一種聚羧基甜菜堿基因轉(zhuǎn)染制劑及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本領(lǐng)域?qū)儆诨蜣D(zhuǎn)染試劑領(lǐng)域，涉及一種聚羧基甜菜堿基因轉(zhuǎn)染制劑及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]基因轉(zhuǎn)染是將具有生物功能的核酸分子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的作用位點(diǎn)，并使核酸在細(xì)胞內(nèi)維持其生物功能。由于自由的核酸分子在組織或細(xì)胞中易被核酶降解，組織靶向性差，且核酸分子自身帶有負(fù)電荷，細(xì)胞滲透能力差。開發(fā)具有選擇性、安全性和高效性的基因轉(zhuǎn)染試劑是核酸分子應(yīng)用的關(guān)鍵。目前，研究和臨床應(yīng)用中常用的載體大致分為病毒載體和非病毒載體兩類。病毒載體因其高效而倍受關(guān)注，但其負(fù)載量低、特異性不強(qiáng)、安全性差和無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等缺點(diǎn)，給實(shí)際應(yīng)用帶來很大障礙。
[0003]非病毒載體主要包括陽離子聚合物和陽離子脂質(zhì)體。陽離子聚合物和陽離子脂質(zhì)體基因載體相對于病毒載體具有一定優(yōu)勢，然而其負(fù)載核酸后表面仍然帶有正電荷，血清穩(wěn)定性差、細(xì)胞毒性大、轉(zhuǎn)染效率低，并且其在轉(zhuǎn)染過程中需要更換培養(yǎng)基，操作也比較復(fù)雜ο
[0004]如常用的商售陽離子脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?2000 (Invitrogen)和聚醚酰亞胺(PEI)具有良好的基因復(fù)合能力和內(nèi)涵體逃逸能力，但是其細(xì)胞毒性大(存活率〈50% )，在血清中穩(wěn)定性不好，因此轉(zhuǎn)染效率也較低，并且在轉(zhuǎn)染過程中需要更換培養(yǎng)基，操作也比較復(fù)雜。
[0005]CN 103194489 A公開了一種新型陽離子脂質(zhì)體核酸類藥物制劑，及其制備方法和應(yīng)用，所述陽離子脂質(zhì)體包含陽離子脂質(zhì)、輔助脂和聚羧基甜菜堿中性脂質(zhì)和冷凍保護(hù)劑。所述陽離子脂質(zhì)體核酸類藥物制劑包含用聚羧基甜菜堿中性脂質(zhì)修飾的陽離子脂質(zhì)體和核酸類藥物制劑工作液。在該專利中，所述聚羧基甜菜堿成分為聚羧基甜菜堿中性脂質(zhì)修飾的陽離子脂質(zhì)體，其必須含有陽離子脂質(zhì)、輔助脂等成分才能發(fā)揮作用，成分比較復(fù)雜，制備方法復(fù)雜。
[0006]因此，本領(lǐng)域中需要生物毒性小，在血清中穩(wěn)定，轉(zhuǎn)染效率更高并且操作簡單的基因轉(zhuǎn)染試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種聚羧基甜菜堿基因轉(zhuǎn)染制劑及其制備方法和用途。本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)染制劑具有優(yōu)異抗非特異性蛋白吸附性能和高基因轉(zhuǎn)染效率，并具有pH響應(yīng)性，具有顯著的血液穩(wěn)定性，顯著提高了核酸的基因轉(zhuǎn)染效率。
[0008]為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0009]第一方面，本發(fā)明提供一種基于聚羧基甜菜堿分子的基因轉(zhuǎn)染試劑，所述基因轉(zhuǎn)染試劑包含聚羧基甜菜堿聚合物、復(fù)合緩沖液和基因轉(zhuǎn)染工作液。
[0010]聚羧基甜菜堿聚合物的每個(gè)單體單元側(cè)鏈都有一個(gè)陰離子基團(tuán)(羧酸根基團(tuán))和一個(gè)陽離子基團(tuán)(季胺基團(tuán))并且總體表現(xiàn)中性。在酸性條件下，聚羧基甜菜堿分子的陰離子基團(tuán)(羧酸根基團(tuán))可以質(zhì)子化，使聚羧基甜菜堿帶有正電荷，可以利用靜電相互作用與負(fù)電荷的核酸作用，高效負(fù)載核酸分子形成復(fù)合物。當(dāng)復(fù)合物恢復(fù)生理?xiàng)l件下，聚羧基甜菜堿分子去質(zhì)子化使復(fù)合物表面接近中性，同時(shí)可利用陽離子和陰離子基團(tuán)與水分子的靜電相互作用吸附大量水分子，在復(fù)合物表面形成水合層，有效抵抗非特異性蛋白質(zhì)，具有顯著的血液穩(wěn)定性，從而顯著提高核酸的基因轉(zhuǎn)染效率。
[0011]優(yōu)選地，所述聚羧基甜菜堿聚合物為R_PCBn，所述R為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、1，2-油?；字Ｒ掖及?DOPE)、1，2-十八?；?sn_甘油(DG)、膽固醇、α -十六烷基丙三醇醚(HGn)、2-溴異丁酸乙酯(EBiB)、1-溴乙基苯(l_PEBr)、2_溴-2-甲二硫代苯甲酸枯酯(CBD)、三硫代碳酸酯(TTC)或二硫代苯甲酸氰基異丙酯(CPDB)中的任意一種，優(yōu)選為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、2-溴異丁酸乙酯(EBiB)或2-溴-2-甲二硫代苯甲酸枯酯(CBD)中的任意一種，進(jìn)一步優(yōu)選為2-溴-2-甲二硫代苯甲酸枯酯(CBD);
