棉纖維發(fā)育相關(guān)的GhDUF231L1基因克隆與鑒定的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及棉花基因。具體是一個棉纖維特異表達的DUF231家族基因 GhDUF231Ll及其啟動子的克隆與功能鑒定。
【背景技術(shù)】：
[0002] 棉纖維是已知的纖維素純度最高的天然資源之一，在世界紡織業(yè)中占有重要地 位。雖然合成纖維的出現(xiàn)曾使棉纖維的市場占有率大幅下降，但棉纖維終因有著良好的透 氣性、保暖性和吸濕性以及穿著舒適等優(yōu)點而不可取代。隨著高效、快速的紡紗技術(shù)的引 入，以及人們保健意識的增強和生活水平的提高，對棉纖維品質(zhì)的要求愈加迫切。纖維強度 是原棉品質(zhì)的重要指標，棉纖維次生壁加厚期是棉纖維強度形成的關(guān)鍵時期，纖維素的累 積速率決定了棉纖維的結(jié)構(gòu)和強度。
[0003] 棉花改良的目標是提高棉花產(chǎn)量和品質(zhì)，利用基因工程培育優(yōu)質(zhì)棉品種，是適應 我國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，滿足人們對棉紡織品不同需求的有效途徑之一。雖然傳統(tǒng)棉花育種技 術(shù)對于我國棉花生產(chǎn)的發(fā)展起著重要的作用，但其方法局限于品種間的基因重組，不僅育 種周期長，而且難以解決遺傳連鎖、多基因性狀和雜交不親和性等問題?，F(xiàn)代基因工程技術(shù) 可以將優(yōu)良外源基因?qū)氩⒄系矫藁ɑ蚪M中，使棉花獲得自身不具備的新性狀，并在 其后代植株中得以遺傳和表達。這樣不僅可以突破物種間的遺傳障礙，大跨度地超越物種 間的不親和性，而且可以創(chuàng)造出人們所需要的新品種，因而大大拓寬了棉花遺傳改良的途 徑。棉花纖維品質(zhì)除了受環(huán)境因素影響外，主要由棉花基因型決定。棉花纖維發(fā)育相關(guān)基 因的克隆鑒定，不僅有助于研宄揭示棉花纖維細胞發(fā)育及纖維素合成的分子機理，而且可 以充分利用棉花自身資源改良纖維品質(zhì)，具有重要的理論意義和巨大的潛在經(jīng)濟價值。
[0004] DUF231家族基因編碼了 一類含有未知功能結(jié)構(gòu)域（domainofunknown function，DUF)的蛋白。通常情況下，該類基因還含有一個植物特有的保守 的TBL(trichomebirefringencelike)結(jié)構(gòu)域，在該結(jié)構(gòu)域中有一個典型的 ⑶S(glycine-aspartate-serine)基序。研宄證明，這種保守性存在于一些醋化酶/脂酶當 中（Akohetal.，2004;Uptonetal.，1995)。另外，在該類蛋白C端的DUF231結(jié)構(gòu)域中含 有一個高度保守的氨基酸序列DCXHWCLPGXXDXWN，其中的DCXH基序與⑶S基序中的絲氨酸 殘基一起形成一個具有催化功能的結(jié)構(gòu)（Bischoffetal.，2010 ;M?lgaardetal.，2004)。
[0005] 目前，在擬南芥中共發(fā)現(xiàn)46個該基因家族成員，其中，TBR(trichome birefringence)與它的同源基因TBL3能夠與纖維素合成酶基因CESA(cellulose synthase)共表達。抑制擬南芥TBR或TBL3的表達導致表皮毛和莖的次生細胞壁中的結(jié)晶 纖維素含量下降，下胚軸中果膠甲基酯化酶活性升高，果膠甲基酯化程度降低，說明DUF231 蛋白可能參與維持擬南芥某些組織器官細胞壁中果膠（尤其是同型半乳糖醛酸聚糖）的 酯化過程中，而這個過程則保證了次生壁中纖維素的正常合成（Bischoffetal.，2010)。 AXY4和其同源基因AXY4L同屬于DUF231家族成員，敲除擬南芥中的AXY4,導致植株除了種 子之外，其它組織器官細胞壁中的木葡聚糖完全缺失0-乙酰化修飾，而種子中木葡聚糖的 乙?；揎梽t完全由其同源基因AXY4L來控制。AXY4可能是一種多糖特異性（尤其是木葡 聚糖特異性）的〇-乙酰基轉(zhuǎn)移酶。雖然這種?；D(zhuǎn)移酶的活性以及?；D(zhuǎn)移的位置目前 還不清楚，但過量表達AXY4不僅增加了木葡聚糖的乙?；潭?，而且能夠使木葡聚糖中的 半乳糖殘基發(fā)生雙乙?；F(xiàn)象，說明AXY4能夠?qū)⒍鄠€乙?；鶊F加到同一個半乳糖殘基上。 另外，AXY4將乙酰基團加在一個特定的位置，而該位置上的乙?；鶊F則能夠通過化學位移 移至其它位置，從而將這個0-乙?；某跏嘉稽c空出，以備后續(xù)乙酰化的進行（Gilleet al.，2011)。ESK1 (Eskimol)是DUF231家族的又一成員，定位于木聚糖的合成場所一高爾基 體中。eskl突變體中，次生壁厚度變薄，莖的支撐力減弱?；瘜W方法分析該突變體的細胞壁 組分發(fā)現(xiàn)，雖然ESK1的突變并未引起木聚糖鏈長度以及還原端豐度的變化，但是卻使得木 聚糖的乙?；潭让黠@下降。進一步對木聚糖的結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)，ESK1的突變導致木聚 糖中的木糖殘基上2-0-和3-0-乙?；潭鹊慕档停╕uanetal.