mo-miR-374在制備腎毒性生物標志物中的用圖
【專利說明】mo-mi R-374在制備腎毒性生物標志物中的用途
[0001] 本申請要求申請日為2014年7月10日，申請?zhí)枮?01410328083. 7,發(fā)明名稱為 "一種腎毒性生物標志物及其用途"的中國專利申請的優(yōu)先權(quán)。本申請引用該中國專利申請 的全文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種mo-miR-374在制備腎毒性生物標志物 中的用途及試劑盒和引物。
【背景技術(shù)】
[0003] 腎臟是體內(nèi)最重要的排泄器官，也是外源性毒物在體內(nèi)的主要靶器官之一。很多 化合物（藥物）進入體內(nèi)可引起腎臟毒性損傷，據(jù)調(diào)查，急性腎功能衰竭中有32. 4%是由于 藥物腎毒性引起的。因此急需建立發(fā)現(xiàn)和確證新的腎毒性生物標志物，能夠早期發(fā)現(xiàn)腎損 傷，并可以反映出腎臟損傷的改善或加重，甚至能反映損傷的機制。
[0004] 當(dāng)前常規(guī)的腎毒性評價方法，非臨床藥物安全性評價和臨床上常用的腎損傷指標 為血清肌酐（CRE)和尿素氮（BUN)，再進行病理組織學(xué)檢查。CRE易受年齡、性別、種族、飲 食和機體內(nèi)環(huán)境的影響，并且無法預(yù)測早期病變，不能反映腎小管的損傷和壞死；BUN不僅 受腎功能的影響，還受腎外因素如高蛋白飲食、消化道出血等的影響。而且兩者需要病人發(fā) 生急性腎損傷（AKI)幾天后才有限制升高，會延誤腎毒性早期發(fā)現(xiàn)、診斷和治療。
[0005] 隨著腎毒性研究的深入，發(fā)現(xiàn)了一些新的腎臟毒性損傷的檢測指標，如尿總蛋白 (uTP)、血清胱氨酸蛋白酶抑制劑C(CysC)作為藥物腎小球損傷的生物標記物；叢生蛋白、 腎損傷分子（MM-I)、三葉因子-3 (TFF-3)可作為腎小管損傷的生物標志物，但是存在敏感 性、特異性及檢測方法的問題，難以取代傳統(tǒng)的腎毒性檢測。因此，尋找及時、可靠、可行性 強的腎毒性的生物標記物十分有意義。
[0006] miRNA是一類內(nèi)源性、非編碼、單鏈小RNA。它們可以和靶基因 mRNA-3'端非翻譯 區(qū)（3' -UTR)部分或全部互補結(jié)合，在翻譯后水平調(diào)芐基因表達，導(dǎo)致靶基因出現(xiàn)翻譯抑制 或mRNA降解。成熟miRNA大小約18到25個核苷酸。它們首先在細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成初級 miRNA(pri-miRNA)，然后在由RNAase III、Dicer和Drosha形成的蛋白復(fù)合體以及RNA聚合 酶II的作用下形成前體miRNA(pre-miRNA)。pre-miRNA從細胞核進入細胞衆(zhòng)內(nèi)，被Dicer 酶切為約22個核苷酸的雙鏈miRNA。隨后雙鏈被切斷，形成一條成熟的單鏈miRNA。單鏈 miRNA和RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體結(jié)合并選擇性作用靶基因 mRNA的反義互補序列，最終調(diào)控 靶基因的表達。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有的腎毒性生物標記物不夠特異、不能 早期發(fā)現(xiàn)檢測、檢測方法過于復(fù)雜等的問題，提供一種mo-miR-374在制備腎毒性生物標志 物中的用途及試劑盒和引物。所述的用途能夠?qū)o-miR-374應(yīng)用于腎毒性生物標志物的 制備從而檢測外源性化合物引起的腎損傷；所述的試劑盒能夠特異性檢測外源性化合物引 起的腎損傷；所述的引物能夠特異性擴增用以制備腎毒性生物標志物的mo-miR-374。
[0008] 本發(fā)明提供rno-miR-374作為腎毒性生物標志物的用途。
[0009] 本發(fā)明中，所述的rn〇-miR-374是一種miRNA。本發(fā)明中，大鼠的rn〇-miR-374,具 有序列表中SEQ ID No. 1所述的堿基序列。
[0010] 本發(fā)明中所述的腎毒性較佳地來源于外源性化合物引起的腎損傷。所述的 rno-miR-374作為腎毒性生物標志物可以用于檢測外源性化合物引起的腎損傷。
[0011] 本發(fā)明所述的外源性化合物為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳的是慶大霉素（GM)、順鉑、N-苯 基鄰氨基苯甲酸或阿霉素，更佳的是慶大霉素。
[0012] 本發(fā)明中，較佳地，rno-miR-374作為唯一的腎毒性生物標志物單獨使用，或者和 常規(guī)的腎毒性生物標志物聯(lián)合使用。優(yōu)選的，所述的常規(guī)腎毒性生物標志物是血清肌酐、尿 素氣、尿總蛋白和叢生蛋白。
[0013] 本發(fā)明rno-miR-374作為腎毒性生物標志物用于檢測外源性化合物引起的腎損 傷的方法，可以包括以下步驟，檢測腎組織中rno-miR-374的含量。
[0014] 本發(fā)明還提供一種檢測外源性化合物引起的腎損傷的試劑盒，其包括特異性檢測 mo-miR-374的引物，所述的引物為核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示的DNA片段。
