一種醇脫氫酶及其基因、重組酶和合成手性雙芳基仲醇的應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種醇脫氫酶及其基因，以及含有該基因的重組表達載體和重組表達轉(zhuǎn)化體，其重組酶以及該酶作為催化劑在不對稱還原合成手性雙芳基仲醇中的應用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的醇脫氫酶來源于克魯維酵母(Kluyveromyces sp.CCTCCM2011385)，不僅具備還原羰基的功能，而且具備氧化羥基的功能。應用所述醇脫氫酶作為生物催化劑不對稱還原雙芳基酮為手性雙芳基醇時，不需要額外添加如葡萄糖脫氫酶等用于輔因子循環(huán)的酶，催化效率高，反應條件溫和，易于產(chǎn)物回收，成本低，因此在抗組胺藥物的生產(chǎn)中具有很好的應用開發(fā)前景。
【專利說明】
一種醇脫氫酶及其基因、重組酶和合成手性雙芳基仲醇的 應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種來源于克魯維酵母的醇脫氫酶及其 基因，以及含有該基因的重組表達載體和重組表達轉(zhuǎn)化體，其重組酶和該重組酶的制備方 法，以及該重組酶作為催化劑在不對稱還原制備光學雙芳基仲醇中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 手性雙芳基仲醇是一類重要的手性化合物，許多藥物的分子結(jié)構(gòu)中都存在著雙芳 基仲醇的砌塊結(jié)構(gòu)，其中手性(4-氯苯基)_(吡啶-2-基)_甲醇可用于合成抗過敏藥貝他司 汀。由潛手性雙芳基酮經(jīng)不對稱還原反應合成手性雙芳基醇的工藝具有原子經(jīng)濟性高的優(yōu) 點。
[0003] 化學不對稱還原法主要由以下三種技術(shù)實現(xiàn)：
[0004] 1.以（4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮(CPMK)為原料，（S)-[Ru(BINAP)Cl2]2(NEt 3) 為催化劑，加壓，通氫氣，還原得到（S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇（（S)-CPMA)。（趙志 全等·中國醫(yī)藥工業(yè)雜志· 2006 · 37，726-727)
[0005] 2.以CPMK為原料，采用三步反應，1)先用三氟甲烷磺酸酐等進行保護，2)再用催化 劑鈀配位體及Me-CBS等還原羰基得到S構(gòu)型羥基，3)在三苯基膦鈀等作用下脫保護，得到 ⑶-CPMA。
[0006] 3.以CPMK為原料，以手性BINAL-H為手性還原劑，定向合成單一構(gòu)型CPMAJ)
[0007] 但是上述反應所需的貴金屬配位體較難購買，成本較高，反應需要高壓條件，操作 步驟較多。因而不利于工業(yè)化生產(chǎn)。（CN103121966A)
[0008] 生物不對稱還原法主要由以下四種技術(shù)實現(xiàn)：
[0009] 1. 2007年，Truppo等篩選了一系列商品化酮還原酶KRED后，發(fā)現(xiàn)雖然有一些酮還 原酶對雙芳基底物有還原能力，但立體選擇性一般，且底物譜較窄，底物中的取代基團對立 體選擇性的影響較大。僅KRED124可以不對稱還原CPMK生成(R)-CPMA，ee值為94%，轉(zhuǎn)化率 98%，且需要外源葡萄糖脫氫酶提供輔酶循環(huán)。（Org. Lett .，2007，9，335-338.)
[0010] 2· 2009年，朱敦明等發(fā)現(xiàn)來源于Sporobolomyces salmonicolor的重組羰基還原 酶SsCR及其突變體可以立體選擇性還原不同雙芳基酮底物(8-99%ee)。在葡萄糖脫氫酶的 協(xié)助下，還原CPMK生成（R)-CPMA，轉(zhuǎn)化率62 %，對映選擇性為88 % (R)。（Org · Lett ·，2008， 10,525-528.)
