細(xì)胞培養(yǎng)裝置的制造方法
【專利摘要】一種細(xì)胞培養(yǎng)器，其具備：流路，其具有導(dǎo)入液體的導(dǎo)入端和底面，所述液體在其中流動，和多個凹部，其形成于所述流路的所述底面，用于收容細(xì)胞，所述多個凹部密集地配置于所述流路的所述底面。
【專利說明】細(xì)胞培養(yǎng)裝置
[0001] 技術(shù)分野
[0002] 本發(fā)明設(shè)及細(xì)胞培養(yǎng)器、及細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0003] 作為糖尿病、特別是1型糖尿病的治療手段，膜臟移植、膜島移植是有效的，但是， 臟器供體數(shù)量少、必須服用用于抑制免疫排斥的免疫抑制劑等方面成為嚴(yán)峻的課題。另一 方面，正在使用來自于小鼠、人的細(xì)胞，廣泛進(jìn)行由誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞)等多能干細(xì) 胞來分化誘導(dǎo)膜島細(xì)胞的研究。
[0004] 專利文獻(xiàn)1公開了使用TGF-0等刺激因子誘導(dǎo)內(nèi)胚層細(xì)胞、特別是膜島細(xì)胞的方 法。但是，該文獻(xiàn)雖然公開了將細(xì)胞的命運(yùn)誘導(dǎo)為內(nèi)胚層系統(tǒng)、特別是膜島細(xì)胞所必須的刺 激因子，但是對于誘導(dǎo)時的細(xì)胞群的形態(tài)是維持平面結(jié)構(gòu)還是形成立體聚集塊則沒有公 開，此外，對于此時的細(xì)胞群的尺寸的控制方法等也沒有公開。
[0005] 專利文獻(xiàn)2中公開了：在包含帶正電的納米尺寸的纖維或粒子的基質(zhì)上培養(yǎng)胚胎 干細(xì)胞化S細(xì)胞)或iPS細(xì)胞，不使用飼養(yǎng)細(xì)胞地由多能干細(xì)胞誘導(dǎo)膜島細(xì)胞的方法。但是， 對于形成聚集體則沒有記載和教導(dǎo)。
[0006] 非專利文獻(xiàn)1中公開了：由人多能干細(xì)胞分化誘導(dǎo)膜島細(xì)胞后，使其形成細(xì)胞聚集 體、制作模擬膜島的方法。此外公開了 ：通過移植該模擬膜島，糖尿病模型小鼠的糖尿病狀 態(tài)得到改善。該文獻(xiàn)中，在使細(xì)胞于培養(yǎng)皿底面上進(jìn)行貼壁培養(yǎng)的狀態(tài)下進(jìn)行分化誘導(dǎo)，在 該過程中使細(xì)胞群從培養(yǎng)皿底面分離進(jìn)行非貼壁培養(yǎng)(懸浮培養(yǎng)），從而形成聚集體。但是， 聚集體的形成依賴于懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞群彼此的偶然性粘附，因此其尺寸是不可控的。
[0007] 專利文獻(xiàn)3公開了 ：利用細(xì)胞無法貼壁的水凝膠基材構(gòu)成凹部、使接種于其中的細(xì) 胞形成聚集塊的方法及器件。但是，該文獻(xiàn)中并未公開用于由多能干細(xì)胞開始的分化誘導(dǎo) 的方法。此外存在如非專利文獻(xiàn)2、非專利文獻(xiàn)3中記載那樣的、通過攬拌培養(yǎng)法形成的聚集 體狀態(tài)的膜島細(xì)胞分化誘導(dǎo)法。
[000引專利文獻(xiàn)4中列舉了在利用表面改性而抑制了細(xì)胞貼壁的培養(yǎng)皿中形成細(xì)胞聚集 塊的方法、及作為有助于聚集塊的尺寸的因子的接種細(xì)胞的密度、培養(yǎng)液中的血清濃度。列 舉了如下方法:通過在培養(yǎng)皿底面中限制可發(fā)生細(xì)胞貼壁的區(qū)域，結(jié)果限制所生成的聚集 塊的尺寸。但是，該文獻(xiàn)中并未公開用于分化誘導(dǎo)的方法。
[0009]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) [0010] 專利文獻(xiàn)
[0011] 專利文獻(xiàn)1:美國專利第8859286號說明書
[0012] 專利文獻(xiàn)2:日本特開2011-115161號公報
[0013] 專利文獻(xiàn)3:日本專利第5039715號說明書
[0014] 專利文獻(xiàn)4:日本特開2007-135593號公報
[0015] 非專利文獻(xiàn)
[0016] 非專利文獻(xiàn) 1:DIABETES,V0L.61,AUGUST 2012,2016-2029
[0017]非專利文獻(xiàn)2:化oS 0肥.，V0L.7，May 2012,637004，化加1日3 C.Schulz等，喬治亞 大學(xué)、USA
[001 引 非專利文獻(xiàn)3:〔611.￥化.159,0。1 2014,428-439，尸611。1日￥化邑1111。日等， Harvard University,USA

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019]發(fā)明所要解決的問題
[0020] 本發(fā)明的課題在于，提供一種適合于高效地形成聚集體并進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)器及培 養(yǎng)系統(tǒng)。
[0021] 本發(fā)明的課題還在于，提供一種適合于高效地形成聚集體并進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)器和 培養(yǎng)系統(tǒng)。即、在對部分細(xì)胞種類進(jìn)行分化誘導(dǎo)時，有時需要形成聚集體。在形成聚集體時， 聚集體的中屯、部依靠擴(kuò)散來供給細(xì)胞的生存所必須的氧氣、營養(yǎng)，因此期望將聚集體的大 小控制為均勻。但是，專利文獻(xiàn)1中雖然公開了將細(xì)胞的命運(yùn)誘導(dǎo)為內(nèi)胚層系統(tǒng)、特別是膜 島細(xì)胞所必須的刺激因子，但是對于聚集體的大小的控制方法等則沒有公開。非專利文獻(xiàn)1 ~3的方法中，聚集體的形成是通過細(xì)胞間的接觸而隨機(jī)發(fā)生的，因此難W控制聚集體的大 小，此外在更換培養(yǎng)基時需要通過離屯、分離進(jìn)行沉淀操作。專利文獻(xiàn)3中沒有公開簡單地更 換培養(yǎng)液的方法。因此，本發(fā)明的目的在于，提供能夠培養(yǎng)聚集體的技術(shù)。
[0022] 用于解決問題的方法
[0023] 為了高效地形成聚集體并進(jìn)行培養(yǎng)，可W采用W下的培養(yǎng)器。但是，W下的培養(yǎng)器 及培養(yǎng)系統(tǒng)也可W用于模擬膜島的制造 W外的用途中，還可W用于要求形成聚集體的細(xì)胞 種類(細(xì)胞種)的制造。
[0024] 本發(fā)明的培養(yǎng)器的第1方式為一種細(xì)胞培養(yǎng)器，其具備：
[0025] 流路，其具有導(dǎo)入液體的導(dǎo)入端和底面，前述液體在其中流動，和
[0026] 多個凹部，其形成于前述流路的前述底面，用于收容細(xì)胞，
[0027] 前述多個凹部密集地配置于前述流路的前述底面。