[0015] 較佳地，所述的試劑盒還包括RNA抽提試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑和/或qPCR試劑。所述 的RNA抽提試劑為本領(lǐng)域常規(guī)的RNA抽提試劑，較佳地為TRIZ0L。所述的反轉(zhuǎn)錄試劑為本 領(lǐng)域常規(guī)的反轉(zhuǎn)錄試劑，較佳地為RNA逆轉(zhuǎn)錄酶。所述的qPCR試劑為本領(lǐng)域常規(guī)的所述的 qPCR試劑，較佳地為DNA聚合酶。
[0016] 本發(fā)明還提供一種特異性檢測mo-miR-374的引物，其是核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No. 2所示的DNA片段。
[0017] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，rno-miR-374在外源性化合物引起的腎損傷的大鼠血液白細胞中 高表達。所述的血液白細胞可以來源于各個組織的血液，較佳的，后腹主動脈。
[0018] 本發(fā)明尋找腎毒性生物標志物的方法，包括對miRNA芯片表達譜的分析，比較雌 雄大鼠分別經(jīng)外源性化合物處理的不同時間和不做任何處理的對照組的表達譜，然后根據(jù) 已知的功能預(yù)測可能的腎毒性生物標志物。
[0019] 在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實 例。
[0020] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0021] 本發(fā)明的積極進步效果在于：本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)mo-miR-374是外源性化合物 引起的腎損傷的特異性的生物標志物，在外源性化合物引起的腎損傷的血液白細胞中高表 達，能夠發(fā)揮在制備腎毒性生物標志物中用途，從而可以檢測外源性化合物引起的腎損傷。 本發(fā)明提供的試劑盒能夠特異性強、可行性高地檢測腎毒性生物標志物，從而檢測外源性 化合物引起的腎損傷。本發(fā)明提供的引物能夠特異性強地擴增mo-miR-374,并應(yīng)用于所述 的試劑盒中檢測外源性化合物引起的腎損傷。
【附圖說明】
[0022] 圖1為大鼠連續(xù)肌肉注射慶大霉素后腎臟組織病理學(xué)改變（陰性對照組D2)。
[0023] 圖2為大鼠連續(xù)肌肉注射慶大霉素后腎臟組織病理學(xué)改變（80mg/kg組D4)。
[0024] 圖3為大鼠連續(xù)肌肉注射慶大霉素后腎臟組織病理學(xué)改變（80mg/kg組D8)。
【具體實施方式】
[0025] 本發(fā)明人以rno-miR-374為例，通過miRNA表達譜芯片數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn) rno-miR-374是外源性化合物引起的腎損傷的腎毒性生物標志物。檢測發(fā)現(xiàn)rno-miR-374 在外源性化合物引起的腎損傷的腎組織中高表達。應(yīng)用rno-miR-374為腎毒性生物標志 物，可以檢測外源性化合物引起的腎損傷。
[0026] 下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實 施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說明書選擇。
[0027] 實施例1尋找腎毒性生物標志物
[0028] 1. 1腎損傷模型的建立
[0029] I. I. 1實驗材料和儀器
[0030] 實驗試劑及儀器
[0031] 陽性藥：硫酸慶大霉素注射液（批號：20110406,購自湖北制藥有限公司，規(guī)格： 2mL :8萬單位；80mg即為8萬單位）；
[0032] 溶媒對照品：0. 9 %氯化鈉注射液（生理鹽水）（批號11010463 :購自山東長富結(jié) 晶藥業(yè)有限公司）
[0033] CRE(Rl)(肌酐）測定試劑盒由日本和光純藥工業(yè)株式會社（Wako)生產(chǎn)，BUN(尿 素氮）檢測試劑盒由德國羅氏診斷有限公司生產(chǎn)。
[0034] HITACHI 7060型全自動生化分析儀購于日本日立產(chǎn)業(yè)株式會社。
[0035] 實驗動物
[0036] SPF級SD大鼠200只，雌雄各半，首次給藥時體重在170~230之間，周齡在6~8 周之間。動物購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號為SCXK (滬）2008-0016。 動物采用苦味酸和伊紅進行標識，5只/籠，每籠動物均有籠牌。動物飼養(yǎng)于國家上海新藥 安全評價研究中心的SPF級動物房，動物房溫度控制在22~26攝氏度，濕度控制在40~ 70%之間，每分鐘通氣次數(shù)多15次，12小時/12小時的明暗光照周期，動物自由攝食，飼料 為由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供的鈷60輻照滅菌SPF大小鼠繁殖顆粒飼料，動物通過