一種檢測(cè)魚腥藻磷代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量引物及應(yīng)用與方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種檢測(cè)魚腥藻FACHB-1299憐代謝相關(guān)酶 基因表達(dá)量引物及應(yīng)用與方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 藍(lán)藻是一類古老的具有放氧光合作用的革蘭氏陰性細(xì)菌，在漫長(zhǎng)的自然選擇過(guò)程 中進(jìn)化出獨(dú)特的環(huán)境適應(yīng)能力，廣泛分布于不同的生境中。藍(lán)藻對(duì)不利的環(huán)境因子，如溫度 變化、營(yíng)養(yǎng)（如氮源和憐源等）缺乏、氧化脅迫等，產(chǎn)生的特異性應(yīng)答反應(yīng)是藍(lán)藻適應(yīng)多變 的環(huán)境、提高藍(lán)藻的生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的重要途徑之一。因此，藍(lán)藻對(duì)不同的環(huán)境因子產(chǎn)生特異 性應(yīng)答反應(yīng)的機(jī)制成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，并嘗試?yán)盟{(lán)藻細(xì)胞對(duì)重要的環(huán)境因子產(chǎn)生特異 性的應(yīng)答反應(yīng)的生物學(xué)特性監(jiān)測(cè)藍(lán)藻水華發(fā)生。
[0003] 憐是藍(lán)藻細(xì)胞膜與細(xì)胞核核酸的主要組成成分，同時(shí)又是細(xì)胞中高能化合物ATP、 ADP的基本組成元素，在能量傳遞和轉(zhuǎn)化中起著重要作用。水體中憐通常是藍(lán)藻生長(zhǎng)的限制 性營(yíng)養(yǎng)成分。在憐饑餓條件下，為滿足自身生命活動(dòng)對(duì)憐的需求，機(jī)體會(huì)增加憐的吸收，在 分子水平上，無(wú)機(jī)憐饑餓脅迫將誘導(dǎo)憐饑餓誘導(dǎo)基因的表達(dá)，運(yùn)些基因包括一系列參與轉(zhuǎn) 運(yùn)Pi、含憐復(fù)合物的蛋白基因W及參與憐代謝的蛋白基因，如憐酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶基因PStl和 堿性憐酸酶基因地oA-1化e。
[0004] 由于水體中的憐元素可WW各種有機(jī)或無(wú)機(jī)，溶解或顆粒物的形式出現(xiàn)，所W測(cè) 定水體生物有效態(tài)的憐對(duì)水質(zhì)富營(yíng)養(yǎng)化程度監(jiān)測(cè)和藻華爆發(fā)預(yù)警有重要意義。傳統(tǒng)上許多 國(guó)家往往從化學(xué)分析的角度評(píng)估水質(zhì)和水生態(tài)健康狀況。化學(xué)分析方法通過(guò)復(fù)雜的儀器設(shè) 備理論上可W快速而靈敏地監(jiān)測(cè)任何化學(xué)物質(zhì)，但是運(yùn)些儀器分析技術(shù)并不能測(cè)定化合物 的生物危害和生物有效性。采用生物檢測(cè)技術(shù)具有多方面的優(yōu)勢(shì)：首先生物檢測(cè)技術(shù)可W 提供污染的前期預(yù)警，從而采取補(bǔ)救措施避免污染；此外，生物方法還可W幫助評(píng)估化合物 在復(fù)合污染情況下的生物效應(yīng)。
[0005]目前國(guó)際上尚沒(méi)有利用生物方法檢測(cè)生物有效憐的相關(guān)專利，不過(guò)國(guó)外已經(jīng)有人 采用基于堿性憐酸酶的方法來(lái)評(píng)估水體中的生物有效憐。堿性憐酸酶是一類可W將水中含 憐的有機(jī)分子水解并釋放出可W吸收形態(tài)憐的胞外酶，基于堿性憐酸酶的憐含量測(cè)定方法 是利用紫外分光光度法通過(guò)測(cè)定堿性憐酸酶的酶活性來(lái)確定憐含量，運(yùn)種方法有效但是相 對(duì)繁瑣而且費(fèi)時(shí)。因此，通過(guò)對(duì)本±藻類物種的生長(zhǎng)過(guò)程進(jìn)行研究，開(kāi)發(fā)基于憐代謝相關(guān)酶 基因相對(duì)表達(dá)量獲得水體生物有效憐含量的測(cè)定方法，利用本±藻類物種從分子生物學(xué)水 平對(duì)水體生物有效憐含量進(jìn)行測(cè)定，將為我國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)和管理部口在水體富營(yíng)養(yǎng)化監(jiān)測(cè)與 水華爆發(fā)預(yù)警等領(lǐng)域的科技應(yīng)用和技術(shù)提升提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 1、發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題
[0007] 為了解決目前國(guó)際上尚沒(méi)有很好地利用生物方法檢測(cè)生物有效憐的相關(guān)專利，而 且已有的基于堿性憐酸酶活性測(cè)定的方法來(lái)評(píng)估水體中的生物有效憐相對(duì)繁瑣而費(fèi)時(shí)的 問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種通過(guò)檢測(cè)本±藻類物種魚腥藻FACHB-1299憐代謝相關(guān)酶基因表 達(dá)量來(lái)獲得水體生物有效憐含量的分子生物學(xué)測(cè)定方法。