[0028] 根據(jù)第1方式，能夠控制接種細(xì)胞數(shù)、在1個凹部（即，W不與其它細(xì)胞聚集體接觸 的狀態(tài)）制作1個細(xì)胞聚集體，且能夠在將其維持于各孔中的狀態(tài)下依次更換培養(yǎng)液。通過 使多個凹部處于密集狀態(tài)，能夠抑制在凹部W外的部分生成細(xì)胞聚集體，此外能夠?qū)⑴囵B(yǎng) 液大致均勻地供給到該多個凹部中，制作尺寸大致均勻的聚集體。
[0029] 本發(fā)明的培養(yǎng)器的第2方式為一種細(xì)胞培養(yǎng)器，其中，
[0030] 前述流路具有排出前述液體的排出端，
[0031] 前述流路包含第1區(qū)域，所述第1區(qū)域的寬度從前述導(dǎo)入端起擴(kuò)大到規(guī)定的長度，
[0032] 前述第1區(qū)域具有與前述流路的底面正交的2個側(cè)壁面，
[0033] 前述2個側(cè)壁面的任一位置的切面與從導(dǎo)入端向著排出端的方向所成的角度為45 度W下。
[0034] 根據(jù)第2方式，能夠?qū)⒁后w同樣地供給到各凹部，能夠在各凹部形成尺寸大致均勻 的細(xì)胞聚集體。
[0035] 本發(fā)明的培養(yǎng)器的第3方式為一種細(xì)胞培養(yǎng)器，其中，
[0036] 前述多個凹部在前述流路的前述底面所占的面積為前述底面的面積的一半W上。
[0037] 根據(jù)第3方式，能夠抑制在凹部W外的部分生成細(xì)胞聚集體，能夠在凹部內(nèi)形成尺 寸大致均勻的細(xì)胞聚集體。
[0038] 本發(fā)明的培養(yǎng)器的第4方式為一種細(xì)胞培養(yǎng)器，其中，
[0039 ]導(dǎo)入前述流路的培養(yǎng)液的速度為1 Ocm/s W下。
[0040]根據(jù)第4方式，能夠?qū)κ杖萦诎疾康募?xì)胞同樣地供給新鮮的培養(yǎng)液，能夠在各凹部 形成尺寸大致均勻的細(xì)胞聚集體。
[0041 ]本發(fā)明的培養(yǎng)器的第5方式為一種細(xì)胞培養(yǎng)器，其中，
[0042] 前述凹部的周緣進(jìn)行了倒角。
[0043] 根據(jù)第5方式，細(xì)胞不易滯留在凹部W外的部分，不易在凹部W外的部分生成細(xì)胞 聚集體，能夠無損耗地、高效地形成尺寸大致均勻的細(xì)胞聚集體。
[0044] 本發(fā)明的培養(yǎng)器的第6方式為一種細(xì)胞培養(yǎng)器，其中，
[0045] 前述凹部的寬度為100皿W上且5mmW下，
[0046] 前述凹部的高度為100皿W上且5mmW下。
[0047] 根據(jù)第6方式，能夠在各凹部形成規(guī)定尺寸的大致均勻的細(xì)胞聚集體。
[0048] 本發(fā)明的培養(yǎng)器的第7方式為細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其具備：
[0049] 上述任意細(xì)胞培養(yǎng)器，
[0050] 調(diào)整向前述細(xì)胞培養(yǎng)器中導(dǎo)入的前述培養(yǎng)液的量的供給裝置，和
[0051] 收容由前述細(xì)胞培養(yǎng)器排出的細(xì)胞及培養(yǎng)液的收容裝置。
[0052] 根據(jù)第7方式，能夠W期望的速度將培養(yǎng)液導(dǎo)入細(xì)胞培養(yǎng)器，能夠在各凹部形成規(guī) 定尺寸的大致均勻的細(xì)胞聚集體。
[0053] 發(fā)明效果
[0054] 根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)器，能夠提供能培養(yǎng)出大致均勻的細(xì)胞聚集體的技術(shù)。
【附圖說明】
[0055] 圖1為示出本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)成例的圖。
[0056] 圖2為示出細(xì)胞培養(yǎng)器的構(gòu)成例的分解立體圖。
[0057] 圖3為示出本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)器的構(gòu)成例的圖。
[0058] 圖4為示出圖3的X1-X1線處的、細(xì)胞培養(yǎng)器的剖面圖的例子的圖。
[0059] 圖5為示出圖3的Y1-Y1線處的、細(xì)胞培養(yǎng)器的剖面圖的例子的圖。
[0060] 圖6為示出多個孔的剖面形狀的例子的圖。
[0061 ]圖7為示出孔的剖面形狀的例子的圖。
[0062] 圖8為示出底面部上的孔的形狀的例子的圖。
[0063] 圖9為示出流路的形狀的例子的圖。
[0064] 圖10為示出蓋的變形例的細(xì)胞培養(yǎng)器的剖面圖。
[0065] 圖11為示出孔的配置的例子的圖。
[0066] 圖12為示出細(xì)胞培養(yǎng)器的變形例的圖。
[0067] 圖13為示出本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的變形例1的圖。
[0068] 圖14為示出本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的變形例2的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0069] W下參照附圖對本發(fā)明的培養(yǎng)器的實(shí)施方式進(jìn)行說明。但是，實(shí)施方式的構(gòu)成是 一個例子，本發(fā)明的構(gòu)成并非僅限于實(shí)施方式的具體構(gòu)成。
[0070] 〔實(shí)施方式）
[0071] 對于作為本發(fā)明的實(shí)施方式的、包含形成細(xì)胞聚集體的細(xì)胞培養(yǎng)器的細(xì)胞培養(yǎng)系 統(tǒng)進(jìn)行說明。使用細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)形成的聚集體被用于例如膜島細(xì)胞的分化誘導(dǎo)中。其中，實(shí) 施方式的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，可W根據(jù)目標(biāo)分化誘導(dǎo)的種類來選擇對細(xì)胞給予刺激的培養(yǎng)液 種類，從而能夠在形成用來獲得包含膜島細(xì)胞的各種分化誘導(dǎo)的聚集體時使用。
[0072] (構(gòu)成例）
[0073] 圖1為示出本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)成例的圖。圖1的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)1包含 袋2、累3、細(xì)胞培養(yǎng)器4、用于廢液保存的袋5。袋2和累3之間通過管6而連接，累3和細(xì)胞培養(yǎng) 器4之間通過管7而連接，細(xì)胞培養(yǎng)器4和袋5之間通過管8而連接。
