脫乙酰幾丁質(zhì)/羧甲基纖維素干細(xì)胞微囊及制備培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微囊化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種脫乙酷幾下質(zhì)/簇甲基纖維 素干細(xì)胞微囊及制備培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 微膠囊本身是一種把分散的固體物質(zhì)、液滴或氣體包封在一層致密膜中形成的包 覆體復(fù)合結(jié)構(gòu)，用于包覆的致密膜通常是由天然或合成高分子材料制成。由于其具有上述 包覆的微囊按結(jié)構(gòu)，其功能應(yīng)用中可W將酶、輔酶、蛋白質(zhì)等生物大分子或動植物細(xì)胞包圍 在珠狀的微囊里，而小分子的物質(zhì)、培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)可W自由出入半透膜，達(dá)到便于催化 或培養(yǎng)的目的，所W微囊經(jīng)常被用于細(xì)胞=維培養(yǎng)，即微囊化細(xì)胞培養(yǎng)。
[0003] 微囊化細(xì)胞培養(yǎng)中采用微囊的親水性半透膜將細(xì)胞包圍在珠狀的微囊里，細(xì)胞不 會溢出，同時(shí)小分子物質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)可W自由出入半透膜；囊內(nèi)用作為細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境，與 液體培養(yǎng)相似，能保護(hù)細(xì)胞少受損傷，故相比其他的微珠載體、支架等常規(guī)的=維培養(yǎng)方式 細(xì)胞生長好、密度高。
[0004] 目前微囊化細(xì)胞培養(yǎng)中，包膜材料最通常采用的是海藻酸鋼/聚賴氨酸微膠囊； 其中，海藻酸鋼是屬于從海洋的褐藻中提取的直鏈陰離子多糖，具有良好的生物相容性，并 且其分子結(jié)構(gòu)孔隙和穩(wěn)定性都比較好，所W其在具有力學(xué)骨架長期穩(wěn)定優(yōu)勢的條件下，非 常適合于被用作微囊的半透膜骨架，既具有良好的生物相容性，又能保持良好的通透性。聚 賴氨酸是人工合成的陽離子聚合物，在水相中與陰離子海藻酸鋼混合時(shí)，兩者的陰、陽離子 發(fā)生快速反應(yīng)交聯(lián)成厚約20~100ym半透膜的微膠囊。
[0005] 但是，上述海藻酸鋼/聚賴氨酸微膠囊在用作為藥物緩釋、祀向釋放控制、或者是 一些活性成分保護(hù)中，基本上能較好地滿足使用的要求。但是在作為干細(xì)胞培養(yǎng)載體使用 時(shí)，海藻酸鋼與聚賴氨酸之間的陰、陽離子化學(xué)結(jié)合，易被培養(yǎng)液成分破壞而導(dǎo)致包膜破 碎，并且還容易引起微囊周纖維化反應(yīng)。因此微囊內(nèi)不能形成較好的細(xì)胞生長環(huán)境，細(xì)胞培 養(yǎng)擴(kuò)增效率較低、形成的凝膠珠硬度較高，不利于干細(xì)胞的培養(yǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明實(shí)施的目的在于克服現(xiàn)有海藻酸鋼/聚賴氨酸微膠囊的缺陷，提供一種脫 乙酷幾下質(zhì)/簇甲基纖維素干細(xì)胞微囊及其制備和培養(yǎng)方法。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下：
[0008] 一種脫乙酷幾下質(zhì)/簇甲基纖維素干細(xì)胞微囊的制備方法，方法步驟包括：
[0009] 獲取簇甲基纖維素和脫乙酷幾下質(zhì)；
[0010] 將所述簇甲基纖維素用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1~2%的醋酸分散后，加入至化Clz溶液中 進(jìn)行凝膠化，形成簇甲基纖維素凝膠；