[0011] 3. 2012年，周婕妤等通過傳統(tǒng)富集培養(yǎng)篩選到一株克魯維酵母Kluyveromyces sp.CCTCCM2011385,可催化還原CPMK生成（3)-0?]\^(87%66)。然而活性酶在野生菌中的含 量低，最高僅能催化2g · I/1底物，產(chǎn)物濃度較低，分離成本高，因而不能滿足應用的需要。 (Process Biochem.,2012,47,1042-1048.；CN102559520A)
[0012] 4. 2013年，李哲等研究了一個來源于來源于畢赤酵母GS115的羰基還原酶PasCR 對lOmmol · I/1的一系列雙芳香基甲酮類化合物的不對稱還原，轉(zhuǎn)化率最高只有50%。（生物 工程學報，2013,29,68-77)
[0013] 由以上數(shù)據(jù)可知采用生物不對稱還原法制備手性(4'_氯苯基)_(吡啶-2'-基)_甲 醇的產(chǎn)率低，提取困難，并且立體選擇性均達不到工業(yè)化要求，需要進一步開發(fā)高效羰基還 原酶。本發(fā)明提供了一種醇脫氫酶，可以高效不對稱還原1_(4'_氯苯基)-(吡啶-2'-基)-甲 酮生成(R)_(4'_氯苯基)-(吡啶-2'-基)-甲醇，該反應具有不需外源添加昂貴輔酶，不需額 外添加如葡萄糖脫氫酶等用以輔因子循環(huán)的酶，反應條件條件溫和，操作簡單等優(yōu)點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對以克魯維酵母（Kluy veromy ce s sp .) CCTCCM2011385作為CPMK不對稱還原催化劑時酶產(chǎn)量較低使總體催化活性不高，不對稱還 原底物譜較窄的缺陷，而提供一種具有優(yōu)異的不對稱催化活性、底物適用性廣、對環(huán)境友好 的的醇脫氫酶及其編碼基因，以及含有該基因的重組表達載體和重組表達轉(zhuǎn)化體，重組酶 的制備方法，以及該在制備手性雙芳基醇的應用。
[0015] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案之一是:一種分離的核酸，所述的核酸是編碼醇脫氫酶 的核酸分子。
[0016] 其中醇脫氫酶的編碼基因來源于克魯維酵母（Kluyveromyces sp.) CCTCCM2011385,命名為kpadh，其編碼序列如SEQ ID N0.1所示；或編碼由序列表SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；以及任何對SEQ ID NO.1所示核苷酸序列進行一個 或多個核苷酸的取代、插入或缺失處理獲得的核苷酸序列，可編碼出具有醇脫氫酶活性的 蛋白質(zhì)?；蛉L為l〇29bp，其編碼序列(CDS)從第1個堿基起至第1029個堿基止，起始密碼 子為ATG，終止密碼子為TAA，序列內(nèi)無內(nèi)含子。
[0017] 其中所述核酸的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法，所述制備方法較佳地包括:從 自然界中提取天然存在的編碼醇脫氫酶的核酸分子，通過基因克隆技術(shù)獲得編碼醇脫氫酶 編碼基因的核酸分子，或者通過人工全序列合成的方法得到編碼醇脫氫酶的核酸分子。
[0018] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案之二:一種分離的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有雙芳基醇脫 氫酶的活性。
[0019] 其中醇脫氫酶，命名為KpADH，氨基酸序列為SEQIDN0.2所示；及任何對SEQID N0.2所示氨基酸序列中氨基酸進行插入、缺失或替換的處理獲得的多肽片段或其突變體， 只要其保持醇脫氫酶的催化活性的蛋白質(zhì)。
[0020] 本發(fā)明所述蛋白質(zhì)的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法。所述制備方法較佳地為： 將編碼所述蛋白質(zhì)并且?guī)в悬c突變的核酸分子克隆到重組載體中，將所得重組載體轉(zhuǎn)化到 轉(zhuǎn)化體中，得到重組表達轉(zhuǎn)化體，通過培養(yǎng)所得重組表達轉(zhuǎn)化體，經(jīng)鎳柱親和層析分離純化 獲得所述蛋白質(zhì)。