[000引 2、技術(shù)方案
[0009] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0010] 一種檢測(cè)魚腥藻憐代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量的引物，為W下兩對(duì)引物中的一對(duì)或兩 對(duì)，其中一對(duì)引物用于檢測(cè)憐酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶基因pstl，該引物的上游序列如序列表SeqID No. 1所示，下游序列如序列表SeqIDNo. 2所示，PStl基因的DNA序列如序列表SeqID No. 5所示；另一對(duì)引物用于檢測(cè)堿性憐酸酶基因地oA-1化e，該引物的上游序列如序列表 SeqIDNo. 3所示，下游序列如序列表SeqIDNo. 4所示，phoA-like基因的DNA序列如序 列表SeqIDNo.6所示；
[0015] 本發(fā)明還提供了該檢測(cè)魚腥藻憐代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量的引物的應(yīng)用，該引物可 W用于測(cè)定水體生物的有效憐含量，測(cè)得的水體生物有效憐含量可用于監(jiān)測(cè)水質(zhì)富營(yíng)養(yǎng)化 程度從而加強(qiáng)藻華爆發(fā)預(yù)警。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種通過(guò)檢測(cè)魚腥藻憐代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量來(lái)測(cè)定水體生物 有效憐含量的方法，具體包括如下步驟：
[0017] 步驟一：培養(yǎng)在環(huán)境樣品中生長(zhǎng)，并在0. 05,0. 25,0. 5,1，2mg/L五個(gè)不同憐濃度 梯度下馴化的魚腥藻，；
[001引步驟二：提取魚腥藻樣品的RNA，反轉(zhuǎn)錄為CDNA;
[0019] 步驟S:將步驟二所得CDNA梯度稀釋后作為標(biāo)準(zhǔn)模板，W引物為引導(dǎo)進(jìn)行實(shí)時(shí)巧 光定量PCR，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，設(shè)置闊值；
[0020] 步驟四：W待測(cè)環(huán)境樣品的CDNA為模板，對(duì)內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光定量PCR擴(kuò)增， 獲得相應(yīng)的Ct值，計(jì)算內(nèi)參基因的表達(dá)量2&AU,用于后續(xù)待檢測(cè)水體生物樣品CDNA濃度 的校正；
[0021] 步驟五：利用引物與步驟四同時(shí)對(duì)待檢測(cè)環(huán)境樣品的CDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光定量PCR 擴(kuò)增，根據(jù)反應(yīng)結(jié)果確定環(huán)境樣品對(duì)應(yīng)的Ct值；
[0022] 步驟六：W2 法計(jì)算憐代謝相關(guān)酶基因的相對(duì)表達(dá)量，憐濃度W2為底數(shù)取對(duì) 數(shù)值作為X，憐代謝相關(guān)酶基因相對(duì)表達(dá)量W10為底數(shù)取對(duì)數(shù)值作為y，作xy曲線圖，并畫 對(duì)數(shù)趨勢(shì)線，獲得對(duì)數(shù)趨勢(shì)線公式及R值；
[0023] 步驟屯：將環(huán)境樣品的憐代謝相關(guān)酶基因相對(duì)表達(dá)量W 10為底數(shù)取對(duì)數(shù)值作為y 代入公式，獲得X，W2為底數(shù)取指數(shù)值得到環(huán)境樣品中生物有效憐含量。
[0024] 進(jìn)一步地，通過(guò)檢測(cè)魚腥藻憐代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量來(lái)測(cè)定水體生物有效憐含量 的方法中的引物為用于檢測(cè)憐酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶基因PStl的引物和/或用于檢測(cè)堿性憐酸酶 基因地oA-1化e的引物。
[00巧]進(jìn)一步地，通過(guò)檢測(cè)魚腥藻憐代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量來(lái)測(cè)定水體生物有效憐含量 的方法步驟四中的內(nèi)參基因?yàn)?6S，擴(kuò)增內(nèi)參基因的引物序列如序列表SeqIDNo.7-8所 示：
[0028] 進(jìn)一步地，通過(guò)檢測(cè)魚腥藻憐代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量來(lái)測(cè)定水體生物有效憐含量 的方法步驟一中的不同憐濃度梯度為0. 05,0. 25,0. 5,l，2mg/L五個(gè)梯度。
[0029] 本發(fā)明還提供了一種通過(guò)檢測(cè)魚腥藻的憐代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量來(lái)測(cè)定水體生 物有效憐含量的試劑盒，包括檢測(cè)用引物、巧光定量PCR混合液，其特征在于，所述引物包 括：
