MLST序列型與 關(guān)鍵控制點之間的相關(guān)性，從而追溯克羅諾桿菌的污染源頭，確定克羅諾桿菌的污染途徑。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:具體步驟為： 1) 將從相同品牌相同批次的PIF、PIF原輔料、半成品、成品及其加工環(huán)境采集樣品中得 到的克羅諾桿菌，提取DNA，選取27-F和1492-R引物對提取的DNA的16SrRNA序列進行擴增， PCR擴增體系為 IO X rTaq Buf f er (含15mmoI/L MgCl2) 5 · OyL，dNTP(2 · 5mM)4 · OyL，模板 DNA2 · OyL，27-F1 · OyL，1492-R1 · OyL，Taq DNA聚合酶0 · 5yL，ddH2036 · 5yL;擴增條件為95°C 預(yù)變性5min，95°C變性lmin，58°C退火30s，72°C延伸lmin，循環(huán)30次，最后72°C延伸5min;利 用瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行驗證，并在UVP紫外呈相系統(tǒng)下觀察實驗結(jié)果；對 16SrRNA的PCR產(chǎn)物進行基因測序，選擇雙向測通，并將得到的序列在GENBANK數(shù)據(jù)庫中進行 比對，完成分子鑒定；其中27-F、1492-R引物序列見SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2; 2) 看家基因的特異性擴增:合成7對看家基因3七口0、作84、81]13、8]^13、87池、;[1^13和口口8八 的引物，引物序列見SEQ ID NO: 3-SEQ ID NO: 16,以克羅諾桿菌DNA為模板進行特異性擴 增，7對引物的PCR擴增體系和條件相同，PCR擴增體系為10 XrTaq Buffer(含15mmol/L MgC12)5.0yL，dNTP(2.5mM)4.0yL，模板DNA5.0yL，上游引物l.OyL，下游引物 1.0yL，Taq DNA 聚合酶1.0 yL，ddH2033. OyL;擴增條件為94°C預(yù)變性2min，94°C變性Imin，58°C退火Imin，72 °C延伸2min，循環(huán)30次，最后72°C延伸5min;PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗，并在 UVP紫外凝膠呈相系統(tǒng)下觀察記錄結(jié)果； 3) 看家基因測序:將克羅諾桿菌7對看家基因的PCR產(chǎn)物送樣、純化，單向測通，獲得克 羅諾桿菌7個看家基因的核酸序列； 4) 克羅諾桿菌MLST序列型的確定:登錄克羅諾桿菌MLST數(shù)據(jù)庫，對每株克羅諾桿菌的7 個等位基因進行序列查詢，獲得每株菌的等位基因號，并根據(jù)7個等位基因號確定克羅諾桿 菌最終的序列型； 5)克羅諾桿菌的溯源分析:利用SPSS軟件，以分離自PIF加工環(huán)境的克羅諾桿菌的MLST 序列型和加工過程關(guān)鍵控制點為變量進行相關(guān)性分析，得到克羅諾桿菌MLST序列型與關(guān)鍵 控制點之間的相關(guān)性，從而追溯克羅諾桿菌的污染源頭，確定克羅諾桿菌的污染途徑。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述加工過程關(guān)鍵控制點為原輔料、巴殺 濃縮后、噴霧干燥后、流化床出口、車間終產(chǎn)品。
【文檔編號】C12Q1/68GK105950744SQ201610382169
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月1日
【發(fā)明人】姜毓君, 滿朝新, 費鵬, 孫露宏, 潘瑞麗
【申請人】東北農(nóng)業(yè)大學(xué)