一種鹿prdx4基因及其克隆方法與編碼蛋白的制作方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鹿PRDX4基因及其克隆方法與編碼蛋白，屬于基因工程技術(shù)領 域。
【背景技術(shù)】
[0002] PRDX4是PRDXs家族的重要成員，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。PRDX4的作用機制主要有兩種： 一是參與細胞的氧化還原反應，防止細胞氧化損傷；二是可以作為激活NF-kB和ICAM-1氨 基端激酶的一類TRX依賴的過氧化物酶。目前，多種動物的PRDX4mRNA序列已經(jīng)成功克隆 出來，在UNIPR0T上已有人、盤基網(wǎng)柄菌、小鼠、大鼠和牛5個物種的PRDX4序列被鑒定出來 且通過審閱。梅花鹿PRDX4蛋白在角柄骨膜致敏區(qū)細胞中的顯著性表達說明其可能在鹿茸 快速生長繁殖、分化迀移及維持組織細胞穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用，但目前梅花鹿基因組序列 尚未測出，有關梅花鹿PRDX4基因的克隆和功能研究均未見報道，給梅花鹿PRDX4cDNA序列 帶來了很大困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種鹿過氧化還原酶4(Peroxiredoxin4, PRDX4) 基因PRDX4,所采取的技術(shù)方案如下：
[0004] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種鹿過氧化還原酶4基因PRDX4,該基因的核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1所示。經(jīng)過分析所獲得的鹿過氧化還原酶4基因PRDX4, mRNA翻譯區(qū) 序列長度為819bp，包含有起始密碼子ATG和終止密碼子TGA，序列含A204個，含C 202個， 含 G 212 個，含 T 201 個，含量分別為 24.9%、24.7%、25.9%、24.5%。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述基因編碼的蛋白，該蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID N0. 2所示。經(jīng)分析，所獲得的鹿過氧化還原酶4,其氨基酸序列長度為272個氨基 酸，親水性蛋白，有兩個保守功能域，分別是PRX_Typ2cys (Peroxiredoxin family, Typical 2_Cys PRX subfamily)和 AhpC(Alkyl hydroperoxide reductase, AhpC)，前 38 個氨基酸 殘基 MEAPPPPLPA MTLAPGRSRK LLLLPLLLFL LRAEAVRG 可能是信號肽序列。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述基因的克隆方法，其步驟如下：
[0007] 1)采取梅花鹿的角柄骨膜致敏區(qū)細胞并進行培養(yǎng)，獲得鹿角柄骨膜致敏區(qū)細胞；
[0008] 2)提取步驟1)中獲得的鹿角柄骨膜致敏區(qū)細胞中的mRNA，根據(jù)所得mRNA合成 cDNA ；
[0009] 3)設計PCR擴增引物；
[0010] 4)以步驟2)所得的cDNA為模板，利用步驟3)設計的引物進行PCR擴增，利用電 泳鑒定并回收目標擴增產(chǎn)物；
[0011] 5)對步驟4)所得的目標擴增產(chǎn)物進行生物信息分析鑒定。
[0012] 優(yōu)選地，步驟1)所述培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是：利用含有10%胎牛血清，1%青鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基，在37°C，5. 00% C02的條件下培養(yǎng)3天。
[0013] 優(yōu)選地，步驟3)所述擴增引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 4所示。
[0014] 優(yōu)選地，步驟4)所述PCR擴增，擴增條件為：95°C預變性5min，94°C 30s，67. 3°C 3〇8,72°(：15〇8,30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72°(：1111111。