[0021] 所述的醇脫氫酶KpADH是NADPH依賴的，分子量大小為90~100kDa，是同源二聚體； 該酶可以催化還原雙芳基酮底物，且可以氧化異丙醇以實現(xiàn)輔酶再生；該醇脫氫酶還原 CPMK的最適反應pH為5.5，氧化異丙醇的最適反應pH為9.5;最適反應溫度為50°C ;該酶對 〇卩]\0(、祖0?!1、異丙醇和祖0?+的1^*/1^分別為129,601，8.70和63.48- 1.111]?-1;該酶不依賴于 金屬離子發(fā)揮催化功能。
[0022]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案之三：一種包含技術(shù)方案之一所述核酸的重組表達載 體。
[0023] 其中所述重組表達載體可通過本領(lǐng)域常規(guī)方法獲得，即：將本發(fā)明所述的醇脫氫 酶基因的核酸分子連接于各種表達載體上構(gòu)建而成。所述的表達載體為本領(lǐng)域常規(guī)的各種 載體。所述載體較佳地包括:各種質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒載體，本發(fā)明所述載體優(yōu)選地為 pET28a(+)。
[0024] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案之四是:一種包含上述重組表達載體的重組表達轉(zhuǎn)化體。 [0025]其中所述重組表達轉(zhuǎn)化體的制備方法較佳地為:將上述重組表達載體轉(zhuǎn)化至宿主 微生物中制得。所述的宿主微生物較佳地為本領(lǐng)域常規(guī)的各種宿主微生物，只要能滿足上 述重組表達載體穩(wěn)定地自行復制，且所攜帶的醇脫氫酶基因可被有效表達即可。其中所述 宿主微生物較佳地為:大腸桿菌(Escherichia coli)，更加的為大腸桿菌BL21(DE3)將前述 重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中，即可得本發(fā)明優(yōu)選的基因工程菌株。其中所述 轉(zhuǎn)化方法為本領(lǐng)域常規(guī)轉(zhuǎn)化方法，較佳地為化學轉(zhuǎn)化法，熱激法或電轉(zhuǎn)法。
[0026]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案之五是:一種重組醇脫氫酶的制備方法，其中包括如下 步驟:培養(yǎng)上述的重組表達轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物種獲得重組醇脫氫酶。
[0027]其中所述制備方法較佳地為：將上述重組大腸桿菌接種至含有卡那霉素（50yg/ mL)的LB培養(yǎng)基中，30~40°C，150~200rpm培養(yǎng)，培養(yǎng)液的吸光密度0D6Q()達到0.5~1.0(優(yōu) 選0 · 8)，加入0 · 05~1 · Ommol/L(優(yōu)選地為0 · 2mmol/L)的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)進行誘導，誘導溫度為20~30°C (優(yōu)選30°C)，誘導6~12小時即可得到高效表達的重 組醇脫氫酶。離心收集菌體并細胞破碎獲得粗酶液，再用鎳柱進行純化，獲得重組醇脫氫酶 純酶。
[0028]本發(fā)明所采取的技術(shù)方法之六是:上述蛋白質(zhì)或上述重組表達轉(zhuǎn)化體作為催化劑 在手性雙芳基醇化合物合成中的應用。
[0029] 較佳的，所述的應用按下述方法進行:CPMK的濃度為10~500mmo 1 /L;所述的重組 醇脫氫酶的用量為1~10kU/L(酶活定義見實施例1);異丙醇的用量為20~1000mm〇l/L;所 述的NADP+的用量為0· 1~1 ·0mm〇l/L;所述的磷酸鹽緩沖液的濃度為0· lmol/L，pH 6~8;所 述的不對稱還原反應的溫度為20~35°C;所述的不對稱還原反應的時間以反應完全為準， 一般為1~12小時。不對稱還原反應結(jié)束后，可按本領(lǐng)域常規(guī)方法從反應液中提取(R) -CPMA 產(chǎn)物。
