一種抗噻蟲啉單克隆抗體及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗噻蟲啉單克隆抗體，尤其是一種可特異性識別噻蟲啉的單克隆 抗體，及該單克隆抗體的用途，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 噻蟲啉（Thiacloprid)，化學名（3-((6-氯-3-吡啶基）甲基）-1，3-噻唑啉-2-亞 基）氰胺，是一種新型氯代煙堿類殺蟲劑，由拜耳農化公司開發(fā)，對刺吸式和咀嚼式口器害 蟲有特效。作用機理與其它傳統(tǒng)殺蟲劑有所不同，通過與煙堿乙酰膽堿受體結合，干擾昆 蟲神經系統(tǒng)正常傳導，引起神經通道的阻塞，造成乙酰膽堿的大量積累，從而使昆蟲異常興 奮，全身痙攣、麻痹而死。具有較強的觸殺、胃毒和內吸作用，噻蟲啉與常規(guī)殺蟲劑沒有交互 抗性，因而可用于抗性治理，廣泛應用于那些對有機磷類、氨基甲酸酯類、除蟲菊酯類已產 生抗性的農林業(yè)害蟲的防治。然而大量研宄證實新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂和其他授粉昆蟲具 有較高毒性以及對生態(tài)系統(tǒng)有污染。2013年，歐盟委員會決定在一些開花作物上3種新煙 堿類殺蟲劑被禁用兩年。因此，監(jiān)測環(huán)境和農業(yè)的樣品中噻蟲啉的農藥殘留有非常重要的 意義。
[0003] 目前對噻蟲啉的殘留檢測，主要采用儀器分析方法，如液相色譜分析法。雖然儀器 分析方法靈敏度高、準確性強，但檢測儀器昂貴、樣品前處理較繁瑣、檢測費時費力、難以滿 足大量樣品快速簡便檢測的需要。
[0004] 免疫檢測方法具有快速、廉價、簡便、靈敏、特異的優(yōu)點，在大量樣品快速篩選和現 場監(jiān)測中顯示出獨特優(yōu)勢。ELISA是一種將酶催化反應和免疫反應相結合的免疫標記測定 技術，有酶催化反應的高靈敏度和抗原抗體反應的高特異性，在靈敏度方面有很大的優(yōu)勢。 ELISA作為一種快速靈敏的檢測方法，在許多小分子免疫分析中已得到較成熟的應用。通過 制備針對噻蟲啉的特異性抗體，建立噻蟲啉免疫學檢測方法。該發(fā)明方法的完成，將解決噻 蟲啉抗體制備關鍵技術，建立噻蟲啉的ELISA快速檢測技術。該發(fā)明不僅為食品安全檢測， 而且為我國農產品等的出入境檢測提供有效的技術手段和檢測方法。對我國農產品的可持 續(xù)發(fā)展和食品安全問題具有重要的現實意義和重要的社會、經濟價值。目前國內外尚未見 有關噻蟲啉的單克隆抗體的報道。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現有技術中存在的不足，提供一種特異性識別噻蟲啉的單克 隆抗體及其對環(huán)境或農產品中的噻蟲啉進行免疫檢測的用途。
[0006] 技術方案
[0007] (1)將式（I)所示的免疫半抗原偶聯BSA制備得到免疫原；
[0008]
[0009] ⑵用免疫原免疫BALB/c小鼠，免疫劑量為100 μ L免疫原/只，共免疫五次；首 次免疫由等體積的免疫原和弗氏完全佐劑乳化，腹腔注射，之后用等體積免疫抗原和弗氏 不完全佐劑乳化；從第三次免疫開始，每次免疫后尾靜脈采血，測定效價；
[0010] (3)待效價穩(wěn)定后，將骨髓瘤細胞SP2/0與上述效價最好的小鼠脾臟細胞進行細 胞融合，脾臟細胞與骨髓瘤細胞SP2/0的比例為10 : 1，制備得到雜交瘤細胞；
[0011] (4)通過系列篩選和亞克隆得到能穩(wěn)定分泌抗噻蟲啉單克隆抗體的雜交瘤細胞 株；再將該雜交瘤細胞株注射小鼠腹內制得腹水；
[0012] (5)采用辛酸-硫酸銨法純化小鼠腹水，得到所述的單克隆抗體。