[0074] 袋2用于收容供給到細(xì)胞培養(yǎng)器4中的培養(yǎng)液。培養(yǎng)液為包含細(xì)胞的存活所必需的 氧氣、營養(yǎng)、或者用于提供使細(xì)胞分化為期望的細(xì)胞的刺激的物質(zhì)的液體。此外，作為培養(yǎng) 液，可W使用包含細(xì)胞培養(yǎng)器4中的作為培養(yǎng)對象的多個細(xì)胞的培養(yǎng)液。包含細(xì)胞的培養(yǎng)液 也稱為細(xì)胞懸液。W下，在對于培養(yǎng)液和細(xì)胞懸液不作區(qū)分時，使用"培養(yǎng)液"運(yùn)樣的表述。 此外，還可W使用并非為培養(yǎng)液的生理鹽水等其它液體來代替培養(yǎng)液。作為袋2,準(zhǔn)備收容 了根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)條件而調(diào)整了成分的多種培養(yǎng)液或細(xì)胞懸液的多個袋2。袋2可W在適當(dāng)?shù)?時機(jī)更換。例如，在將細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)器4時，更換為包含細(xì)胞懸液的袋2。袋2例如使用 樹脂形成。還可W使用可收容培養(yǎng)液的瓶等其它容器來代替袋2。袋2、可收容培養(yǎng)液的容器 為收容裝置的例子。
[0075] 累3設(shè)置在袋2和細(xì)胞培養(yǎng)器4之間。累3將通過管6由袋2抽吸的培養(yǎng)液向管7排出。 累3的每單位時間內(nèi)的排出量是可調(diào)整的，通過調(diào)整排出量，能夠控制導(dǎo)入到細(xì)胞培養(yǎng)器4 的培養(yǎng)液的量(流量）。累3還可W使培養(yǎng)液的排出停止。此時，培養(yǎng)液的速度暫時變?yōu)榱?。?為累3,可使用例如管式累。作為累3,還可W使用旋轉(zhuǎn)累、齒輪累等其它種類的累。累3為供 給裝置的一個例子。需要說明的是，有時也可W應(yīng)用將累3配置在細(xì)胞培養(yǎng)器4和袋5之間、 將來自袋2的培養(yǎng)液引入細(xì)胞培養(yǎng)器4內(nèi)的構(gòu)成。作為袋2及累3,還可W使用將收容培養(yǎng)液 的袋及排出培養(yǎng)液的累融為一體的注射累等。
[0076] 細(xì)胞培養(yǎng)器4具有包含導(dǎo)入端和排出端的流路。細(xì)胞及培養(yǎng)液從導(dǎo)入端導(dǎo)入，從排 出端排出。導(dǎo)入端通過管等配管與累3連接。排出端通過管等配管與袋5連接。流路具有用于 收容并培養(yǎng)細(xì)胞的多個孔(培養(yǎng)孔）。孔為凹部的一個例子。細(xì)胞培養(yǎng)器4容后詳述。
[0077] 用于保存廢液的袋5通過管8與細(xì)胞培養(yǎng)器4的排出端連接，用于收容（回收)從細(xì) 胞培養(yǎng)器4的排出端排出的培養(yǎng)液。作為袋5,可使用樹脂制袋。還可W使用可收容培養(yǎng)液的 樹脂制瓶等其它容器來代替袋5。袋5、可收容培養(yǎng)液的容器是收容裝置的例子。
[0078] 管6為將袋2和累3之間連接的配管，其一端連接于袋2,另一端連接于累3。管7為將 累3和細(xì)胞培養(yǎng)器4之間連接的配管，其一端連接于累3,另一端連接于培養(yǎng)器4。管8是將細(xì) 胞培養(yǎng)器4和袋5之間連接的配管，其一端連接于細(xì)胞培養(yǎng)器4,另一端連接于袋5。作為管6、 7、8,例如可使用樹脂制的管。作為管6、7、8,還可W使用可輸送培養(yǎng)液的樹脂制管等其它配 管。
[0079] (細(xì)胞培養(yǎng)器的構(gòu)成例）
[0080] 圖2為示出細(xì)胞培養(yǎng)器的構(gòu)成例的分解立體圖。圖3為細(xì)胞培養(yǎng)器4的主體9的俯視 圖。圖4是示出圖3的X1-X1線處的、細(xì)胞培養(yǎng)器的剖面圖的例子的圖。圖5為示出圖3的Y1- Y1線處的、細(xì)胞培養(yǎng)器的剖面圖的例子的圖。W下使用圖2~圖5對細(xì)胞培養(yǎng)器4的構(gòu)成進(jìn)行 說明。
[0081 ]如圖2所示，細(xì)胞培養(yǎng)器4具備主體9和蓋10。主體9形成為具有長度方向（圖2的X方 向）和與長度方向正交的寬度方向（圖2的Y方向）的平板狀。主體9的上表面中，沿著長度方 向形成有溝槽11。溝槽11由一端部（導(dǎo)入端）12和另一端部(排出端）13、中間部14、錐形部 15、W及錐形部16形成。一端部12形成于主體9的一端部9a，另一端部13形成于主體9的另一 端部9b，中間部14形成于主體9的一端部9a和另一端部9b之間。錐形部15與一端部12和中間 部14連接，錐形部16與中間部14和另一端部13連接。中間部14的寬度長度為一端部12及另 一端部13的寬度W上，錐形部15的寬度從一端部12向著中間部14擴(kuò)大，錐形部16的寬度從 中間部14向著另一端部13逐漸變窄。細(xì)胞培養(yǎng)器4包含由溝槽11形成的流路，所述溝槽11從 一端部12經(jīng)由錐形部15、中間部14、錐形部16直至另一端部。錐形部15、中間部14、錐形部16 分別為第1區(qū)域、第2區(qū)域、第3區(qū)域的一個例子。
[0082] 溝槽11的底面從一端部12直至另一端部13形成為在同一水平面的平面，在錐形部 15、中間部14、錐形部16的底面形成有作為孔的多個凹部17(也稱為孔17)。各孔17按照相鄰 的孔17之間的距離小的方式而形成。各孔17不僅在中間部14密集地配置，在錐形部15、錐形 部16也密集地配置。本例中，配置在錐形部15、錐形部16的多個孔17中的一部分沿著該錐形 部的壁面配置。此外，沿著液體的流動方向排列的孔17的列按照與相鄰的列的孔17的中屯、 彼此錯開的方式配置。
[0083] 圖3所示的例子中，孔17的開口部的形狀在俯視下為圓形。此外，如圖4及圖5的剖 面圖所示，孔17的縱剖面為半楠圓形。但是，孔17的形狀并非限定于此。
[0084] 孔17具有能夠形成規(guī)定尺寸的聚集體的大小。為了細(xì)胞容易沉積在孔的底部、形 成聚集體，從孔17的開口部向著底部，平行于孔17的開口部的面的剖面積逐漸地減小。孔17 的直徑的下限優(yōu)選lOOwn，更優(yōu)選200皿，可W為400WI1。孔17的直徑的上限優(yōu)選5mm，更優(yōu)選 3mm，可W為800皿。孔的高度(深度)的下限優(yōu)選100皿，更優(yōu)選200皿，可W為400皿。孔的高 度(深度)的上限優(yōu)選5mm，更優(yōu)選1mm，可W為800皿?？?7的大小包括孔17的直徑、高度、容 量等?？?7的直徑為孔17的寬度的一個例子?？?7的容積優(yōu)選0.00化1/孔~lOiil/孔，更優(yōu) 選0.001~化1/孔，可W為0.005~0.化1/孔。
