一種呼吸道病原體檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種呼吸道病原體檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 呼吸道感染是人類最常見的疾病之一，一些常見的呼吸道病原體如流感/禽流感 病毒、腺病毒、嗜肺軍團菌及腦膜炎奈瑟菌等的感染是幼兒、年老體弱者及免疫功能低下者 發(fā)病及死亡的主要原因。這些病原體的感染具有感染力強、傳播快、潛伏期短、發(fā)病急、病后 無終身免疫力等特點，近年來，SARS病毒、甲型流感HlNl、禽流感H7N9等呼吸道病原體接連 肆虐全球，給公共衛(wèi)生安全造成很大的危害。
[0003] 因為呼吸道病原體引起的感染癥狀和流行特點相似，且僅靠臨床癥狀很難確定真 正的病原體，而多病毒共感染、病毒的變異和新病毒的出現(xiàn)使呼吸道病毒檢測技術(shù)面臨巨 大挑戰(zhàn)。快速準確鑒定病原體對于制定治療和用藥方案，控制傳染病流行具有重要意義?，F(xiàn) 有技術(shù)中，分離培養(yǎng)雖然是呼吸道病毒檢測的"金標準"，但該方法操作復(fù)雜，耗時長，不適 合用于早期診斷。抗體檢測雖然操作簡便，但其靈敏度和特異性變化較大，容易出現(xiàn)假陽性 和假陰性。最常用的熒光定量PCR檢測有較好的敏感性和特異性，但是需要配備價格昂貴 的儀器，且容易發(fā)生PCR污染。近年來，多重PCR檢測技術(shù)因其快速、簡便和高通量等特點， 在呼吸道病毒檢測中得到廣泛應(yīng)用。多重PCR技術(shù)是在在同一 PCR體系里加入兩對或兩對 以上引物，可以同時檢測出多種病原微生物，非常適合成組的呼吸道病原體檢測。此外，運 用多重PCR方法，還增加了單個樣本中多重感染的檢出率。然而，僅僅使用多重PCR技術(shù)來 進行鑒定不同呼吸道病原體時，不同病原體擴增的核酸片段大小需要具有明顯差異，否則 無法鑒定病原體種類。因此，迫切需要一種快速的高靈敏度、高特異性、可以同時檢測多種 呼吸道病原體的檢測試劑盒，為臨床診斷提出實驗室依據(jù)。
[0004] 本發(fā)明利用多重PCR技術(shù)結(jié)合核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色來檢測一組重要的呼 吸道病原微生物，包括甲型流感/禽流感病毒（FluA)中常見的4種流感亞型，即季節(jié)性流 感H3N2、H1N1、新型甲流HlNl (swHINI)、禽流感H5N1，乙型流感病毒（FluB)、SARS-COV病 毒、嗜肺軍團菌（LP)、腦膜炎奈瑟菌（N. men)及腺病毒（ADV)。本發(fā)明所述核酸侵入反應(yīng)是 根據(jù)待測靶核酸序列(本實驗中為多重PCR擴增產(chǎn)物序列）設(shè)計兩條寡核苷酸探針，即上游 探針和下游探針。其中上游探針與靶序列互補，下游探針含有兩個區(qū)域，3'端序列與靶序 列完全互補，為靶序列特異區(qū)域；5'端序列與靶序列不相關(guān)。所述上、下游探針在核酸侵入 反應(yīng)體系中可以跟靶核酸形成一種由雙鏈DNA和單鏈DNA組成的單堿基侵入重疊結(jié)構(gòu)，這 種特殊的結(jié)構(gòu)被Flap核酸內(nèi)切酶識別后，可被切斷下游探針與靶序列互補的第一個和第 二個堿基之間的化學(xué)鍵，切下的片段稱為Flap片段，能夠作為模板特異性的信號分子。切 割后的下游探針由于與靶核酸雜交不穩(wěn)定而發(fā)生解離，新的下游探針占據(jù)該位置，重新形 成單堿基侵入重疊結(jié)構(gòu)進一步被核酸內(nèi)切酶識別，從而實現(xiàn)Flap片段的積累；而切下來的 Flap片段可以作為第二步侵入切割反應(yīng)的侵入探針，與一個具有發(fā)卡型結(jié)構(gòu)的發(fā)卡探針進 行雜交，再次形成單堿基侵入重疊結(jié)構(gòu)，在核酸內(nèi)切酶的作用下，發(fā)卡探針亦被切割成兩部 分。上述發(fā)卡探針在沒有被切割前，其3'端和5'端可分別同標記有納米金的寡核苷酸探 針A、探針B互補雜交，使得納米金探針形成伸展的納米金顆粒-多核苷酸的多聚網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)， 形成沉淀，反應(yīng)體系呈現(xiàn)無色透明，視為陰性反應(yīng)。而當反應(yīng)體系存在靶核酸時，引起級聯(lián) 信號放大反應(yīng)，大量發(fā)卡探針被切割，不能與兩種納米金探針互補連接，無法引發(fā)納米金的 特征離子吸收發(fā)生變化，反應(yīng)體系呈現(xiàn)紅色，視為陽性反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是：針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種操作簡單、費用低 廉且靈敏度較高的呼吸道病原體檢測試劑盒。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：提供一種呼吸道病原體檢 測試劑盒，其特征在于，包括如下6組引物探針組合中的至少一組：所述第一組引物探針組 合用于檢測腺病毒，上、下游引物如SEO ID NO: 1和SEO ID N0:2所示，上、下游探針如SEO ID N0:13和SEO ID N0:14所示；所述第二組引物探針組合用于檢測甲型流感/禽流感病毒 病毒，上、下游引物如SEO ID NO:3和SEO ID NO:4所示，上、下游探針如SEO ID NO: 15和 SEO ID NO: 16 所示； 所述第三組引物探針組合用于檢測SARS-COV病毒，上、下游引物如SEO ID N0:5和SEO ID N0:6所示，上、下游探針如SEO ID NO: 17和SEO ID NO: 18所示；所述第四組引物探針 組合用于檢測嗜肺軍團菌，上、下游引物如SEO ID NO: 7和SEO ID NO: 8所示，上、下游探針 如SEO ID N0:19和SEO ID N0:20所示；所述第五組引物探針組合用于檢測腦膜炎奈瑟菌， 上、下游引物如SEO ID NO:9和SEO ID NO: 10所示，上、下游探針如SEO ID NO:21和SEO ID N0:22所示；所述第六組引物探針組合用于檢測乙型流感病毒，上、下游引物如SEO ID NO: 11 和 SEO ID NO: 12 所示，上、下游探針如 SEO ID N0:23 和 SEO ID N0:24 所示。
