一種高產(chǎn)普魯蘭酶的重組短小芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)普魯蘭酶的重組短小芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于基因工程和酶 工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 普魯蘭酶是一種能夠水解普魯蘭多糖、支鏈淀粉、a-極限糊精等分子中的 a-1，6葡萄糖苷鍵的淀粉脫支酶。由于糖化酶等對(duì)糊精中的a-1，6-糖苷鍵水解效率很 低，往往導(dǎo)致反應(yīng)時(shí)間較長、副產(chǎn)物較多等問題。而普魯蘭酶能快速切割糊精中的分支點(diǎn)， 與糖化酶協(xié)同作用，可大幅度縮短反應(yīng)時(shí)間，提高原料的轉(zhuǎn)化率。因此被廣泛應(yīng)用于葡萄 糖、果糖、麥芽糖、麥芽糊精、低聚糖等產(chǎn)品的生產(chǎn)中。
[0003] 近年來，對(duì)于普魯蘭酶的開發(fā)已經(jīng)成為了研究熱點(diǎn)。然而，大部分的研究局限于 在大腸桿菌中表達(dá)。由于大腸桿菌是一種條件性致病菌，這就極大地限制了普魯蘭酶在 食品工業(yè)中的應(yīng)用。雖然也有一些研究者將普魯蘭酶在非致病菌中進(jìn)行表達(dá)，但表達(dá)量 都很低。例如，張艷等將Bacillusnaganoensis來源的普魯蘭酶克隆于枯草芽孢桿菌 中，酶活為10. 94U/mL，再經(jīng)劉逸寒等發(fā)酵優(yōu)化，酶活為20. 16U/mL;謝銀珠等將Bacillus deramificans來源的普魯蘭酶克隆于地衣芽孢桿菌中，經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化，酶活為1. 5ASPU/mL。 因此，實(shí)現(xiàn)普魯蘭酶在非致病菌中過量表達(dá)，對(duì)普魯蘭酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用具有重大意 義。
[0004] 短小芽孢桿菌作為一種宿主菌表達(dá)異源蛋白，近年來受到了研究者的關(guān)注。首 先，它是一種非致病菌，可應(yīng)用于食品工業(yè)；其次，它能過量合成活性異源蛋白，表達(dá)量可達(dá) lmg/mL以上；再次，它屬于革蘭氏陽性菌，只有一層細(xì)胞膜，蛋白的胞外分泌良好。此外，它 還有培養(yǎng)條件簡單，生長周期較短等優(yōu)點(diǎn)，非常適合于表達(dá)普魯蘭酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種高產(chǎn)普魯蘭酶的重組短小芽孢桿菌。
[0006] 所述重組菌以短小芽孢桿菌為宿主，通過重組質(zhì)粒pulA/pSVEB表達(dá)來源于脫支 芽孢桿菌的普魯蘭酶突變體。
[0007] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述普魯蘭酶是來源于脫支芽孢桿菌的普魯蘭酶 (GenBank號(hào)為AX203845)的突變體。本發(fā)明以普魯蘭酶突變體為例進(jìn)行說明，保護(hù)范圍不 限于此。
[0008] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述短小芽孢桿菌宿主為Brevibacillusbrevis CCTCCAB94025。
[0009] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組質(zhì)粒pulA/pSVEB是將缺失了啟動(dòng)子和信 號(hào)肽的PWB980、普魯蘭酶表達(dá)元件、缺失了信號(hào)肽的pET20b(+)連接成環(huán)得到的；所述普魯 蘭酶表達(dá)元件包括來源于短小芽孢桿菌的外壁蛋白啟動(dòng)子P2、外壁蛋白信號(hào)肽和來源于脫 支芽孢桿菌的普魯蘭酶突變體基因。
[0010] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述普魯蘭酶突變體的基因序列與CN201310610426. 4中構(gòu)建的D437H/D503Y/d2突變體的序列一致，為N端的CBM41和X25兩個(gè) 結(jié)構(gòu)域刪除了的且發(fā)生了D437H和D503Y突變的突變體。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述普魯蘭酶表達(dá)元件的核苷酸序列如SEQID NO. 1所示。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組質(zhì)粒pulA/pSVEB的核苷酸序列是按照 PWB980缺失啟動(dòng)子和信號(hào)肽后的序列、普魯蘭酶表達(dá)元件序列、pET20b(+)缺失信號(hào)肽后 的序列，這樣的方式進(jìn)行連接成環(huán)得到的。