[0013] 所述的單克隆抗體在制備用于檢測噻蟲啉的檢測工具中的應用。所述檢測工具為 試劑盒、芯片或試紙。
[0014] 本發(fā)明具有以下有益效果：（1)新穎：抗噻蟲啉單克隆抗體為國內外首次報道； (2)實用：利用本發(fā)明提供的抗噻蟲啉單克隆抗體實現的ic-ELISA具有操作簡單快速（只 需要2-3小時）、分析成本低、分析容量大、安全可靠、容易普及推廣，特別適用于大批量樣 品檢測和現場監(jiān)測，可以與傳統(tǒng)儀器分析方法互為補充；（3)特異性強：產生的抗體特異性 識別噻蟲啉，與其他煙堿類殺蟲劑沒有交叉反應；(4)準確度高：利用本發(fā)明提供的抗噻 蟲啉單克隆抗體實現的ELISA在農產品中的添加回收率為80. 3-116. 3%，變異系數低于 9.8%，符合殘留分析標準；(5)靈敏度高：利用本發(fā)明提供的抗噻蟲啉單克隆抗體實現的 ic-ELISA的抑制中濃度（IC5tl)為26. 3 μ g/L，檢測限（IC1(I，LOD)為1. 4 μ g/L，線性范圍為 2.5-200 μ g/L〇
【附圖說明】
[0015] 圖1為ELISA檢測噻蟲啉，OD值與噻蟲啉濃度的曲線；橫坐標為噻蟲啉的濃度，單 位為mg/L ;縱坐標為OD值。
【具體實施方式】
[0016] 下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0017] 實施例一：抗噻蟲啉單克隆抗體的制備
[0018] 1、小鼠免疫：
[0019] (1)將式（I)所示的免疫半抗原偶聯BSA(牛血清白蛋白）制備得到免疫原；
[0020]
[0021] (2)初次免疫：取6~8周齡健康BALB/c雌性小鼠，將制備得到的免疫原用PBS緩 沖液配置成lmg/mL后與等體積弗氏完全佐劑（FCA)混合，充分乳化后，每只小鼠經腹腔注 射200 μ L (即IOOyg免疫原）；
[0022] (3)加強免疫：初次免疫隔三周后，取免疫原（與首次免疫等劑量）和等體積的弗 氏不完全佐劑（FIA)混合，充分乳化后，每只小鼠經腹腔注射200 yL，以后每隔兩周，加強 免疫一次，共免疫4次；在進行細胞融合前3d對小鼠注射免疫原，注射劑量與首次免疫劑量 相同（不含任何佐劑），具體免疫方案見表1。
[0023] 表 1
[0024]
[0025] 2、抗血清的制備及融合小鼠的選擇：BALB/c小鼠從第三次免疫開始，每次免疫 7~10天后進行小鼠尾靜脈米血，37°C放置45min后于4°C冰箱放置30min，12000rpm離心 lOmin，得到的上清液即為抗血清。另取未經免疫的BALB/c小鼠得到陰性血清作為對照。用 間接非競爭酶聯免疫吸附分析法測定抗血清的效價（血清的稀釋倍數即為效價），第五次 免疫后，選擇效價最好的小鼠進行細胞融合。
[0026] 3、細胞融合：待免疫抗血清效價穩(wěn)定后，將生長狀態(tài)良好的骨髓瘤細胞SP2/0與 上述抗血清效價最好的小鼠脾臟細胞進行細胞融合制備雜交瘤細胞。通過系列篩選和亞克 隆，最后得到一株能穩(wěn)定分泌抗噻蟲啉單克隆抗體的雜交瘤細胞株，再將該雜交瘤細胞株 注射小鼠腹內制得腹水，得到腹水后，采用辛酸-硫酸銨法提純抗體。
[0027] 3. 1、細胞融合的具體過程如下：
[0028] (1)將約I X IO8個脾細胞與I X 10 7個骨髓瘤細胞SP2/0 (比例約為10 : 1)混合 于50mL離心管中，1000 rpm離心10min，棄上清液，再用DMEM基礎培養(yǎng)液洗絳一次；
[0029] (2)棄上清，用滴管吸凈殘留在離心管口的培養(yǎng)液，以免影響PEG(聚乙二醇）的濃 度；
[0030] (3)用手指輕輕彈離心管底部的沉淀細胞團，使沉淀松散均勻，隨后將離心管置于 37 °C水浴鍋中；
