細(xì)胞內(nèi)汞離子檢測與顯像用二苯乙烯基雙氰基苯雙光子熒光探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于精細(xì)化工領(lǐng)域中細(xì)胞內(nèi)汞離子檢測與顯像用二苯乙烯基雙氰基苯雙 光子熒光探針。
【背景技術(shù)】：
[0002] 汞是一種對人體有害的高毒性重金屬元素，又是一種在工業(yè)上有多種用途的重 要金屬。不同形態(tài)（chemicalspecies)的萊對生物的毒性大小和作用機(jī)理差異很大。金屬 汞有高的擴(kuò)散性和脂溶性，由于汞的蒸氣壓很低，因此易通過呼吸作用進(jìn)入生物體，并通 過血腦屏障（bloodbrainbarrier)進(jìn)入腦組織，在腦組織中被氧化成萊離子。萊離子由于 較難通過血液屏障，被蓄積在腦組織中，從而引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p害；而且由于汞 與細(xì)胞膜結(jié)合后會抑制糖穿過細(xì)胞膜的主動輸送，使鉀對細(xì)胞膜的透性增加，造成對腦細(xì) 胞的糖分供應(yīng)不足而導(dǎo)致腦細(xì)胞能量缺乏；可溶性的無機(jī)汞化合物也有較高毒性，它們通 過消化道進(jìn)入人體后，容易在腎臟和肝臟中蓄積；烷基汞很容易溶于有機(jī)物中，特別易溶 于細(xì)胞膜或腦組織的類脂里，其碳-汞共價鍵不易破壞，對生物體造成極大危害。所以對 于汞離子的檢測以及生物過程研究已經(jīng)成為近年來的研究熱點。與其他檢測方法相比，熒 光檢測具有靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)迅速、檢測快捷方便并可以進(jìn)行實時區(qū)域離子檢測等 優(yōu)點，且雙光子熒光探針使用800-1100nm的激光作為激發(fā)光源，可以避免單光子熒光探針 因使用350-560nm的激發(fā)光而導(dǎo)致的光致毒與光漂白?；贗CT原理的雙光子熒光汞離子 探針絡(luò)合汞離子后，雙光子熒光強(qiáng)度降低，因此可以通過監(jiān)測雙光子熒光強(qiáng)度的變化來確 定汞離子含量的高低，此外，可以借助雙光子熒光顯微鏡對活細(xì)胞或生物組織進(jìn)行汞離子 生物成像，并對汞離子的生理作用與生物過程進(jìn)行實時動態(tài)三維跟蹤研究。
[0003]目前有效的汞離子選擇性熒光探針較少，并且適于細(xì)胞內(nèi)汞離子檢測與成像的 雙光子熒光探針更少。已報道的對汞離子有選擇性的熒光探針主要分兩大類：一是單 光子熒光汞離子探針；二是雙光子熒光汞離子探針。單光子熒光汞離子探針是一種氮 硫雜冠釀或開鏈冠釀[(1)S. Yoon, E.W. Miller, Q. He, P.H. Do, C.J. Chang. A Bright and Specific Fluorescent Sensor for Mercury in Water，Cells，and Tissue. Angew. Chem. Int. Ed.，2007, 46, 6658-6661 ; (2) E. M. Nolan，S. J. Lippard. A "Turn-On" Fluorescent Sensor for the Selective Detection of Mercuric Ion in Aqueous Media. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 14270-14271 ； (3) A. B. Descalzo, R.Marlincz-M anc/,R. Radeglia, K. Rurack，Juan.Soto Coupling Selectivity with Sensitivity in an Integrated Chemosensor Framework:Design of a Hg2+-Responsive Probe,Operating above 500nm. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 3418-3419]，激發(fā)波長在350-560nm，不但易使生物本體產(chǎn)生自 發(fā)熒光干擾，而且短的激發(fā)波長還會對細(xì)胞產(chǎn)生光致毒，因此這種探針的應(yīng)用受到了一定 的限制D
[0004] 雙光子熒光汞離子探針是近年來發(fā)展的一類探針，這類探針具有近紅外激 發(fā)、暗場成像、避免熒光漂白和光致毒、定靶激發(fā)、高橫向分辨率與縱向分辨率、降低生 物組織吸光系數(shù)及降低組織自發(fā)熒光干擾等優(yōu)點。代表性報道為氮硫雜冠醚或開鏈 冠醚雙光子焚光萊離子探針[(1)F. Liu，C. Ding，M.Jin，Y. Tian. A highly selective two-photon fluorescent probe for the determination of mercury ions. Analyst, 2015, 140, 3285-3289 ； (2) C. S. Limj D. ff. Kang, Y. S. Tianj J. H. Han, H. L. Hwang, B. R. Cho.Detection of mercury in fish organs with a two-photon fluorescent probe. Chem. Commun. , 2010, 46, 2388-2390 ； (3) C. Huang, J. Fan, X. Peng, Z. Lin, B. Guo, A. Ren, J. Cuij S. Sun,Highly selective and sensitive twin - cyano - stilbene -based two - photon fluorescent probe for mercury(ii)in aqueous solution with large two - photon absorption cross - section, J. Photochem.Photobio. A: Chem.