[0012]優(yōu)選地，所述聚羧基甜菜堿聚合物的聚合度η為1?500的任意整數(shù)，例如，聚合度 η 可以為 2、4、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、38、40、44、48、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、480 或 490，優(yōu)選為 1 ?100 的任意整數(shù)，進(jìn)一步優(yōu)選為5?50的任意整數(shù)，更優(yōu)選為10?30的任意整數(shù)。
[0013]優(yōu)選地，所述復(fù)合緩沖液為pH值小于7.4的緩沖液，例如pH值為7.2,7.0,6.8、6.5、6.2、6.0、5.8、5.6、5.5、5.2、5.0、4.8、4.5、4.3、4.0、3.7、3.5、3.2、3.0、2.8、2.6、2.4 或2.0的緩沖液，優(yōu)選為pH值為2?7的緩沖液，進(jìn)一步優(yōu)選為pH值為2?6的緩沖液，更優(yōu)選為pH值為3?5的緩沖液。
[0014]優(yōu)選地，所述復(fù)合緩沖液為甘氨酸-鹽酸緩沖液、鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液或硼酸-硼砂緩沖液中的任意一種，優(yōu)選為甘氨酸-鹽酸緩沖液、檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液或Tris-鹽酸緩沖液中的任意一種，進(jìn)一步優(yōu)選為乙酸-乙酸鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液或Tris-鹽酸緩沖液中的任意一種，更優(yōu)選為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液。
[0015]優(yōu)選地，所述基因轉(zhuǎn)染工作液為超純水、磷酸鹽緩沖液(PBS)或生理鹽水中的任意一種或至少兩種的組合，進(jìn)一步優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液(PBS)和/或生理鹽水，更優(yōu)選為生理鹽水。
[0016]優(yōu)選地，所述聚羧基甜菜堿聚合物:復(fù)合緩沖液=lmg: (0.1?100)mL，例如所述聚羧基甜菜堿聚合物:復(fù)合緩沖液可以為lmg:0.lmL、lmg:0.3mL、lmg:0.5mL、lmg:0.8mL、lmg:lmL、lmg:1.5mL、lmg:2mL、lmg:3mL、lmg:4mL、lmg:5mL、lmg: 10mL、lmg:20mL、lmg:30mL、lmg:40mL、lmg:50mL、lmg:60mL、lmg:70mL、lmg:80mL、lmg:90mL 或 lmg:100mL，優(yōu)選為 lmg: (0.5 ?50) mL，更優(yōu)選為 lmg: (0.5 ?5)mL。
[0017]優(yōu)選地，所述復(fù)合緩沖液:基因轉(zhuǎn)染工作液=lmL: (0.1?100)mL，例如所述復(fù)合緩沖液:基因轉(zhuǎn)染工作液可以為 lmL:0.lmLUmL:0.3mL、lmL:0.5mL、lmL:0.8mL、lmL:lmL、lmL:1.5mL、lmL:2mL、lmL:3mL、lmL:4mL、lmL:5mL、lmL:8mL、lmL: 10mL、lmL:20mL、lmL:30mL、lmL:40mL、lmL:50mL、lmL:60mL、lmL:70mL、lmL:80mL、lmL:90mL 或 lmL:100mL，進(jìn)一步優(yōu)選為lmL: (0.1?50) mL，更優(yōu)選為lmL: (2?10) mL。
[0018]第二方面，本發(fā)明提供一種聚羧基甜菜堿基因轉(zhuǎn)染制劑，所述基因轉(zhuǎn)染制劑包含第一方面所述的基因轉(zhuǎn)染試劑和待轉(zhuǎn)染的核酸；
[0019]優(yōu)選地，所述基因轉(zhuǎn)染制劑中聚羧基甜菜堿聚合物與待轉(zhuǎn)染的核酸的N/P比為(0.1 ?100):1，例如 0.1:1、0.2:1、0.5:1、0.8:1、1:1、2:1、5:1、8:1、10:1、13:1、15:1、18:1、20:1、25:1、28:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1 或 100:1，優(yōu)選為(0.2 ?30):1，更優(yōu)選為(0.5 ?20):lo
[0020]第三方面，本發(fā)明提供了如第二方面所述的聚羧基甜菜堿基因轉(zhuǎn)染制劑的制備方法，所述方法包括以下步驟:
[0021](1)將聚羧基甜菜堿聚合物與復(fù)合緩沖液混溶得到共混溶液；
[0022](2)將步驟⑴得到的共混溶液與有待轉(zhuǎn)染的核酸分子復(fù)合形成復(fù)合液；
[0023