[0013] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組質(zhì)粒pulA/pSVEB的具體構(gòu)建方法如下：
[0014] (1)合成核苷酸序列如SEQIDN0. 2所示的DNA片斷；
[0015] (2)用NdeI和NcoI雙酶切在pET-20b(+)基礎(chǔ)上構(gòu)建的表達(dá)D437H/D503Y/d2 突變體的重組質(zhì)粒（一種分泌效率和熱穩(wěn)定性提高的普魯蘭酶突變體及其制備方法.CN 201310610426. 4)，得到含有普魯蘭酶突變體基因pulA和去除pelB信號(hào)肽的pET20b(+)的 DNA片斷；
[0016] (3)以核苷酸序列如SEQIDN0. 3、SEQIDN0. 4所示的引物PI、P2擴(kuò)增pWB980， 得到缺失了P43啟動(dòng)子序列和信號(hào)肽序列的pWB980片斷；
[0017] (4)使用In-Fusion酶將步驟（1)、（2)、⑶得到的片段進(jìn)行連接，篩選即得到重 組質(zhì)粒pulA/pSVEB。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種所述重組菌的構(gòu)建方法，所述方法是：
[0019] (1)按照缺失了啟動(dòng)子和信號(hào)肽的pWB980、SEQIDNO. 1所示的普魯蘭酶表達(dá)元 件、缺失了信號(hào)肽的pET20b(+)的順序，將這三段核苷酸序列用In-Fusion酶連接，得到重 組質(zhì)粒pulA/pSVEB;
[0020] (2)將重組質(zhì)粒pulA/pSVEB電轉(zhuǎn)至短小芽抱桿菌BrevibacillusbrevisCCTCC AB94025 中，得到重組菌pulA/pSVEB/Brevibacillusbrevis。
[0021] 本發(fā)明還提供一種利用所述重組菌生產(chǎn)普魯蘭酶的方法。
[0022] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是將重組菌種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，于 25-37°C發(fā)酵培養(yǎng) 46-50h。
[0023] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，種子液使用的種子培養(yǎng)基為TM培養(yǎng)基，其組成為： 葡萄糖l〇g/L，多聚蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，酵母粉2g/L，微量元素10mL/L，卡那霉素 30yg/mL;其中微量元素液組成為：FeS04.7H20lg/L，MnS04.4H20lg/L，ZnS04.7H20 0?lg/ L〇
[0024] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有葡萄糖10_50g/L，棉籽粉 l-10g/L，牛肉浸膏 10-30g/L，MgCl2 ? 6H20l-20g/L和卡那霉素。
[0025] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法具體是：將重組菌種子液接種至發(fā)酵罐， 控制溫度25-37°C、溶氧10-50%、pH5. 0-7. 0,并流加葡萄糖維持發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛葹?l-30g/L〇
[0026] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是將培養(yǎng)好的種子液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng) 基的發(fā)酵罐中，控制在30 °C、pH為7. 0±0. 1、通風(fēng)量1.Ovvm、溶氧為30 %、殘?zhí)菨舛仍?5g/L以上，培養(yǎng)72h;其中發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖30g/L，牛肉浸膏30g/L，棉籽粉5g/L， MgCl2 ? 6H2012g/L和卡那霉素。
[0027] 本發(fā)明的有益效果：