[0085] 圖11是示出孔的配置的例子的圖。圖11為孔17的俯視圖。如圖11所示，例如，在溝 槽11的錐形部15、中間部14、錐形部16的底面上記載假想的等邊=角形格子的格子點(diǎn)。該等 邊=角形格子的格子間隔設(shè)為孔17的直徑W上。在此，孔17的圓的中屯、配置在該等邊=角 形格子的格子點(diǎn)的位置。通過運(yùn)樣設(shè)置，可W將孔17在溝槽11的錐形部15、中間部14、錐形 部16的底面同樣地配置。此時，通過將等邊=角形格子的格子間隔設(shè)為與孔17的直徑大致 相等，從而能夠減小溝槽11的底面的水平部20(溝槽11的底面中不存在孔17的部分），能夠 將孔17彼此相鄰接且密集地配置。孔17在溝槽11的錐形部15、中間部14、錐形部16的底面中 與其它孔17相鄰接地同樣配置。溝槽11中的孔17的配置并非僅限于運(yùn)里所示的方式。作為 圖11的例子的替代，可W將孔17的圓的中屯、配置在具有孔17的直徑W上的格子間隔的正方 形格子的格子點(diǎn)的位置。溝槽11中的孔17的配置既可W如圖11所示那樣具有周期性，也可 W是非周期的?？?7在溝槽11的錐形部15、中間部14、錐形部16的底面中所占的面積至少為 該底面面積的一半W上。
[0086] 如圖3所示，與錐形部15的底面正交的壁面(側(cè)壁面)將一端部12和中間部14之間 W平面相連。將該壁面與X軸所成的角度設(shè)為45度W下，從而使由一端部12側(cè)導(dǎo)入的培養(yǎng)液 能夠到達(dá)壁面。關(guān)于錐形部16的壁面和X軸所成的角度也同樣。通過W運(yùn)樣的角度形成錐形 部15及錐形部16的壁面，導(dǎo)入流路的培養(yǎng)液與流路同樣地擴(kuò)展開并流動。
[0087] 圖6為示出多個孔的剖面形狀的例子的圖。在圖6(a)的例子中，孔17和孔17之間、 孔17的周圍表現(xiàn)為水平部20。在細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞通過細(xì)胞懸液而接種在細(xì)胞培養(yǎng)器4中 時，有時細(xì)胞不進(jìn)入孔17而是被載置于水平部20。此時，載置有細(xì)胞的水平部20中，有可能 會制作出尺寸與孔17內(nèi)形成的細(xì)胞團(tuán)塊不同的細(xì)胞團(tuán)塊。即，有細(xì)胞培養(yǎng)器4內(nèi)形成的聚集 體的尺寸變得不均勻之虞。因此，溝槽11的底面中，孔17的周圍的水平部20的面積小更為理 想。由此，降低了在孔17內(nèi)之外的位置生成聚集體的可能性。
[0088] 在圖6(b)的例子中，孔17的周緣(上端部)進(jìn)行了倒角，與圖6(a)水的水平部20的 平面的面積(例如，圖6(a)的A)相比，水平部20的平面的面積(例如，圖6(b)的B)變小。通過 如圖6(b)那樣對孔17的周緣進(jìn)行倒角，從而即使在孔17和孔17之間載置有細(xì)胞，細(xì)胞進(jìn)入 (滾下)任一孔17的可能性也高。即，細(xì)胞不易停留在孔17W外的部分。此時，由于不易在孔 17W外的部分進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，因此容易形成均勻的細(xì)胞聚集體。此外，盡可能地在溝槽11的 錐形部15、中間部14、錐形部16的底面配置孔17,從而能夠減小水平部20的面積。
[0089] 蓋10為立方體的板狀，用于覆蓋主體9的溝槽11。蓋10中形成有作為貫通孔的第1 孔18、第2孔19。在蓋10安裝于主體9的狀態(tài)下，第1孔18為使溝槽11的一端部12對外部開口 的狀態(tài)，第2孔19為使溝槽11的另一端部13對外部開口的狀態(tài)。第1孔18與管7的另一端連 接。第2孔19與管8的一端連接。蓋10既可W按照相對于主體9自由拆裝的方式安裝，也可W 相對于主體9固定。
[0090] 通過向主體9安裝蓋10,第1孔18及第2孔19分別作為培養(yǎng)液的導(dǎo)入口（導(dǎo)入端）、排 出口（排出端)使用。通過在蓋10設(shè)置培養(yǎng)液的導(dǎo)入口、排出口，主體9的溝槽11被作為流路 使用。作為一個例子，流路中按照被培養(yǎng)液充滿的方式從導(dǎo)入端導(dǎo)入培養(yǎng)液，收容不了的培 養(yǎng)液從第2孔19溢出，通過管8而被回收到袋5。因此，為了避免導(dǎo)入到流路中的培養(yǎng)液泄露 到外部，主體9的上表面和蓋10的下表面被膠粘劑、密封材、或利用螺栓固定而嚴(yán)密地接合。 在從導(dǎo)入口將培養(yǎng)液導(dǎo)入流路時，流路的上部也可W存在空氣層。此時，例如，在主體9的側(cè) 面形成培養(yǎng)液的排出口，使得溝槽11內(nèi)的液面高度達(dá)到規(guī)定高度時培養(yǎng)液可從排出口溢 出。
[0091] 為了在孔17內(nèi)進(jìn)行非貼壁培養(yǎng)，主體9及蓋10而言，可W對其培養(yǎng)表面進(jìn)行非貼壁 處理，優(yōu)選由能夠W非貼壁狀態(tài)培養(yǎng)細(xì)胞的材料制造。作為運(yùn)樣的材料，優(yōu)選具有=維結(jié)構(gòu) 且無細(xì)胞毒性的親水性材料，進(jìn)而為了容易觀察培養(yǎng)狀態(tài)而優(yōu)選透明的材料。此外，細(xì)胞培 養(yǎng)器4由于在二氧化碳?xì)夥障率褂?，因此?yōu)選可滲透二氧化碳的材料。更具體而言，優(yōu)選水 凝膠。
[0092] 作為用于制作水凝膠的材料，可W列舉聚乙締醇、聚乙締基化咯燒酬、聚乙二醇、 聚甲基丙締酸-2-?基乙基醋、聚丙締酸-2-?基乙基醋、聚丙締酷胺、聚丙締酸、聚甲基丙 締酸等合成高分子的化學(xué)交聯(lián)體、通過射線照射而形成的交聯(lián)體、W及構(gòu)成上述高分子的 單體的共聚物的交聯(lián)體等可形成水凝膠的各種合成高分子材料。此外，還可W使用作為天 然高分子的瓊脂糖、海藻酸、葡聚糖、纖維素等多糖及其衍生物、W及明膠、白蛋白等蛋白質(zhì) 及其衍生物的交聯(lián)體等。
[0093] 就主體9而言，例如，使用可形成圖2的主體9的模具制作PDMS(二甲基聚硅氧烷， 山11161:115^9〇173；[1(^日]16)等樹脂制模，進(jìn)而向？015轉(zhuǎn)印而制作。主體9的包含孔17的底面(培 養(yǎng)表面)優(yōu)選進(jìn)行了非貼壁處理。此外，主體9及蓋10還可W通過3D打印而一體形成。
[0094] 為了容易從外部觀察孔17內(nèi)的細(xì)胞(聚集體），作為主體9及蓋10,使用透明材料是 理想的。進(jìn)而，為了在對細(xì)胞進(jìn)行免疫染色、觀察時觀察到清晰的圖像，作為主體9及蓋10， 使用樹脂自身不發(fā)出巧光的所謂沒有內(nèi)源巧光（自家鑿光）的材料是理想的。PDMS的可見光 區(qū)的波長的光的透射率高、透明性高且基本沒有內(nèi)源巧光，因此是非常優(yōu)異的材料。近年， PDMS已經(jīng)能夠注射成形，因此通過使用PDMS還能夠W低成本大量地進(jìn)行生產(chǎn)。
[00%]此外，作為與PDMS具有同樣特性的材料，可W列舉環(huán)締控聚合物、環(huán)締控共聚物。 此外，作為能通過注射成形大量生產(chǎn)的透明材料，可W列舉丙締酸類、聚苯乙締、聚丙締、聚 乙締、聚碳酸醋、ABS樹脂、玻璃等。運(yùn)些材料可W作為主體9、蓋10的材料使用。
[0096] 主體9中，包含孔17的底面部分(底面的表面部分)可W用水凝膠來制作，流路部分 (除了底面的表面部分W外的部分)可W用PDMS等制作。此時，主體9可W通過例如使由水凝 膠形成的底面部分嵌入由PDMS等形成的流路部分而形成。通過W運(yùn)種方式形成，能夠抑制 水凝膠的干燥。