，2013)。另外，全基因組 的基因表達比對顯示，ESK1表達量的改變導致冷信號途徑中的轉(zhuǎn)錄因子以及應答基因的轉(zhuǎn) 錄水平也隨之發(fā)生變化，而且eskl突變體增強了擬南芥植株對冷脅迫的耐受，說明ESK1在 擬南芥應對冷脅迫的過程中發(fā)揮著調(diào)節(jié)因子的作用（Xinetal.，2007)。上述研宄表明，目 前擬南芥中已知的DUF231家族成員均參與到了次生壁物質(zhì)的合成與修飾過程當中，而大 量該家族成員的功能還有待挖掘。特別是該類基因如何參與棉纖維發(fā)育的調(diào)控，值得研宄 探討，以揭示該類基因的生物學功能，為棉纖維品質(zhì)改良提供科學依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一個新的棉纖維次生壁發(fā)育階段優(yōu)勢表達的DUF231基因 GhDUF231Ll及其啟動子，分析揭示該基因功能和啟動子活性，探索其對棉纖維發(fā)育調(diào)控的 分子機制，進而應用該基因改良棉纖維品質(zhì)，創(chuàng)造棉花優(yōu)良品種。
[0007] 提取棉花基因組DNA，利用PCR和基因組步移法（TakaraGenomeWalkingKit)分 離克隆了GhDUF231Ll基因及其5' -上游區(qū)。序列分析表明，該基因5' -上游區(qū)是1. 6kb 的啟動子序列，編碼區(qū)（0RF)由5個外顯子組成，其間插入了 4個內(nèi)含子。其中，第一個內(nèi) 含子長97bp，插入第146位氨基酸密碼子內(nèi)；第二個內(nèi)含子長131bp，插入第236位氨基酸 密碼子內(nèi)；第三個內(nèi)含子長94bp，插入第345位氨基酸密碼子內(nèi)；第四個內(nèi)含子長85bp，插 入第429與430位氨基酸密碼子之間。
[0008] 由于GhDUF231Ll基因在開花后20天（20DPA)的棉纖維中高量表達，因此，我們提 取了 20DPA棉纖維的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，繼而以20DPA棉纖維cDNA為模板，利用PCR技術(shù) 分離鑒定了GhDUF231Ll的cDNA全長序列。GhDUF231Ll的cDNA包含了一個1293bp的開放 閱讀框，編碼一個含有430氨基酸的蛋白質(zhì)。該蛋白的N端包含一個跨膜結(jié)構(gòu)域和TBL結(jié) 構(gòu)域，而C端則含有一個典型的DUF231結(jié)構(gòu)域。通過同源進化分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白與擬南芥 TBL3同源性較高。已有研宄表明，AtTBL3能夠調(diào)控擬南芥果膠甲基酯化酶的活性，進而影 響次生細胞壁中纖維素的含量，這暗示GhDUF231Ll可能在棉纖維中發(fā)揮著類似的功能。
[0009] 對GhDUF231Ll在棉花組織中的表達情況進行了分析，發(fā)現(xiàn)該基因在棉纖維細 胞發(fā)育早期（1 _ 12DPA)僅有弱的表達，隨著纖維細胞進一步發(fā)育至次生壁合成期（15 -20DPA)，該基因表達量急劇升高，至20DPA時達到峰值。在棉花其他組織中，該基因不表達 或僅有微弱表達。
[0010] 構(gòu)建GhDUF231Ll啟動子：⑶S基因表達載體，利用⑶S報告基因，在轉(zhuǎn)基因擬南芥 中檢測了該啟動子的表達活性。分析表明，GhDUF231Ll啟動子擬南芥轉(zhuǎn)基因幼苗中有表達 活性，隨著植株進一步發(fā)育成熟，其GUS表達活性主要集中在植株的維管組織（例如，葉脈 和莖維管系統(tǒng)）中。另外，實驗表明，GhDUF231Ll啟動子區(qū)域含有能夠與上游轉(zhuǎn)錄因子結(jié) 合的順式作用元件，具有一定的特異表達活性。
[0011] 將GhDUF231Ll:eGFP融合載體轉(zhuǎn)化煙草葉片，培養(yǎng)48小時后，撕取煙草葉片表皮 進行觀察發(fā)現(xiàn)，GFP綠色熒光信號出現(xiàn)在煙草細胞的細胞膜，表明GhDUF231Ll蛋白可能定 位于細胞膜。
[0012] 構(gòu)建了GhDUF231Ll基因的過量表達載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株， 選取多個后代株系進行表型分析。與野生型相比，過量表達GhDUF231Ll基因的轉(zhuǎn)基因擬南 芥株高明顯增加，莖部細胞壁中纖維素含量有所升高，細胞壁中一些單糖組分含量也發(fā)生 了顯著的變化。以上這些結(jié)果表明，GhDUF231Ll參與植物次生細胞壁合成過程的調(diào)節(jié)，這 暗示該基因在棉纖維細胞次生壁形成過程中可能具有重要調(diào)控功能。
[0013] 本發(fā)明的優(yōu)點：
[0014] 1.提供了一個新的棉纖維次生壁發(fā)育特異表達的GhDUF231Ll基因（包括啟動 子）序列及其cDNA序列。該基因在棉纖維次生壁發(fā)育時期高量表達，表明該基因可能在棉 纖維細胞次生壁生物合成中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。分析了該基因啟動子在轉(zhuǎn)基因擬南芥維 管組