[0028] 本發(fā)明構(gòu)建的重組短小芽抱桿菌pulA/pSVEB/Brevibacillusbrevis在TM培養(yǎng) 基中發(fā)酵48h，酶活為48. 5U/mL。采用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，搖瓶發(fā)酵48h，酶活 可達(dá)531. 5U/mL;3L罐發(fā)酵72h，酶活可達(dá)988. 5U/mL。本發(fā)明還具有發(fā)酵原料低廉，發(fā)酵調(diào) 控簡單等優(yōu)點(diǎn)，適合普魯蘭酶在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用。
【附圖說明】
[0029] 圖1產(chǎn)普魯蘭酶重組短小芽孢桿菌搖瓶發(fā)酵上清SDS-PAGE凝膠電泳圖；1，發(fā)酵上 清液;M，標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量；
[0030] 圖2不同碳源對(duì)重組菌生長和產(chǎn)酶的影響；普魯蘭酶活力（白色），菌體干重（黑 色）；
[0031] 圖3不同氮源對(duì)重組菌生長和產(chǎn)酶的影響；普魯蘭酶活力（白色），菌體干重（黑 色），BE(牛肉浸膏），P0(多聚蛋白胨），YE(酵母粉），PE(蛋白胨），C0(棉籽粉），AC(酸 水解酪蛋白）；
[0032] 圖4不同金屬離子對(duì)重組菌生長和產(chǎn)酶的影響；普魯蘭酶活力（白色），菌體干重 (黑色）；
[0033] 圖5重組菌產(chǎn)普魯蘭酶的3L罐分批發(fā)酵曲線；菌體干重（?）、普魯蘭酶活力 ();
[0034] 圖6重組菌產(chǎn)普魯蘭酶的3L罐分批補(bǔ)料發(fā)酵曲線；菌體干重（?）、普魯蘭酶活 力（);
[0035] 圖7重組菌產(chǎn)普魯蘭酶的SDS-PAGE凝膠電泳圖；其中電泳帶上的數(shù)值為對(duì)應(yīng)樣品 的發(fā)酵時(shí)間00。
【具體實(shí)施方式】
[0036]實(shí)施例 1 :重組菌pulA/pSVEB/Brevibacillusbrevis的構(gòu)建
[0037] 根據(jù)Genbank中來源于Brevibacillusbrevis的外壁蛋白啟動(dòng)子P2序列和來源 于Brevibacillusbrevis的外壁蛋白信號(hào)肽序列，人工合成5'端含pWB980同源序列、3' 端含pET20b(+)同源序列的DNA片斷（序列如SEQIDN0. 2所示）：
[0038] 以在pET-20b(+)基礎(chǔ)上構(gòu)建的、表達(dá)D437H/D503Y/d2突變體的重組質(zhì)粒為模板 (一種分泌效率和熱穩(wěn)定性提高的普魯蘭酶突變體及其制備方法.CN201310610426. 4)經(jīng) NdeI和NcoI雙酶切獲得線性化的含有普魯蘭酶突變體基因pulA和去除pelB信號(hào)肽的 pET20b(+)的DNA片斷。
[0039] 根據(jù)上述DNA片斷序列合成含有同源序列的序列分別如SEQIDN0. 3、SEQID NO. 4所示的引物P1、P2 :
[0040] 以質(zhì)粒pWB980(購自Novagen公司）為模板，P1、P2為引物擴(kuò)增得到兩端含上述同 源序列并去掉P43啟動(dòng)子序列和信號(hào)肽序列的pWB980片斷。PCR體系為：10yM引物P1和 P2 各 1yL，2mMdNTP4yL，5XPCRSTAR?Buffer10yL，PrimcSlarKHSDNA聚合酶 1yL， 模板〇. 5yL，加雙蒸水補(bǔ)至50yL。PCR條件：94°C預(yù)變性5min;延伸循環(huán)開始，94°C變性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 2. 5min，共循環(huán) 30 次。
[0041] 將上述的合成片斷2yL，含有pulA和pET20b⑴的片斷l(xiāng)yL，含同源序列的 PWB980片斷1yL以及雙蒸水4yL加入EP管中混勻，再加入In-Fusion酶2yL，42°C連接 30min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliJM109中，涂布含有100yg/mL氨芐霉素的LB平板，37°C 培養(yǎng)10-12h。挑取陽性單克隆，提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序正確的即為重組質(zhì)粒pulA/ pSVEB〇
[0042] 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)入短小芽孢桿菌中，涂布于含30yg/mL卡那 霉素的TM平板上，37°C培養(yǎng)12-15h。挑取單克隆，提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證，并 對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行蛋白電泳分析，能夠正確表達(dá)普魯蘭酶的轉(zhuǎn)化子即為重組短小芽孢桿菌 pulA/pSVEB/Brevibacillu