[0097] (細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的使用例）
[0098] 對本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)1的使用例進(jìn)行說明。通過細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)1，細(xì)胞聚 集體形成并被培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)器4例如使用C〇2培養(yǎng)箱等被置于5%二氧化碳?xì)夥罩小４送猓?細(xì)胞培養(yǎng)器4按照底面保持水平的方式來設(shè)置。最初，管7是從細(xì)胞培養(yǎng)器4拆下的。
[0099] 使用者通過移液器等將細(xì)胞懸液直接導(dǎo)入細(xì)胞培養(yǎng)器4的導(dǎo)入端，從而將細(xì)胞接 種在細(xì)胞培養(yǎng)器4內(nèi)。導(dǎo)入到細(xì)胞培養(yǎng)器4的細(xì)胞懸液的量為比細(xì)胞培養(yǎng)器4的流路的容積 多的量。通過將比細(xì)胞培養(yǎng)器4的流路的容積多的量的細(xì)胞懸液導(dǎo)入細(xì)胞培養(yǎng)器，能夠使細(xì) 胞培養(yǎng)器4的流路整體充滿細(xì)胞培養(yǎng)液。此外，多余的細(xì)胞懸液從排出端排出，經(jīng)由管8被回 收到袋5。關(guān)于將細(xì)胞培養(yǎng)液導(dǎo)入細(xì)胞培養(yǎng)器4的速度，與細(xì)胞培養(yǎng)液在細(xì)胞培養(yǎng)器4中靜置 的時間相比為足夠短的時間（例如，2秒左右）。通過用足夠短的時間將細(xì)胞培養(yǎng)液導(dǎo)入細(xì)胞 培養(yǎng)器4，能夠使細(xì)胞均等地遍及各孔17。
[0100] 需要說明的是，細(xì)胞懸液可W通過導(dǎo)入到細(xì)胞培養(yǎng)器4的上游部而向著細(xì)胞培養(yǎng) 器4導(dǎo)入。即，細(xì)胞懸液既可W導(dǎo)入袋2、經(jīng)由累3而向細(xì)胞培養(yǎng)器4導(dǎo)入，也可W在管7、細(xì)胞 培養(yǎng)器4中設(shè)置入口部，由該入口部用注射器導(dǎo)入。
[0101] 本發(fā)明中，對使用的細(xì)胞的來源、種類沒有特別限制，可W使用真核細(xì)胞或原核細(xì) 胞，優(yōu)選使用來自于哺乳動物的細(xì)胞，例如，誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞、胚胎干化S)細(xì)胞等多能 干細(xì)胞。含有多能干細(xì)胞的細(xì)胞懸液按照下述方式來生成。最初，將預(yù)先W貼壁狀態(tài)培養(yǎng)的 多能干細(xì)胞從培養(yǎng)皿剝離，并使其分離為單個細(xì)胞。其中，對剝離細(xì)胞的方法沒有特別限 審IJ，可W使用例如膜蛋白酶、EDTA等試劑。然后，將分離成單個細(xì)胞的多能干細(xì)胞W目標(biāo)細(xì) 胞密度懸浮于培養(yǎng)液等中，從而制備出細(xì)胞懸液。
[0102] 將細(xì)胞懸液導(dǎo)入細(xì)胞培養(yǎng)器4，靜置一會(例如，10分鐘~1小時），則細(xì)胞懸液中所 含的細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)器4的溝槽11中發(fā)生沉淀，被收容到孔17中。細(xì)胞懸液的靜置時間與將 細(xì)胞懸液導(dǎo)入細(xì)胞培養(yǎng)器4的時間相比足夠長。此時，由于各孔17的大小相等，因此各孔17 中收容有大致等量的細(xì)胞。此外，由于按照溝槽11的底面的水平部20的面積小的方式來形 成，因此細(xì)胞不易沉淀在孔17W外的位置?？?7內(nèi)細(xì)胞彼此接觸，自發(fā)形成聚集體?？?7內(nèi) 形成的聚集體保持在孔17內(nèi)。聚集體的尺寸可W通過細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度和孔的尺寸來控 審IJ。此外，通過使用尺寸均勻的孔17,可W形成尺寸均勻的聚集體。
[0103] 然后，使用者將管7的另一端與細(xì)胞培養(yǎng)器4的導(dǎo)入端連接。然后，使用者基于規(guī)定 的細(xì)胞培養(yǎng)條件將規(guī)定種類的培養(yǎng)液(運(yùn)里設(shè)為培養(yǎng)液A)放置于袋2,操作累3,使排出的培 養(yǎng)液A的流量達(dá)到規(guī)定的流量(流速）。從累3排出的培養(yǎng)液A被導(dǎo)入細(xì)胞培養(yǎng)器4，培養(yǎng)液A被 供給到各孔17內(nèi)的細(xì)胞。進(jìn)而，使用者基于規(guī)定的細(xì)胞培養(yǎng)條件將規(guī)定種類的培養(yǎng)液(運(yùn)里 設(shè)為培養(yǎng)液B)放置于袋2,操作累3,使排出的培養(yǎng)液B的流量達(dá)到規(guī)定的流量(流速）。從累3 排出的培養(yǎng)液B被導(dǎo)入細(xì)胞培養(yǎng)器4,培養(yǎng)液B被供給到各孔17的細(xì)胞。其中，在將培養(yǎng)液B導(dǎo) 入細(xì)胞培養(yǎng)器4時，先導(dǎo)入的培養(yǎng)液A被后導(dǎo)入的培養(yǎng)液B推出，從細(xì)胞培養(yǎng)器4的排出端排 出。排出的培養(yǎng)液被回收到袋5。導(dǎo)入培養(yǎng)液的時機(jī)、量取決于細(xì)胞培養(yǎng)條件。由此能夠?qū)⒓?xì) 胞培養(yǎng)器4內(nèi)的培養(yǎng)液從培養(yǎng)液A更換為培養(yǎng)液B。通過細(xì)胞培養(yǎng)器4,不使用離屯、分離等復(fù) 雜的操作也能夠進(jìn)行培養(yǎng)液的更換。根據(jù)需要，能夠同樣地進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)器4內(nèi)的培 養(yǎng)液的更換。此外，通過將培養(yǎng)液連續(xù)導(dǎo)入細(xì)胞培養(yǎng)器4,能夠?qū)?7內(nèi)的細(xì)胞連續(xù)地供給 新鮮的培養(yǎng)液。例如，通過用累3控制培養(yǎng)液的流量、使培養(yǎng)液在細(xì)胞培養(yǎng)器4的流路中的流 動速度(流速)為lOcm/s W下，將新鮮的培養(yǎng)液供給細(xì)胞。前記流速（lOcm/s W下)為一個例 子，優(yōu)選Icm/sW下。也可W暫時停止培養(yǎng)液的導(dǎo)入、使培養(yǎng)液的流速暫時為0。關(guān)于培養(yǎng)液 的輸送，在與溝槽11僅在不含孔17運(yùn)點(diǎn)不同的、與溝槽11同樣的流路結(jié)構(gòu)中，優(yōu)選在形成層 流的條件下將培養(yǎng)液導(dǎo)入細(xì)胞培養(yǎng)器4,使用本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)器4可W實(shí)現(xiàn)運(yùn)樣的條 件。其中，層流是指流體的流線與流路的方向平行，意味著并非素流的流場。能夠?qū)崿F(xiàn)運(yùn)樣 的層流的條件為例如雷諾數(shù)(Re)為10W下的條件，此外，為例如雷諾數(shù)(Re)為下的條 件。