[0030] 反應過程中取樣檢測：取100yL反應液，加入500yL乙酸乙酯，震蕩1~2min， 12000rpm離心2~5min，取上清到離心管中，待有機相自然會發(fā)完全，加入500yL分析純的乙 醇，進行液相分析轉(zhuǎn)化率和ee值，具體條件如：Daicel Chiralcel 0Β-Η(5μηι，250mm X 4.6mm)液相色譜柱，流動相為正己烷：乙醇：乙醇胺(90:10:0.01，V/V/V)，流速lmL/min，柱 溫30°C，紫外檢測波長254nm，進樣量10yL，保留時間：（S)-(4'_氯苯基)-(吡啶-2'-基)-甲 醇8.6711^11，（1〇-(4'-氯苯基)-(吡啶-2'-基)-甲醇9.371^11。
[0031 ] 產(chǎn)物光學純度通過對映體過量值(ee)來評價：
[0032] Ar :液相色譜分析獲得的(R)-CPMA摩爾濃度;As:液相色譜分析獲得的⑶-CPMA的 摩爾濃度。
[0033]在符合本領(lǐng)域嘗試的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實 例。
[0034]本發(fā)明所用試劑盒原料均市售可得。
[0035]本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明重組表達的可溶性KpADH酶具有表達水平高、酶活力 高、雙功能（具有底物偶聯(lián)的輔因子循環(huán)系統(tǒng))等優(yōu)點，可用于高效制備(R)_(4'_氯苯基)-(吡啶-2基)-甲醇等目前生物手性催化難以制備的手性雙芳基仲醇，原子經(jīng)濟性高，制備 方法簡單，反應條件溫和，低耗能，對環(huán)境友好，副反應少，只需一步還原即可完成。
【附圖說明】
[0036] 圖1 KpADH基因的PCR擴增電泳圖譜。M:Marker;l:KpADH基因 [0037] 圖2重組表達質(zhì)粒pET28-KpADH的構(gòu)建示意圖。
[0038] 圖3重組醇脫氫酶KpADH的蛋白電泳圖。M，Marker;泳道1和2分別為大腸桿菌BL21 (DE3)/pET28a-KpADH誘導后細胞破碎上清和沉淀部分。
[0039] 圖4醇脫氫酶催化還原1_(4'_氯苯基）_(吡啶_2'_基）_甲酮生成（R)_(4'_氯苯 基)_(吡啶_2'_基)_甲醇示意圖。
[0040] 圖5分離純化后的產(chǎn)物(R)-CPMA的HPLC圖譜。 具體實施方案
[0041] 下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護 范圍。
[0042] 除非另有注明具體條件，各實施例中的試驗方法均按照常規(guī)方法和條件或按照試 劑說明書進行。除非另有明確標注，各組分的含量均以質(zhì)量/體積(w/v)含量表示。表達質(zhì)粒 pET28a購于上海Novagen公司。E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞，2XTaq PCR Master Mix，瓊 脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。
[0043]實施例1醇脫氫酶基因的克隆
[0044]采用鳥槍法克隆上述克魯維酵母的醇脫氫酶基因。
[0045] (1)首先使用LB培養(yǎng)基，于37°C下過夜培養(yǎng)上述克魯維酵母(Kluyveromyces sp.) CCTCCM2011385。離心獲得菌體后，使用常規(guī)酵母基因組提取試劑盒獲得基因組總DNA。 [0046] (2)使用限制性內(nèi)切酶Sau3AI酶切總DNA，形成GATC黏性末端。通過控制酶用量和 反應時間，把總DNA酶切成2~6kb的片段并進行回收。將這些片段與BamH I (識別序列 GGATCC，黏性末端GATC)酶切的pET28a質(zhì)粒進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞E.coli BL21((DE3)后，涂布在含有50m g//L卡那霉素的LB固體平板上，于37°C培養(yǎng)12~16h后，挑取 單菌落進行下一步活性篩選。
[0047] (3)挑單菌落接種至LB固體培養(yǎng)基平板上以進行保存，隨后接種至96孔深孔板培 養(yǎng)，待0D6QQ達到0.6~0.8時，加入0.2mM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)，30°C誘導培 養(yǎng)12小時后，離心收集細胞。然后用pH 7.0的緩沖液懸浮所得細胞，加入溶菌酶進行細胞破 碎后離心，收取上清液，加入甘油至終濃度為20%即為粗酶液，于-80°C保存?zhèn)溆?。使用分?光度計檢測340nm處吸光值的變化，酶活力單位(U)定義為每分鐘催化Ιμπιο? NAD(P)H氧化 或者每分鐘催化lymol NAD(P)+還原所需要的酶量。發(fā)現(xiàn)有一個重組菌體的粗酶液對底物 雙乙酰有活性(依賴于輔酶NADH)。