[0031] (4)用注射器準確吸取ImL 37°C預熱的50% PEG1500,在60s內將ImL PEG滴加 到離心管中，采用先慢后快的原則，邊加邊輕輕晃動，加完靜置Imin ;
[0032] (5)然后逐滴加入37°C預熱的DMEM基礎培養(yǎng)液，終止PEG作用，遵照先慢后快的 原則滴加至30mL，37°C靜置lOmin，800rpm離心8min，棄上清；
[0033] (6)用5mL HAT培養(yǎng)液將細胞輕輕懸浮，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的 細胞分散開；
[0034] (7)補加 HAT培養(yǎng)液到60mL，分裝于預先鋪有飼養(yǎng)細胞96孔細胞培養(yǎng)板中。每孔 加入100 μ L，醫(yī)用膠帶封邊標記，置于37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0035] 上述步驟得到的雜交瘤細胞的培養(yǎng)過程為：將融合后的細胞置于37°C，5% 0)2培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天檢查有無污染。在融合后5~7d首次換液，并根據情況每3~4d更換 培養(yǎng)液一次，換液時吸去1/2~2/3培養(yǎng)液，加入等量新鮮的培養(yǎng)液。所用的培養(yǎng)液應該根 據培養(yǎng)時間的不同而有所不同。在融合后第5~7d用HAT培養(yǎng)液，第7~14d用HT培養(yǎng) 液換出HAT培養(yǎng)液，三周后換用普通的細胞完全培養(yǎng)液。
[0036] 3. 2、篩選的具體過程如下：
[0037] (1)非競爭間接ELISA法初篩：用一定濃度的包被原（式⑴半抗原與卵清蛋白 偶聯制得的復合物）包被酶標板，3%脫脂奶粉封閉，取雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清，采用非競 爭間接ELISA法初步進行篩選（其中一抗為雜交瘤細胞上清，以免疫小鼠的血清為陽性對 照，以骨髓瘤細胞上清為陰性對照），選取呈陽性的細胞孔，細胞上清留存用于下一步檢測， 呈陰性的孔若重復一次后仍為陰性則可舍棄。
[0038] (2)間接競爭ELISA法篩選：對于上一步呈陽性的細胞孔則采用間接競爭ELISA 法進行進一步的確認。對噻蟲啉有明顯的競爭性抑制反應的孔即為產生抗噻蟲啉抗體的陽 性孔，應立即擴大培養(yǎng)并進行克隆化。對于無競爭性抑制反應的孔重復一次后仍為相同結 果的則可以淘汰。
[0039] 3. 3、陽性雜交瘤細胞的單克隆化：
[0040] (1)將待克隆化的雜交瘤細胞用移液器反復吹打均勻后取少許細胞懸浮至24孔 細胞培養(yǎng)板中，然后用培養(yǎng)液倍比稀釋5~6個孔；
[0041] (2)當細胞貼壁生長后，計數幾個孔的細胞；
[0042] (3)根據細胞計數結果，從密度適宜的孔中取出適量的細胞懸液（約含100個雜 交瘤細胞）至50mL離心管中，將培養(yǎng)液補至20mL。每孔200 μ 1接種于96孔細胞培養(yǎng)板 中，注意操作過程中要不斷混勻細胞懸液，以防止細胞分布不勻，理論上使每孔約含1個雜 交瘤細胞；
[0043] (4)將培養(yǎng)板置于37°C、飽和濕度、5% 0)2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一般7天左右即可 在倒置顯微鏡下觀察細胞克隆生長，注意記錄各孔細胞生長情況并記錄每孔細胞群落的數 量；
[0044] (5)對有細胞生長的孔要適時進行篩選，方法同