[0104] 雷諾數(shù)是由下述式規(guī)定的無因次數(shù)，Re<2320時為層流(不產(chǎn)生素流）。
[0105]
[0106] 式中，P為流體的密度化g/m3)，u(m/s)為管剖面內(nèi)平均速度，d(m)為管內(nèi)徑，y化g/ ms)為流體的粘性系數(shù)，v(m^s)表示流體的運(yùn)動粘性系數(shù)。
[0107] 上述式中，假定培養(yǎng)液的密度及粘性系數(shù)為常數(shù)，貝化e的值依賴于培養(yǎng)液所通過 的管的內(nèi)徑和培養(yǎng)液的供給速度而確定。因此，例如，可W通過在細(xì)胞培養(yǎng)部內(nèi)設(shè)置流路、 選擇合適的流路的內(nèi)徑的尺寸和輸送到流路內(nèi)的培養(yǎng)液的流速，從而能夠在層流條件下將 培養(yǎng)液輸送到細(xì)胞培養(yǎng)部內(nèi)。
[010引需要說明的是，對流路(溝槽11)的尺寸沒有特別限制，例如，可W將與流路的長度 方向垂直的剖面的最長部分的長度設(shè)定在0.1mm~300mm的范圍內(nèi)，例如在該流路為圓筒形 時，可W將內(nèi)徑設(shè)定在0.1mm~300mm的范圍內(nèi)，此外，例如在該流路為多角筒形時，可w將 流路的縱向?qū)挾?高度)和/或橫向?qū)挾?粗度)設(shè)定在0.1mm~300mm的范圍內(nèi)。例如，與流路 的長度方向垂直的剖面的最長部分的長度優(yōu)選在1mm~100mm的范圍內(nèi)，例如，在該流路為 圓筒形時，該流路的內(nèi)徑優(yōu)選在1mm~100mm的范圍內(nèi)，此外例如在該流路為方筒形時，優(yōu)選 將該流路的縱向?qū)挾?高度)和/或橫向?qū)挾?粗度)設(shè)定在1mm~100mm的范圍內(nèi)。
[0109] 由此，通過在接種了細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)器4中依次導(dǎo)入規(guī)定的培養(yǎng)液，從而能夠使多 能干細(xì)胞分化為目標(biāo)細(xì)胞、并且W尺寸均勻的聚集體形式獲得期望分化狀態(tài)的細(xì)胞。例如， 在接種了多能干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)器4中按照分化誘導(dǎo)為膜島細(xì)胞的條件依次導(dǎo)入規(guī)定的培 養(yǎng)液，從而能夠W尺寸均勻的聚集體形式獲得膜島細(xì)胞。通過將細(xì)胞聚集體的尺寸控制為 一定，能夠?qū)崿F(xiàn)均勻的分化誘導(dǎo)效率，能夠?qū)崿F(xiàn)較高細(xì)胞存活率。此外，通過W細(xì)胞聚集體 的狀態(tài)進(jìn)行分化誘導(dǎo)，從而無需在誘導(dǎo)過程中進(jìn)行聚集體化，操作得W簡化。認(rèn)為細(xì)胞培養(yǎng) 器4的孔17中的聚集體的培養(yǎng)更接近于形成立體結(jié)構(gòu)地進(jìn)行的生物體中的發(fā)育過程，因此， 可能能夠誘導(dǎo)出與現(xiàn)有技術(shù)相比具有更接近生物體的膜島的性質(zhì)的膜島細(xì)胞(模擬膜島）。
[0110] 在從細(xì)胞培養(yǎng)器4取出細(xì)胞聚集體時，例如，將細(xì)胞培養(yǎng)器4上下顛倒，使聚集體從 孔17落到溝槽11中，進(jìn)而，從導(dǎo)入端導(dǎo)入培養(yǎng)液，從而可W從排出端取出包含細(xì)胞聚集體的 培養(yǎng)液。此外，還可W將蓋10從主體9拆下，從各孔17取出細(xì)胞聚集體。
[0111] 上述例子中，細(xì)胞懸液是直接導(dǎo)入細(xì)胞培養(yǎng)器4中的，但也可W使用袋2。使用者將 管7的另一端與細(xì)胞培養(yǎng)器4的導(dǎo)入端連接，在袋2中加入細(xì)胞懸液，操作累3,由此從袋2中 抽吸細(xì)胞培養(yǎng)液并向著細(xì)胞培養(yǎng)器4排出。通過經(jīng)由管7向細(xì)胞培養(yǎng)器4導(dǎo)入細(xì)胞懸液，細(xì)胞 被接種到細(xì)胞培養(yǎng)器4中。按照W例如2秒左右使細(xì)胞懸液遍及細(xì)胞培養(yǎng)器4的溝槽11的整 體的方式，將細(xì)胞懸液導(dǎo)入。然后，在細(xì)胞懸液被導(dǎo)入細(xì)胞培養(yǎng)器4后靜置時，停止累3的動 作。
[0112] (變形例）
[0113] 上述實(shí)施方式中，孔17的形狀在俯視下為圓形，縱剖面為半楠圓形，其還可W為如 下的變形。
[0114] 圖7為示出孔的剖面形狀的例子的圖。圖7(a)的例子中，孔17的剖面形狀呈S角 形。此時，孔17的整體的形狀為錐形。圖7(b)的例子中，孔17的剖面形狀為半圓形。此時，孔 17的整體的形狀為半球形。圖7(c)的例子中，孔的剖面形狀是底的部分為圓角的長方形。此 時，孔17的整體的形狀是圓柱狀，底部為球狀。
[0115] 孔17的剖面形狀不限于圖7的例子，優(yōu)選向著底部逐漸變細(xì)。運(yùn)是為了使細(xì)胞在孔 17的底的部分聚集、容易形成聚集體。
[0116] 圖8是溝槽的底面的孔的俯視圖的例子。圖8中示出了孔17的形狀的變形例。圖8 (a)的例子中，各孔17的形狀在俯視下為等邊=角形。圖8(b)的例子中，各孔17的形狀在俯 視下為正方形。圖8(c)的例子中，各孔17的形狀在俯視下為菱形。圖8(a)(b)(c)的例子中， 在溝槽11的底面中，鄰接的孔17之間被孔17鋪滿。運(yùn)些例子中，各孔17與鄰接的孔17接觸， 與圖3那樣的圓形的孔17不同，在孔17和孔17之間不存在如圖6(a)那樣的水平部20。因此， 在孔17W外的部分細(xì)胞不易被培養(yǎng)，因此容易形成均勻的細(xì)胞團(tuán)塊。運(yùn)些孔17的各邊的長 度優(yōu)選100皿~5mm?？?7的高度(深度)優(yōu)選100皿~5mm?？?7的各邊的長度是孔17的大小 的一個例子。此外，孔17的形狀不限于上述例子，也可W是孔17周邊的水平部分較小或者該 水平部分不存在的其它形狀?？?7的邊的長度是孔17的寬度的一個例子。
[0117] 此外，圖8(d)的例子中，各孔17的形狀為長方形，在溝槽11的底面沒有空隙地鋪滿 了孔17。通過W運(yùn)種方式構(gòu)成孔17而形成圓柱狀的細(xì)胞團(tuán)塊。長方形的孔17的短邊的長度 優(yōu)選100皿~5mm。孔17的高度(深度)優(yōu)選100皿~5mm。長方形的孔17的短邊的長度是孔17 的寬度的一個例子。即使是圓柱狀的細(xì)胞團(tuán)塊，只要從圓柱的側(cè)面至聚集體的中屯、部的距 離是細(xì)胞存活所需的氧氣、營養(yǎng)能夠擴(kuò)散的距離即可。