[0048] (4)由上海賽音生物技術(shù)有限公司對所得陽性克隆子中所插入的外源片段進行測 序。測序結(jié)果表明，外源片段長度為1738bp，利用ORF Finder在線預測開放閱讀框，發(fā)現(xiàn)其 中500~1300bp的開放閱讀框只有一個。
[0049] (5)以鳥槍法所得到的開放閱讀框為依據(jù)，設計引物如下：
[0050] 上游引物：5'-GGAATTCCATATGAGCGTATTAATTAGTGG-3'，如SEQ ID Νο·3所示，在5' 端加上Nde頂每切位點；
[0051] 下游引物：5'-CGCGGATCCTTAAACTCTACCTTCTTTAT-3'，如SEQ ID No.4所示，在5'端 加上BamH I酶切位點；
[0052] 以克魯維酵母的基因組為模板進行PCR，體系如下(yL):10XPCR Mix 10,上游引 物0.2,下游引物0.2,基因組0.2，DNA聚合酶0.2，ddH20 9.2JCR程序為:95°C預變性lOmin， 95°C裂解30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，循環(huán)29次，72°C延伸lOmiruPCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝 膠電泳純化，并利用瓊脂糖膠回收試劑盒回收800~1200bp區(qū)間的條帶（圖1)，即醇脫氫酶 基因。所得醇脫氫酶基因命名為kpadh，核苷酸序列如SEQ ID No.l所示:全長1029bp，其起 始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。序列中無內(nèi)含子，編碼序列從第1個核苷酸起至1029個 核苷酸止，所編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID No.2所示。序列已登錄至NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號 KP872638。
[0053] 實施例2重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-kpadh的構(gòu)建及培養(yǎng)
[0054] 將實施例1回收的基因 kpadh與質(zhì)粒pET28a分別用限制性內(nèi)切酶Ndel和BamH I于 37°C水浴中過夜雙酶切，次日經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化并利用瓊脂糖回收試劑盒回收目標片 段。4°C下，使用T4DNA連接酶過夜連接酶切過的基因 kpadh與質(zhì)粒pET28a，即得重組表達載 體pET28a-kpadh(圖2)。將構(gòu)建好的重組表達載體pET28a-kpadh熱轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3) 感受態(tài)中，涂布Kan抗性LB固體平板，過夜培養(yǎng)后進行菌落PCR驗證，陽性克隆子即為重組大 腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-kpadh。挑取陽性克隆子于LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，次日按2%轉(zhuǎn)接 量轉(zhuǎn)接入新鮮LB培養(yǎng)中，培養(yǎng)至0D 6qq達到0.6~0.8時，加入0.2mM IPTG，30°C誘導培養(yǎng)6小 時后，4°C、8000r/min離心10min收集菌體。將收集好的菌體懸浮于磷酸鉀緩沖液（100mM，pH 6.0)中，超聲破碎，并通過SDS-PAGE分析蛋白的表達情況（圖3)。由圖3可知，上清液中目標 位置有蛋白可溶高表達，說明重組醇脫氫酶在大腸桿菌中得到成功表達。
[0055]實施例3醇脫氫酶的分離純化