[0036] 進(jìn)一步地，本發(fā)明試劑盒的反應(yīng)是在Applied Biosybkn-柄！St巧化e實(shí)時(shí)巧光定 量PCR儀上進(jìn)行的；反應(yīng)體系為：2 XMaster Mix IOy L含有化g/y L魚腥藻cDNA模板 2 y L 0. 2mmol/L引物0. 4 y L加滅菌超純水至20 y L ;實(shí)時(shí)巧光定量PCR反應(yīng)的擴(kuò)增程序 為：95°C 15s，60°C Imin,再?gòu)?5°C連續(xù)升溫至95°C，每升高0. 3°C收集巧光1次，最后降溫 至40°C ;最后，在AppliedBiosyste!化、皮的Step One Software軟件中2. Ivision自動(dòng)生成 擴(kuò)增產(chǎn)物的烙解曲線。
[0037] 3、有益效果
[0038] (1)本發(fā)明采用生物檢測(cè)技術(shù)可W提供污染的前期預(yù)警，從而采取補(bǔ)救措施避免 污染；
[0039] (2)本發(fā)明所采用的生物檢測(cè)技術(shù)可W幫助評(píng)估化合物在復(fù)合污染情況下的生物 效應(yīng)；
[0040] (3)本發(fā)明的技術(shù)可W測(cè)定水體中生物有效態(tài)的憐，通過(guò)水體生物有效憐含量來(lái) 監(jiān)測(cè)水質(zhì)富營(yíng)養(yǎng)化程度，運(yùn)對(duì)藻華爆發(fā)預(yù)警有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0041] 圖1為憐濃度W 2為底數(shù)取對(duì)數(shù)值作為x，pstl基因相對(duì)表達(dá)量W 10為底數(shù)取對(duì) 數(shù)值作為y的對(duì)數(shù)趨勢(shì)線。
[0042] 圖2為憐濃度W 2為底數(shù)取對(duì)數(shù)值作為X，phoA-like基因相對(duì)表達(dá)量W 10為底 數(shù)取對(duì)數(shù)值作為y的對(duì)數(shù)趨勢(shì)線。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 下面結(jié)合說(shuō)明書附圖對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造作進(jìn)一步說(shuō)明。下述實(shí)施方法中的實(shí)驗(yàn)方法均 為常規(guī)方法，所設(shè)及實(shí)驗(yàn)材料均為常規(guī)生化試劑。
[0044] 實(shí)施例I:
[0045] 本發(fā)明的具體操作如下：
[0046] 1.材料與方法
[0047] 1. 1供試材料：
[0048]W常用采水器采集水樣比，用0. 45ym微孔濾膜過(guò)濾，除去藻類和細(xì)菌，高溫高壓 滅菌采集得到環(huán)境樣品；
[0049] 所用純?cè)宸N購(gòu)買于武漢中科院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)，系統(tǒng)編號(hào)為 FACHB-1299,所用培養(yǎng)基為BGll(成分見(jiàn)下表）
[005。將純?cè)宸N從試管轉(zhuǎn)入滅過(guò)菌的小S角瓶中（20-50血)，轉(zhuǎn)接2/3藻種，轉(zhuǎn)接時(shí)藻 液：培養(yǎng)基為1 : 2。放置到光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為25°C，光照強(qiáng)度為2000LUX，周期為1化晝1化夜。培養(yǎng)二周左右。二周后觀察，如生長(zhǎng)較好后，再次進(jìn)行轉(zhuǎn)接，比例為1: 5至 1:6擴(kuò)大培養(yǎng)，得到所用藻液。
[0052] 將生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（0〇72。二0.8~1. 0)的魚腥藻FACHB-1299細(xì)胞W6000巧m， 離屯、Smin收集，然后用BGll-Pi洗兩遍，再重懸在相同的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，使培養(yǎng)物的終 濃度伽72。）為0. 05,W等摩爾的KCl替代K2HPO4,培養(yǎng)條件為：溫度為25°C，光照強(qiáng)度為 2000LUX，周期為1化晝1化夜。將缺憐培養(yǎng)至第3天的魚腥藻FACHB-1299W6000巧m，離 屯、Smin收集，分別轉(zhuǎn)至環(huán)境樣品和不同憐濃度梯度培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其中包括0. 05,0. 25， 0. 5,1，2mg/L五個(gè)憐濃度梯度，培養(yǎng)條件為：溫度為25°C，光照強(qiáng)度為2000LUX，周期為12h 晝1化夜。生長(zhǎng)2小時(shí)后將魚腥藻FACHB-1299細(xì)胞W6000巧m，離屯、Smin收集。
[005引 1. 2試驗(yàn)方法：
[0054] 1. 2. 1 總RNA的提取
[00巧]按照試劑盒說(shuō)明書提取不同憐濃度下培養(yǎng)的魚腥藻FACHB-1299樣品的RNA。用核 酸蛋白紫外分析儀檢測(cè)A260/A280的比值W鑒定RNA抽提質(zhì)量，1. 8《A260/A280《2. 0， 表明總RNA質(zhì)量較好，同時(shí)測(cè)定其標(biāo)