[0118] 此外，上述的實(shí)施方式中，流路采用了圖3等的溝槽11那樣的形狀，其還可W為如 下的變形。
[0119] 圖9為示出流路的形狀的例子的圖。圖9是中間部14的俯視圖的例子。中間部14中 的流路的形狀不限于圖3的例子，也可W為其它形狀。
[0120] 如圖9(a)所示，也可W是中間部14與一端部12和另一端部13的寬度相同，不存在 錐形部15、16。通過采取該形狀，導(dǎo)入到導(dǎo)入端的培養(yǎng)液即使比圖3那樣的流路中的流速快， 也能夠可靠地遍及中間部14的兩側(cè)壁面。如圖9(b)所示，按照錐形部15的2個側(cè)壁面的切線 (切面)與由導(dǎo)入端向排出端的方向（X方向）所成的角度為45度W下的方式來形成錐形部 15。優(yōu)選錐形部15的2個側(cè)壁面的任意位置的切線(切面)與X方向所成的角度為45度W下。 通過運(yùn)種方式，從導(dǎo)入端導(dǎo)入的培養(yǎng)液可遍及錐形部15的端部(側(cè)壁面）。此時，錐形部15的 側(cè)壁面的形狀可W為平面，也可W為曲面。也可W如圖9(c)所示，不存在中間部14而是錐形 部15和錐形部16連續(xù)。
[0121] 此外，上述實(shí)施方式中說明的蓋10可W是如下的變形。
[0122] 圖10是示出蓋的變形例的細(xì)胞培養(yǎng)器的剖面圖。圖10的細(xì)胞培養(yǎng)器4的剖面圖為 與圖5的剖面圖的位置相同處的剖面圖。圖5等所示的細(xì)胞培養(yǎng)器4的蓋10為平板，蓋10也可 W如圖10所示那樣為向外側(cè)鼓起的圓頂型。此外，也可將蓋10拆下的狀態(tài)來使用。
[0123] 此外，只要培養(yǎng)液同樣地流過溝槽11，則也可W形成將一端部12和外部連接的溝 槽，且使管7與該溝槽和外部的連接部分進(jìn)行連接。同樣地，也可W形成將另一端部13和外 部連接的溝槽，且使管8與該溝槽和外部的連接部分進(jìn)行連接。此時，蓋10不設(shè)置第1孔18及 第2孔。
[0124] 此外，蓋10可W為覆蓋錐形部15、中間部14、錐形部16的形狀，且為一端部12及另 一端部13露出的構(gòu)成。此時，蓋10不設(shè)置第1孔18及第2孔19,管7及管8分別與作為導(dǎo)入端的 一端部12及作為排出端的另一端部13連接。此時，一端部12及另一端部13分別配合管7及管 8的外形而形成，使得與各管連接時培養(yǎng)液不會泄露到外部。
[0125] 此外，對于上述的實(shí)施方式的袋2及管6而言，可W為如下的變形。
[0126] 在管6的途中設(shè)置能夠?qū)艿倪B接端進(jìn)行切換的切換閥口，可W使多個用于收容 培養(yǎng)液的袋2與該切換閥口連接。此時，可W通過操作切換閥口容易地進(jìn)行培養(yǎng)液的更換。
[0127] 此外，上述的實(shí)施方式中說明的細(xì)胞培養(yǎng)器4可W為如下的變形。
[01%]圖12是示出細(xì)胞培養(yǎng)器的變形例的圖。圖12為細(xì)胞培養(yǎng)器4的主體9的變形例的俯 視圖。圖3的細(xì)胞培養(yǎng)器4中，錐形部15、中間部14、錐形部16中形成有孔17，圖12的細(xì)胞培養(yǎng) 器4中，錐形部15及錐形部16中不形成孔17,在中間部14中形成有孔17。在使培養(yǎng)液流入細(xì) 胞培養(yǎng)器4時，錐形部15及錐形部16與中間部14的寬度不同，因此培養(yǎng)液的流速有時是不同 的。因此，通過在錐形部15及錐形部16中不形成孔17、在中間部14中形成孔17,能夠使各孔 17中的培養(yǎng)條件更均勻。由于中間部14的寬度是均勻的，因此，在中間部14內(nèi)，培養(yǎng)液W均 勻的速度流動。在中間部14中，靠近錐形部15或錐形部16的區(qū)域也可W不形成孔17。
[0129] 圖13是示出本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的變形例1的圖。圖13的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)1具 有袋2、累3、作為分支部的切換閥口 41、多個細(xì)胞培養(yǎng)器4、多個廢液保存用的袋5。袋2和累3 之間W管6連接，累3和切換閥口 41之間W管7連接，切換閥口 41和細(xì)胞培養(yǎng)器4之間W管42 連接，細(xì)胞培養(yǎng)器4和袋5之間W管8連接。切換閥口 41對由管7流出的培養(yǎng)液等液體的流動 目標(biāo)進(jìn)行切換。各管8可W與1個袋5連接。其中，細(xì)胞培養(yǎng)器4按照在水平方向上并排的方式 排列。通過運(yùn)種方式，可W-次性地培養(yǎng)更多的細(xì)胞。此外，根據(jù)培養(yǎng)條件而無需不斷向細(xì) 胞培養(yǎng)器4持續(xù)流入培養(yǎng)液時，通過用切換閥口 41的連接端對流入培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)器4進(jìn) 行切換，能夠高效地同時培養(yǎng)較多的細(xì)胞。圖13中是排列有3個細(xì)胞培養(yǎng)器4的情況，細(xì)胞培 養(yǎng)器4的數(shù)量不限于3個。
[0130] 圖14是示出本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的變形例2的圖。圖14的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)1具 有袋2、累3、作為分支部的切換閥口 41、多個細(xì)胞培養(yǎng)器4、多個廢液保存用的袋5。其中，細(xì) 胞培養(yǎng)器4按照在垂直方向上重疊的方式排列。通過運(yùn)種方式，可W-次性地培養(yǎng)較多的細(xì) 胞。其中，按照與管42或管8連接的孔位于細(xì)胞培養(yǎng)器4的側(cè)面的方式配置細(xì)胞培養(yǎng)器4。通 過將孔配置在側(cè)面，可W使細(xì)胞培養(yǎng)器4在垂直方向上重疊。此外，根據(jù)培養(yǎng)條件而無需不 斷向細(xì)胞培養(yǎng)器4持續(xù)流入培養(yǎng)液時(可W間歇性地供給培養(yǎng)液時），通過用切換閥口41對 流入培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)器4進(jìn)行切換，能夠高效地同時培養(yǎng)較多的細(xì)胞。圖14中是排列有3 個細(xì)胞培養(yǎng)器4的情況，細(xì)胞培養(yǎng)器4的數(shù)量不限于3個。
[0131] 進(jìn)而，通過將變形例1及變形例2組合，在水平方向和垂直方向都排列細(xì)胞培養(yǎng)器 4,從而能夠培養(yǎng)更多的細(xì)胞。