[0056] 懸浮培養(yǎng)好的重組細胞于A液(20mmol · L-1憐酸納，500mmol · L-SaCl，20mmol · L 4咪唑，pH 7.4)中，超聲波破碎離心后獲得粗酶液。純化所使用的柱子為親和柱HisTrap FF crude(鎳柱），利用重組蛋白上的組氨酸標簽進行親和結(jié)合來完成。首先使用A液將鎳柱平 衡，粗酶液上樣，繼續(xù)使用A液將穿透峰洗脫下來，待平衡后用B液（20mmol · I/1磷酸鈉， 500111111〇1.1/1恥(：1，1000111111〇1.1/ 1咪唑，？!17.4)進行梯度洗脫，將結(jié)合到鎳柱上的重組蛋 白洗脫下來，獲得重組醇脫氫酶。對純化后的蛋白進行酶活測定（CPMK為底物，NADPH為輔 酶)及SDS-PAGE分析。純化各項參數(shù)如表1。鎳柱純化后，在45kDa左右顯示單條帶，且雜蛋白 較少，說明鎳柱純化效果較好。之后使用HiTrap Desalting脫鹽柱(GE Healthcare)將純化 后的醇脫氫酶置換到TriS-HCl(100mm〇l · L'pH 7.0)緩沖液中，進行下一步酶學性質(zhì)分 析。
[0057]表1蛋白純化后酶活測定
[0058]
[0059] 實施例4蛋白質(zhì)分子量確定
[0000] 使用Superdex? 200分子排阻柱(GE Healthcare)進行蛋白質(zhì)分子量測定。柱子用 Tris-HCl緩沖液（lOOmmol · L-SpH 7.0)平衡后，將0.5mL蛋白樣品上樣，然后繼續(xù)用Tris-HC1緩沖液進行洗脫，觀察醇脫氫酶KpADH出峰時的洗脫體積。根據(jù)標準蛋白（抑肽酶 6.5kDa，核糖核酸酶A 13.7kDa，β-乳球蛋白35kDa，牛血清白蛋白67kDa，鐵蛋白440kDa)洗 脫曲線計算出醇脫氫酶KpADH的分子量。計算可知，脫氫酶KpADH的蛋白大小為90~90kDa， 說明KpADH為同源二聚體。
[0061]實施例5底物譜分析
[0062]醇脫氫酶的酶活力單位1U定義為:在一定條件下，每分鐘催化氧化Ιμπιο? NAD(P)H 或每還原lymol NADP+所需要的酶量。
[0063] (1)還原活力測定方法：總反應體系為200yL，包括:0.5mmol · L-iNADPHAmmol · L 1同類底物，磷酸鈉緩沖液(PBS，100mmol · L'pH 5.5)，充分混勻，30°(：保溫21^11，加入適 量的酶液，檢測340nm下吸收值的變化。
[0064] (2)氧化活力測定方法:總反應體系為200yL，包括:5mmol · L-iNADP+aOmmol · L一1 醇類底物，磷酸鈉緩沖液(PBS，100mmol · L'pH 9.5)，充分混均，30°(：保溫21^11，加入適量 的酶液，檢測340nm下吸收值的變化。
[0065]測定KpADH還原多種潛手性酮類底物及氧化多種醇類底物的酶活力。分別以CPMK 及異丙醇為底物測得的酶活力為100%對照，其他底物測得的酶活力以二者的百分比計算。 測定結(jié)果如表2所示。
[0066]表2醇脫氫酶KpADH的底物特異性
[0068] 對于芳基酮類底物，KpADH對CPMK和苯乙酮均表現(xiàn)出較高的還原活力（100 %和 56.4% )，這類底物位阻大，在水中溶解度低，與羰基還原酶的天然底物性質(zhì)相差較大，對此 類底物有高的催化活性的酶較少。對比二苯甲酮，芐基苯乙酮和3,4_二氯二苯甲酮發(fā)現(xiàn)，隨 著空間位阻的進一步增大，KpADH的催化活性逐漸降低。對于2,3_戊二酮、2,4_戊二酮、2,3_ 己二酮、3,4-己二酮和2,5-己二酮等二酮類底物，KpADH更易于還原2,4-戊二酮(74.6%相 對活力hKpADH對酮酯類底物的活力較高，對2-氧-4-苯基丁酸乙酯和乙酰乙酸乙酯的還原 活力可高達是CPMK的24倍左右。對于氧化反應的底物特異性，除了 2，3-丁二醇外，相對活力 均小于10%。邱40!1氧化2,3-丁二醇的活力是氧化異丙醇活力的3.6倍，表明2,3-丁二醇可 作為用于輔因子再生的潛在輔底物。
[0069] 實施例6最適反應pH
[0070]配制lOOmmol · L-1不同pH的緩沖液:梓檬酸鈉緩沖液(pH 4.0~6.0)、磷酸鈉緩沖 液(pH 6.0~8.0)、甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 8.0~12.0)。然后分別以CPMK及異丙醇為底物， 測定KpADH在不同pH緩沖液中的酶活力。最高酶活力定為100 %，其他pH下測得的酶活力以 相對于最高活力的百分比計算。結(jié)果分析所示，氧化活力的最適pH為9.5,還原活力的最適 pH為5.5。