，2008, 199 (2 - 3) : 144 - 149]，文獻(xiàn)（I)報道的探針不能用于細(xì)胞成像，文獻(xiàn)（2)雖 說能實現(xiàn)成像，但檢測靈敏度不是很理想，文獻(xiàn)（3)正是專利申請人開發(fā)的同類探針，可惜 未曾用于細(xì)胞成像實驗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明改進(jìn)現(xiàn)有的汞離子單、雙光子熒光探針結(jié)構(gòu)和性能上的不足，設(shè)計合成出 適用于活細(xì)胞內(nèi)汞離子檢測、性能優(yōu)良的基于二苯乙烯基雙氰基苯類熒光染料的探針分子 作為研究目標(biāo)。
[0006] 本發(fā)明使用二苯乙烯基雙氰基苯類熒光染料，用叔氮原子連接染料母體和識別受 體，使整個分子的吸收和發(fā)射紅移，染料波長增長。
[0007] 本發(fā)明的細(xì)胞內(nèi)汞離子檢測用二苯乙烯基雙氰基苯雙光子熒光探針具有下列結(jié) 構(gòu)通式（I):
[0008]
本發(fā)明代表性的化合物的合成方法，是讓（E)-2, 5-二{4-[二（2-(2-羥基乙基硫 基）乙基）氨基]苯乙烯基}對苯二甲腈（II )，與2-巰基乙醇（III)反應(yīng)，經(jīng)過柱分離得 到探針純品。在本說明書的實施例中更詳細(xì)地說明了該探針的合成和分析檢測方法。
[0010]
[0011] 本發(fā)明的二苯乙烯基雙氰基苯雙光子熒光探針使用方法沒有特殊的限制。通常， 可以將探針分子溶解在生理鹽水、緩沖液或由乙腈、丙酮、二甲基亞砜等水溶性有機(jī)溶劑， 然后加入含有細(xì)胞組織的適當(dāng)緩沖液中進(jìn)行測試。
[0012] 本發(fā)明的二苯乙烯基雙氰基苯雙光子熒光探針的具體特征如下：
[0013] 探針分子單光子與雙光子激發(fā)分別在467nm與810nm，本身發(fā)射在588nm，并且化 學(xué)-光穩(wěn)定性好；探針分子絡(luò)合汞離子前熒光量子產(chǎn)率較高，絡(luò)合汞離子后熒光量子產(chǎn)率 降低，可以對汞離子進(jìn)行單、雙光子熒光檢測。探針分子對汞離子有很好的選擇性，鈉、鉀、 鈣、鎂、錳等金屬離子對檢測沒有干擾；探針分子對pH變化不敏感，在pH 4. 5 - 13的范圍 內(nèi)，PH變化對熒光發(fā)射沒有影響；探針分子與汞離子之間的解離常數(shù)在微摩爾級范圍內(nèi)， 可以檢測微摩爾濃度的細(xì)胞汞離子；探針分子細(xì)胞滲透性好，對細(xì)胞本身沒有毒副作用，適 于細(xì)胞內(nèi)汞離子濃度變化的檢測?？晒簿劢辜す怙@微鏡得到各類活細(xì)胞或組織內(nèi)汞離子的 分布熒光圖像或假彩比例熒光圖像。
【附圖說明】
[0014] 圖1是本發(fā)明的熒光探針分子I對汞離子的紫外-可見光滴定。紫外-可見光滴 定中的熒光探針分子I的濃度為K) ~mol/L，箭頭表示吸收強(qiáng)度與單光子發(fā)射強(qiáng)度隨汞離 子濃度的增加而變化的趨勢。橫坐標(biāo)為波長（nm)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。
[0015] 圖2是本發(fā)明的熒光探針分子I對汞離子的單光子熒光滴定。單光子熒光滴定中 的熒光探針分子I的濃度為I %nml/L，箭頭表示吸收強(qiáng)度與單光子發(fā)射強(qiáng)度隨汞離子濃度 的增加而變化的趨勢。橫坐標(biāo)為波長（nm)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。
[0016] 圖3是本發(fā)明的熒光探針分子I對汞離子的雙光子熒光滴定。雙光子熒光滴定中 的熒光探針分子I的濃度為1矣mol/L，箭頭表示雙光子發(fā)射強(qiáng)度隨汞離子濃度的增加而 變化的趨勢。橫坐標(biāo)為波長（nm)，縱坐標(biāo)為雙光子焚光強(qiáng)度。
[0017] 圖4是本發(fā)明的熒光探針分子I在不同介質(zhì)中的雙光子激發(fā)譜。從上至下三條 曲線分別表示熒光探針分子I在H 20、toluene和Hg2++H20中的雙光子吸收截面隨雙光子 激發(fā)波長的變化關(guān)系。橫坐標(biāo)為波長（nm)，縱坐標(biāo)為吸收截面（GM，1GM= IXlO5Ws photon lIiiolecule 3 〇
[0018] 圖5是本發(fā)明的熒光探針分子I的雙光子熒光滴定中的絡(luò)合常數(shù)擬合曲線圖。數(shù) 據(jù)點表示對應(yīng)于不同汞離子濃度的相對雙光子熒光強(qiáng)度，對這些數(shù)據(jù)點進(jìn)行Sigmoidal擬 合得到一條曲線，所得擬合參數(shù)即為熒光探針分子I的絡(luò)合常數(shù)，以Pk表示。橫坐標(biāo)為汞 離子濃度（mol/L)，縱坐標(biāo)為相對雙光子焚光強(qiáng)度。
[0019] 圖6是本發(fā)明的熒光探針分子I對金屬離子的單光子選擇性示意圖。橫坐標(biāo)表示 熒光強(qiáng)度百分淬滅率，縱坐標(biāo)為不同的離子。
[0020] 圖7是本發(fā)明的熒光探針分子I