[0007] 優(yōu)選的，該試劑盒還包括雜交探針，如SEQ ID NO: 25所示，核酸內(nèi)切酶AfuFEN，納 米金探針a和納米金探針b，其序列分別為SEQ ID NO: 26和SEQ ID NO: 27。6組引物及探 針組合中，各引物在多重PCR反應(yīng)體系中的終濃度為0. 5-2 μ M，各探針在反應(yīng)體系中的終 濃度為 〇. 1-0. 3 μ Μ。
[0008] 本發(fā)明的有益效果是：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點如下：本發(fā)明所提供試劑 盒首次將多重PCR技術(shù)結(jié)合核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色應(yīng)用于呼吸道病原體檢測，樣本的 陽性顯色結(jié)果均為肉眼可見的紅色，而陰性對照為無色，不需要配備昂貴的儀器，通過肉眼 即可觀察檢測結(jié)果，成本低廉。而且核酸侵入反應(yīng)不依賴核酸序列，而只依賴核酸形成的特 異性結(jié)構(gòu)，并且由于該反應(yīng)并非擴增待測模版本身，極大的降低了模版交叉污染的風(fēng)險，可 以在基層得到應(yīng)用。
[0009] 此外，本發(fā)明的引物和探針的特異性強，靈敏度高，可一次性分析大量樣本，同時 對多種呼吸道病原體進行檢測，減少操作步驟，節(jié)省了資源。
【附圖說明】
[0010] 圖1為核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色結(jié)果；1和2 :FluB膠體金檢測結(jié)果及其陰性對 照、3和4 :SARS-C0V膠體金檢測結(jié)果及其陰性對照、5和6 :LP膠體金檢測結(jié)果及其陰性對 照、7和8 :N. men膠體金檢測結(jié)果及其陰性對照、9和10 :ADV膠體金檢測結(jié)果及其陰性對 照。
[0011] 圖2為FluA病原體核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色結(jié)果；1和2 :swH1N1膠體金檢測 結(jié)果及其陰性對照、3和4 :H1N1膠體金檢測結(jié)果及其陰性對照、5和6 :H3N2膠體金檢測結(jié) 果及其陰性對照、7和8 :H5N1膠體金檢測結(jié)果及其陰性對照。
[0012] 圖3為甲型流感病毒HlNl RNA模板量為0、10°、101、102、103、104、IO 5拷貝時經(jīng)多重 PCR擴增結(jié)合核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色方法后的檢測結(jié)果。
[0013] 圖4為FluB RNA模板量為0、10°、IO1、102、103、IO4拷貝時經(jīng)多重PCR擴增結(jié)合核 酸侵入反應(yīng)及納米金顯色方法后的檢測結(jié)果。
[0014] 圖5為SARS-COV RNA模板量為0、10°、101、102、103、IO4拷貝時經(jīng)多重PCR擴增結(jié) 合核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色方法后的檢測結(jié)果。
[0015] 圖6為ADV病毒DNA模板量為0、10°、101、102、IO 3拷貝時經(jīng)多重PCR擴增結(jié)合核酸 侵入反應(yīng)及納米金顯色方法后的檢測結(jié)果。
[0016] 圖7為LP DNA模板量為0、10°、101、102、IO3拷貝時經(jīng)多重PCR擴增結(jié)合核酸侵入 反應(yīng)及納米金顯色方法后的檢測結(jié)果. 圖8為N. men DNA模板量為0、10°、101、102、IO3拷貝時經(jīng)多重PCR擴增結(jié)合核酸侵入反 應(yīng)及納米金顯色方法后的檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0017] 下面將結(jié)合說明書附圖，對本發(fā)明作進一步的說明。
[0018] 本發(fā)明所述呼吸道病原體檢測試劑盒采用多重PCR結(jié)合核酸侵入反應(yīng)及納米金 顯色原理，首先對待測樣本進行多重PCR擴增，實現(xiàn)對目標模板的擴增；接著進行核酸侵入 信號放大反應(yīng)，將目標模板的檢測轉(zhuǎn)化為信號分子的檢測，并實現(xiàn)檢測信號放大；最后進行 納米金探針雜交反應(yīng)，實現(xiàn)對信號分子的檢測。
[0019] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。
[0020] 實施例一 ：9種常見呼吸道病原體試劑盒檢測方法 1樣本選擇：選擇常見的呼吸道病原體：RNA病毒，包括H3N2、H1N1、swHI