[0071 ]實施例7最適反應溫度
[0072] 分別以CPMK及異丙醇為底物，測定KpADH在不同溫度(4~46°C)下的酶活，測得的 最高酶活定為100%，其他溫度下測得的酶活以相對于最高活力的百分比計算。結(jié)果分析顯 示，KpADH的最適溫度為50 °C。
[0073]實施例8動力學參數(shù)分析
[0074]測定KpADH在不同底物濃度和輔酶濃度情況下的活力，并根據(jù)活力和底物濃度的 倒數(shù)做出雙倒數(shù)曲線，計算動力學參數(shù)。
[0075] 表3醇脫氫酶KpADH的動力學參數(shù)
[0077]由表3可知，該酶對CPMK的親和力(Km = 0.500mmol · I/1)高于對異丙醇的親和力 (Km = 6.36mmol · L-且還原CPMK的速率(1^ = 64.78+1)高于氧化異丙醇的速率(kcat = 55.3s-因此KpADH對CPMK的底物專一性常數(shù)kcat/Km(129L · s -1 · mmol - 1)高于異丙醇 (8 · 69L · s-1 · mmol-1)。
[0078]實施例9金屬離子和添加劑對酶活力的影響
[0079] 將終濃度為lmmol · I/1的氯化鹽或者硫酸鹽形式的金屬離子加入到純化后酶液 中，于30°C下溫育30min后，在Tris-HCl緩沖液（lOOmmol · L-SpH 7.0)中以CPMK和異丙醇為 底物測定其殘余酶活。同等條件下，不加任何金屬離子測得的酶活定為100%對照，加入金 屬離子測得的酶活以對照的百分比計算。結(jié)果如表4所示。
[0080] 表4金屬離子及添加劑對KpADH的還原和氧化活力的影響
[0082]沒有發(fā)現(xiàn)具有顯著激活KpADH的氧化和還原活力的金屬離子。Mg2+、Ba2+、Ca 2+、Mn2+、 Li+等離子對KpADH的還原和氧化活力的有輕微的激活作用，相對還原和氧化活力分別約為 110%和120%;2112+^1 3+、(：112+^82+、？62+等離子對邱40!1的氧化和還原活力都具有嚴重的抑 制作用。EDTA的添加并沒有使酶活力降低，從另一方面說明KpADH不是金屬離子依賴性酶。 蛋白變性劑SDS的添加導致酶解聚成單體，而單體僅保留有8%的相對活力，說明KpADH的活 性依賴于多聚體。吐溫20、DTT、i3-巰基乙醇的添加可在一定程度上促進KpADH的氧化和還原 活力。
[0083]實施例9醇脫氫酶KpADH不對稱還原潛手性雙芳基酮的轉(zhuǎn)化率及選擇性分析 [0084] 測定醇脫氫酶KpADH不對稱還原不同潛手性雙芳基酮的效果，其中底物濃度為為 10mm〇l/L，重組醇脫氫酶的用量為100U/L(酶活定義見實施例1)，異丙醇的用量為20mmol/ L;NADP+的用量為0.1mmol/L，磷酸鹽緩沖液的濃度為lOOmmol · L-SpH 7.0。不對稱還原反 應的溫度為30°C，反應12小時。轉(zhuǎn)化率及選擇性分析方法如下：取100yL反應液，加入500yL 乙酸乙酯，震蕩1~2min，12000rpm離心2~5min，取上清到離心管中，待有機相自然會發(fā)完 全，加入500yL分析純的乙醇，進行液相分析轉(zhuǎn)化率和ee值，具體條件如:Daicel Chiralcel 0Β-Η(5μπι，250mm X 4.6mm)液相色譜柱，流動相為正己烷：乙醇：乙醇胺(90 :10:0.01，V/V/ V)，流速lmL/min，柱溫30°C，紫外檢測波長254nm，進樣量10yL。結(jié)果如表5所示。
[0085] 表5醇脫氫酶KpADH不對稱還原雙芳基酮底物的轉(zhuǎn)化率及選擇性分析
[0088] 由表5可知，醇脫氫酶KpADH可不對稱還原多種潛手性雙芳基酮，轉(zhuǎn)化率為35~ 99%，立體選擇性82.3~90.1%。
[0089] 實施例10醇脫氫酶KpADH在不同pH條件下不對稱還原CPMK
[0090] 于2ml磷酸鈉緩沖液（lOOmmol · L-SpH 6·0、ρΗ 7·0、ρΗ 8.0)中加入實施例一所得 的菌體lg/L，500mmol · L-1的CPMK(溶解于異丙醇)500yL，在30°C，200rpm反應12h。液相色譜 分析轉(zhuǎn)化率，如表6所示。
[0091] 表6緩沖液pH對CPMK不對稱還原的影響