[0011] 將所述脫乙酷幾下質(zhì)用醋酸鹽緩沖液分散后，再加入待培養(yǎng)的干細(xì)胞，制成脫乙 酷幾下質(zhì)和細(xì)胞的混合懸液；
[0012] 將所述混合懸液加入至簇甲基纖維素凝膠中進(jìn)行凝聚交聯(lián)，并將凝聚交聯(lián)后的得 到微囊用巧樣酸鋼溶液進(jìn)行浸泡處理。
[0013] 本發(fā)明進(jìn)一步還提出采用上述方法直接制備得到的脫乙酷幾下質(zhì)/簇甲基纖維 素干細(xì)胞微囊。
[0014] 本發(fā)明相比海藻酸鋼/聚賴氨酸的微囊，W脫乙酷幾下質(zhì)和簇甲基纖維素作為壁 材，通過復(fù)凝聚法形成通透性和分散性比較均一的微囊包膜。先通過異種電荷靜電吸附結(jié) 合，同時(shí)脫乙酷幾下質(zhì)的吸附能力也增強(qiáng)了形成包膜的穩(wěn)定性和強(qiáng)度。并且，運(yùn)兩者分子 結(jié)構(gòu)上都是經(jīng)過基團(tuán)修飾的分子聚合物，都具有非常多的氨基、酸鍵等活性結(jié)構(gòu)，在結(jié)合之 后包膜分子內(nèi)部還能進(jìn)一步增加更多的氨鍵及分子間作用力；所W在原有靜電結(jié)合的基礎(chǔ) 上，能夠形成更加復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)，大大增強(qiáng)了包膜的抗機(jī)械、耐熱等方面的性能，在浸滯 于培養(yǎng)液中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，相對能提供更加穩(wěn)定的細(xì)胞生長環(huán)境。使最終形成的包膜比 海藻酸鋼與聚賴氨酸之間的陰、陽離子化學(xué)結(jié)合要強(qiáng)得多；并且兩者都是聚合多糖，相互之 間融合性較為優(yōu)良，不會形成微囊周纖維化反應(yīng)。
[0015] 同時(shí)，本發(fā)明還提出用上述微囊進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的方法，方法過程包括：將脫乙酷幾 下質(zhì)/簇甲基纖維素干細(xì)胞微囊于培養(yǎng)容器中進(jìn)行大量培養(yǎng)。
[0016] 采用本發(fā)明的上述培養(yǎng)方法，細(xì)胞具有更好的生長和代謝的環(huán)境，微囊包膜具有 良好的溶脹、縮脹等性能，用于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)其透性和穩(wěn)定性上更好一些，能形成較好的細(xì)胞 生長環(huán)境，提升細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增的效率。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，W下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0018] 本發(fā)明實(shí)例提出一種脫乙酷幾下質(zhì)/簇甲基纖維素干細(xì)胞微囊的制備方法，步驟 包括：
[0019] S10,獲取簇甲基纖維素和脫乙酷幾下質(zhì)；
[0020] S20,將簇甲基纖維素用1~2%的醋酸分散，制成簇甲基纖維素溶液，并加入至 化Clz溶液中進(jìn)行凝膠化，形成簇甲基纖維素凝膠；
[0021] S30,將脫乙酷幾下質(zhì)用醋酸鹽緩沖液分散后，再加入待培養(yǎng)的干細(xì)胞，制成脫乙 酷幾下質(zhì)和細(xì)胞的混合懸液；
[0022] S40,將脫乙酷幾下質(zhì)和細(xì)胞的混合懸液加入至簇甲基纖維素凝膠中進(jìn)行凝聚交 聯(lián)，并將交聯(lián)后的得到微球置于巧樣酸鋼溶液中進(jìn)行浸滯處理，即可得到本發(fā)明的脫乙酷 幾下質(zhì)/簇甲基纖維素干細(xì)胞微囊。