[0015] 優(yōu)選地，步驟5)所述分析鑒定，是利用核酸電泳判斷檢測泳道中是否含有大小為 800-900bp的條帶，再通過與已知物種序列進行對比分析，確定目的片段是否為目的片段。
[0016] 所述方法的具體步驟如下：
[0017] 1)采取梅花鹿的角柄骨膜致敏區(qū)細胞，并利用含有10%胎牛血清，1 %青鏈霉素 的DMEM培養(yǎng)基，在37°C，5. 00% C02的條件下培養(yǎng)3天，獲得鹿角柄骨膜致敏區(qū)細胞；
[0018] 2)提取步驟1)中獲得的鹿角柄骨膜致敏區(qū)細胞中的mRNA，根據(jù)所得mRNA合成 cDNA；
[0019] 3)設計PCR擴增步驟2)所述cDNA的引物，獲得如SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 4的 引物；
[0020] 4)以步驟2)所得的cDNA為模板，利用步驟3)所獲得的引物進行PCR擴增，擴增 條件為：95°C預變性5min，94°C 30s，67. 3°C 30s，72°C 15〇8,30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72°〇 lmin，獲得擴增產(chǎn)物；
[0021] 5)利用核酸電泳判斷步驟4)通過對比marker，所得擴增產(chǎn)物中是否含一條 800-900bp的DNA條帶，再通過與已知物種序列進行對比分析，確定目的片段是否為目的片 段。
[0022] 本發(fā)明獲得的有益效果：
[0023] PRDX4蛋白的存在能夠保證細胞和組織的正常生長增殖；激活NF-kB和ICAM-1 氨基端激酶的一類TRX依賴的過氧化物酶；PRDX4可以保護胰島0細胞免受損傷，抗衰老。 克隆出該基因后，可以進行下一步的蛋白表達載體構(gòu)建，研究PRDX4蛋白表達及與其他鹿 茸再生相關蛋白的相互作用，以期揭示其在鹿茸再生過程中的作用。
[0024] 本發(fā)明通過引物設計方法優(yōu)化及RT-PCR成功克隆出梅花鹿PRDX4cDNA序列，并進 行生物信息學分析。本發(fā)明中的引物設計優(yōu)化方法可以給其他非模式生物或無全基因組學 列物種的基因克隆及表達提供理論參考。
【附圖說明】
[0025] 圖1為鹿過氧化還原酶4基因PRDX4的核酸電泳圖。
【具體實施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。
[0027] 以下實施例中所用材料、試劑、儀器和方法，未經(jīng)特殊說明，均為本領域中的常規(guī) 材料、試劑、儀器和方法，均可通過商業(yè)渠道獲得。
[0028] 梅花鹿（Cervus nippon)角柄骨膜取自中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所實驗鹿場。
[0029] 實施例1鹿角柄骨膜細胞的提?。⊿un H等，2012)及mRNA的提取
[0030] 將從中國農(nóng)業(yè)科學特產(chǎn)研究所實驗鹿場獲得的梅花鹿角柄骨膜取回后，根據(jù) Sun H 等人（Sun H, Yang F, Chuff,Zhao H, McMahon C, Li C. Lentiviral-mediated RNAi knockdown of Cbfal gene inhibits endochondral ossification of antler stem cells inmicromass culture. PLoS One. 2012, 7(10): e47367)的方法對所得骨膜進行處理，并獲 得梅花鹿的角柄骨膜致敏區(qū)細胞。
[0031] 將鹿茸角柄骨膜致敏區(qū)細胞放在含有20ml的10%胎牛血清，1 %青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基的75cm2培養(yǎng)瓶中，37°C，5. 00% C02的條件下培養(yǎng)2天；棄去舊培養(yǎng)液，換20ml同上 的新培養(yǎng)液同等條件下繼續(xù)培養(yǎng)1天，獲得鹿角柄骨膜致敏區(qū)細胞。
[0032] 細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)好的梅花鹿角柄骨膜致敏區(qū)細胞，棄去培養(yǎng)液，胰酶消化收集 細胞，1*細胞洗滌液（上海生工）洗滌兩次，用于梅花鹿角柄骨膜致敏區(qū)細胞總RNA的提取 (PureLink? RNA Mini Kit, Life Technologies)，然后合成 cDNA 第一鏈（Prime Script? First Stand cDNA Synthesis