[0093] 從表6可以看出，反應體系的pH值對醇脫氫酶KpADH不對稱還原CPMK的轉(zhuǎn)化率有顯 著影響，在pH 7.0時轉(zhuǎn)化率最高。
[0094] 實施例11-18重組菌催化KpADH不對稱還原反應的條件優(yōu)化 [0095] 取10~100U所得的重組醇脫氫酶KpADH于磷酸鹽緩沖液(pH 7.0，100mmol · L-1) 中，加入CPMK 0 · 1~5mmol，0~0 · 5mmol NADP+，異丙醇為0 · 2~lOmmol，反應液總體積為 10mL。將反應置于20~35°C下，攪拌反應至結(jié)束。反應結(jié)束后用等體積的乙酸乙酯萃取三 次，合并萃取液，加入無水硫酸鈉，干燥過夜，旋蒸獲得(R)-CPMA。
[0096] 表7重組醇脫氫酶KpADH在不同反應條件下不對稱還原CPMK的效果
[0097]
[0098] 實施例19重組醇脫氫酶KpADH催化CPMK的不對稱還原反應
[0099] 于10ml磷酸鈉緩沖液（lOOmmol · L-SpH 7.0)中加入實施例1所得的菌體10kU/L， 500mmo 1 · I/1的CPMK(溶解于異丙醇）500yL，在30°C，200rpm反應12h。反應過程示意圖如圖 4〇
[0100] 每隔一段時間取樣 100yL，加入400yL PBS(100mmol · L-SpH 7.0)緩沖液和500yL 乙酸乙酯萃取，取出上層有機相，待有機相自然揮發(fā)完全，加入HPLC級的乙醇，進行正相 HPLC檢測。具體條件如:Da i c e 1 Ch i r a 1 c e 1 0Β-Η (5μηι，2 50_ X 4 · 6mm)液相色譜柱，流動相 為正己燒：乙醇：乙醇胺（90:10:0.01，v/v/v)，流速lmL/min，柱溫30°C，紫外檢測波長 254nm，進樣量10yL，保留時間：（R)-(4'_氯苯基)-(吡啶-2'-基)-甲醇8.6711^11，（3)-(4'-氯 苯基）_(吡啶-2'-基)-甲醇9.37min。結(jié)果如表7。反應結(jié)束后用等體積的乙酸乙酯萃取三 次，合并萃取液，加入無水硫酸鈉，干燥過夜，旋蒸獲得(R)-CPMA。
[0101] 表8重組醇脫氫酶KpADH催化CPMK不對稱還原反應進程表

[0103]由表7可以看出，反應10小時，轉(zhuǎn)化率達到99.8%，從開始反應到反應結(jié)束，產(chǎn)物ee 值都保持在82.3%。產(chǎn)物的光學純度液相色譜圖分析如圖5。
【主權(quán)項】
1. 一株重組表達來源于克魯維酵母化luyveromyces sp.CCTCCM2011385)的醇脫氨酶 編碼基因 kpa化，其特征在于所述基因的核巧酸序列如SEQ ID No. 1所示，或?qū)EQ ID No. 1 所示堿基序列的一個或多個堿基進行替換、缺失或增加得到的編碼具有該醇脫氨酶活性的 蛋白的堿基序列。2. -種如權(quán)利要求1所述基因編碼的醇脫氨酶KpADH，其特征在于，所述蛋白質(zhì)氨基酸 序列如SEQ ID No. 2所示，由SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或多 個氨基酸而得到的具有醇脫氨酶活性的衍生蛋白質(zhì)。3. -種重組表達載體，攜帶如權(quán)利要求1所述醇脫氨酶編碼基因的質(zhì)粒。4. 一種重組表達基因工程菌，其包括如權(quán)利要求3所述的重組表達載體。5. 權(quán)利要求2所述醇脫氨酶在不對稱還原潛手性雙芳基酬合成手性雙芳基醇中的應 用，其特征在于所述的醇脫氨酶的添加形式為該酶的粗酶液或整細胞，所述緩沖液中包括 MDP%含量為0~0.5 mmol/l;所述的潛手性雙芳基酬如式1或式2所示的化合物;所述緩沖 液為憐酸鹽緩沖液，憐酸鹽濃度為0.1 mol/L，抑值為6.0~8.0;所述不對稱還原反應的溫 度為20~35°C ;所述的不對稱還原反應的時間W反應完全為準。其中化為2 ' -C1，3 ' -C1 及4 ' -C1、； R2為2 ' -C1，3 ' -C1 及4 ' -C1、； R3為Η及4 ' -C1。
【文檔編號】C12N15/53GK105936909SQ201610373805
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年5月31日
【發(fā)明人】倪曄, 許國超, 唐銘燴, 董晉軍, 邊雅倩
【申請人】江南大學