[0023] 本發(fā)明相比海藻酸鋼/聚賴氨酸的微囊，W脫乙酷幾下質(zhì)和簇甲基纖維素作為壁 材，通過復(fù)凝聚法形成通透性和分散性比較均一的微囊包膜。脫乙酷幾下質(zhì)是將幾下質(zhì)進(jìn) 行脫乙酷基后形成的，是具有大量正電荷基團(tuán)的的動物纖維素；其結(jié)構(gòu)與植物纖維素非常 相似，都是六碳糖的多聚體，分子量都在100萬W上；并且由于它的分子結(jié)構(gòu)中帶有不飽和 的陽離子基團(tuán)，因而對帶負(fù)電荷的同類物質(zhì)具有強(qiáng)大的吸附作用；簇甲基纖維素是纖維素 酸化（簇甲基化反應(yīng)是酸化技術(shù)的一種）之后形成的陰離子型纖維素酸，具有較高的取代 度和取代均勻度；由于兩者分別帶有不同的電性，可W先通過異種電荷靜電吸附結(jié)合，并且 脫乙酷幾下質(zhì)的吸附能力也增強(qiáng)了形成包膜的穩(wěn)定性和強(qiáng)度。
[0024] 并且，運(yùn)兩者分子結(jié)構(gòu)上都是經(jīng)過基團(tuán)修飾的分子聚合物，都具有非常多的氨基、 酸鍵等活性結(jié)構(gòu)，在結(jié)合之后包膜分子內(nèi)部還能進(jìn)一步增加更多的氨鍵及分子間作用力； 所W原有靜電結(jié)合的基礎(chǔ)上，能夠形成更加復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)，大大增強(qiáng)了包膜的抗機(jī)械、耐 熱等方面的性能，在浸滯于培養(yǎng)液中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，相對能提供更加穩(wěn)定的細(xì)胞生長環(huán) 境。因此，最終形成的包膜比海藻酸鋼與聚賴氨酸之間的陰、陽離子化學(xué)結(jié)合要強(qiáng)得多；并 且兩者都是聚合多糖，相互之間融合性較為優(yōu)良，不會形成微囊周纖維化反應(yīng)。
[00巧]基于本案中優(yōu)選的實(shí)施方式中，上述步驟SlO中獲取的物料中，脫乙酷幾下質(zhì)采 用脫乙酷度90%W上的脫乙酷幾下質(zhì)進(jìn)行，除了在可溶性上比較好之外，更主要地是不飽 和陽性基團(tuán)密度更大一些，運(yùn)樣相比吸附性更強(qiáng)一些。
[00%] 同時(shí)步驟S20中對簇甲基纖維素用Ca2+進(jìn)行凝膠化的過程中，離子強(qiáng)度除了會影 響凝聚的程度之外，Ca2+本身還有促進(jìn)簇甲基纖維素和脫乙酷幾下質(zhì)之間交聯(lián)結(jié)合的功能； 如果濃度進(jìn)一步增大，后續(xù)形成的微囊包膜的硬度比較大，縮脹性能和初性不足，會影響微 囊的品質(zhì)。所W在實(shí)施的過程中，按照形成簇甲基纖維素凝膠中質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1~3%的 化Clz濃度進(jìn)行，比如要制備IOOmL的簇甲基纖維素凝膠液，可W采用50mL的1~2%的醋 酸分散簇甲基纖維素，另用50mL制備質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)2~6%的化Cl2,然后將運(yùn)兩者混合， 混合之后形成凝膠原液，凝膠原液中化Clz終濃度則為所要求的1~3%質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)。
[0027] 在制備的過程中，步驟S40中的簇甲基纖維素已經(jīng)是凝膠的形態(tài)，所W細(xì)胞懸液 的加入不能采用表面滴加的方式進(jìn)行，而只能采用針頭注射的方式進(jìn)行。通過注射針頭將 懸液加入至凝膠內(nèi)，那么在接觸的表面上兩者結(jié)合之后就會相互結(jié)合并固化形成包膜。
[0028] 同時(shí)，進(jìn)一步為了保證形成微囊之后，細(xì)胞能具有相對比較適合的生長和擴(kuò)增的 能力，步驟S30制備的混合懸液中優(yōu)選細(xì)胞與脫乙酷幾下質(zhì)的混合懸液中干細(xì)胞的濃度控 制0. 5~2XIO7個(gè)/mL。微囊內(nèi)包覆的細(xì)胞密度過低，在培養(yǎng)的過程中比較難W快速生長 增殖；而如果過高，本身微囊內(nèi)的空間有限，細(xì)胞之間的空間和養(yǎng)料競爭加劇，位置處于