[0132] 實(shí)施方式、變形例中，錐形部15、中間部14、錐形部16的壁面的高度優(yōu)選10皿W上 且lOOmmW下。更優(yōu)選100皿W上且lOmmW下。進(jìn)一步優(yōu)選200皿W上且ImmW下。壁面的高度 過低時，難W使新鮮的培養(yǎng)液遍及各孔17。此外，壁面的高度過低時，培養(yǎng)液的流動速度變 快，有使細(xì)胞從孔17脫離之虞。另一方面，壁面的高度過高時，會流入超過培養(yǎng)各孔17內(nèi)的 細(xì)胞所需的培養(yǎng)液，白白浪費(fèi)培養(yǎng)液。此外，壁面的高度過高時，難W使培養(yǎng)液保持恒定的 流動速度，難W維持層流。因此，壁面的高度優(yōu)選在上述所示的范圍內(nèi)。
[0133] 對于培養(yǎng)細(xì)胞的孔17而言，需要W與細(xì)胞的營養(yǎng)消耗、廢物蓄積的速度相適應(yīng)的 速度、頻度注入培養(yǎng)液(培養(yǎng)基）。壁面的高度(培養(yǎng)液流經(jīng)的流路的高度)需要低至使流速 不會增大到影響孔內(nèi)的細(xì)胞聚集體的程度。此外，壁面的高度需要高至在改變培養(yǎng)液的種 類時不產(chǎn)生浪費(fèi)的程度。
[0134] 上述實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)1可W用于要求形成均一尺寸的細(xì)胞聚集體的所有 情況下。即，作為要求形成運(yùn)樣的聚集體的細(xì)胞種類，可W列舉例如膜島細(xì)胞，但本發(fā)明的 細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可W用于膜島細(xì)胞W外的細(xì)胞種類，例如胚狀體、肝臟、屯、肌、神經(jīng)、腎臟、 肺、軟骨、視網(wǎng)膜、絲胞等，除了膜島細(xì)胞W外，可W特別有效地用于胚狀體、肝臟、屯、肌和神 經(jīng)。
[0135] (實(shí)施方式的作用、效果）
[0136] 細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)1是在細(xì)胞培養(yǎng)器4中接種細(xì)胞、導(dǎo)入培養(yǎng)液并培養(yǎng)細(xì)胞的。細(xì)胞培 養(yǎng)系統(tǒng)1的細(xì)胞培養(yǎng)器4中形成有包含多個孔17的流路，可W容易地對細(xì)胞培養(yǎng)器4進(jìn)行培 養(yǎng)液的導(dǎo)入、排出。通過細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)1，能夠容易地進(jìn)行培養(yǎng)液的導(dǎo)入、排出，從而即使不 進(jìn)行離屯、分離等也能夠容易地進(jìn)行培養(yǎng)液的更換。
[0137] 細(xì)胞培養(yǎng)器4中，多個相同大小的孔17是按照與其它孔17鄰接、減小溝槽11的底面 的水平部20的面積的方式設(shè)置的。根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)器4,通過設(shè)置相同大小的孔17,能夠形成 尺寸均勻的細(xì)胞聚集體。此外，通過減小溝槽11的底面的水平部20,從而不易在孔17內(nèi)之外 的位置形成細(xì)胞聚集體，進(jìn)而能夠形成尺寸更均勻的細(xì)胞聚集體。
[0138] 可W將W上的實(shí)施方式、變形例的構(gòu)成在可能的范圍內(nèi)組合而實(shí)施。
[0139] 符號說明
[0140] 1細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)
[0141] 2 袋
[0142] 3 累
[0143] 4細(xì)胞培養(yǎng)器
[0144] 5 袋
[0145] 6 管
[0146] 7 管
[0147] 8 管
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種細(xì)胞培養(yǎng)器，其具備： 流路，其具有導(dǎo)入液體的導(dǎo)入端和底面，所述液體在其中流動，和 多個凹部，其形成于所述流路的所述底面，用于收容細(xì)胞， 所述多個凹部密集地配置于所述流路的所述底面。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)器， 所述流路具有排出所述液體的排出端， 所述流路包含第1區(qū)域，所述第1區(qū)域的寬度從所述導(dǎo)入端起擴(kuò)大到規(guī)定的長度， 所述第1區(qū)域具有與所述流路的底面正交的2個側(cè)壁面， 所述2個側(cè)壁面的切面與從導(dǎo)入端向著排出端的方向所成的角度為45度以下。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞培養(yǎng)器，其中，所述多個凹部在所述流路的所述底面 所占的面積為所述底面的面積的一半以上。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞培養(yǎng)器，其中，所述凹部的周緣進(jìn)行了倒角。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞培養(yǎng)器，其中，所述凹部的寬度為100μπι以上且5mm以 下，所述凹部的高度為100μπι以上且5mm以下。6. -種細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其具備： 權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)器， 調(diào)整向所述細(xì)胞培養(yǎng)器中導(dǎo)入的液體的量的供給裝置，和 收容由所述細(xì)胞培養(yǎng)器排出的細(xì)胞及液體的收容裝置。7. -種細(xì)胞培養(yǎng)方法，其為使用權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)器的細(xì)胞培養(yǎng) 方法，其包含： 在所述凹部中接種細(xì)胞、制作規(guī)定尺寸的聚集體的工序、和 以從所述導(dǎo)入端導(dǎo)入的培養(yǎng)液培養(yǎng)所述聚集體的工序。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中，導(dǎo)入所述流路的液體的流速為lOcm/s以 下。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中，所述培養(yǎng)通過所述流路中的所述培養(yǎng)液 的層流來進(jìn)行。10. 根據(jù)權(quán)利要求7~9中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，接種到所述凹部的所述細(xì)胞為 多能干細(xì)胞。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中，所述多能干細(xì)胞分化為胰島細(xì)胞。
【文檔編號】C12N5/071GK106047690SQ201610239824
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年4月18日
【發(fā)明人】平野邦生, 野田雄郎, 野田雄一郎
【申請人】愛科來株式會社