一種dna聚合酶錯配率的檢測方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及一種生物學檢測方法。更具體地，涉及一種酶學檢測方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]DNA聚合酶保真性檢測的經(jīng)典方法，是利用藍白斑顯色的方法，以藍白斑比例的形式反映DNA聚合酶擴增LacZα基因時的突變率，來衡量DNA聚合酶保真性。最傳統(tǒng)的方法是利用λ噬菌體攜帶擴增的LacZa基因，感染細胞后進行藍白斑顯色，例如KellyS.Lundberg等（High-fidelityamplificationusingathermostableDNApolymeraseisolatedfromPyrococcusfuriosus,1991，Gene)、JaniceCline等(PCRfidelityofPfuDNApolymeraseandotherthermostableDNApolymerases，1996,NucleicAcidsResearch)。該方法操作繁瑣，且有造成實驗室發(fā)生噬菌體污染的風險。也有學者開發(fā)出基于質(zhì)粒而非菌體的檢測方法，如StanislawK等（Plasmid-basedLacZaassayforDNApolymerasefidelity:applicationtoarchaealfamiIy-BDNApolymerase,2009,NucleicAcidsResearch)、BrianJ.Keith等(Aplasmid-basedIacZageneassayforDNApolymerasefidelitymeasurement,2013,AnalyticalBiochemistry)。但這些方法都要用到切刻內(nèi)切酶，制備含有單鏈區(qū)域的質(zhì)粒（即"GappedDNA"），實驗步驟較為繁瑣。另有學者擴增含有部分抗性基因片段的LacZa基因，然后利用載體與片段間抗性基因的功能性互補消除背景干擾，如WayneM.Barne等(ThefidefityofTaqpolymerasecatalyzingPCRisimprovedbyanN-terminaldeletion,1992,Gene)。但該方法擴增插入片段時，可能在抗性基因片段上出現(xiàn)突變，使得重組質(zhì)粒無法正常生長，導致克隆數(shù)減少，低估DNA聚合酶的錯配率。[0003]因此，需要提供一種操作簡便、準確的DNA聚合酶錯配率的檢測方法?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0004]本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種操作簡便、準確的DNA聚合酶錯配率的檢測方法。[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：[0006]一種DNA聚合酶錯配率的檢測方法，該方法包括如下步驟：[0007]1)制備含有突變型ccdB基因的質(zhì)粒，其中所述突變型ccdB基因是通過同義突變在野生型ccdB基因內(nèi)引入內(nèi)切酶的酶切位點，所述酶切位點在所述質(zhì)粒上是唯一的；[0008]2)內(nèi)切酶酶切，獲得線性化質(zhì)粒；[0009]3)擴增LacZa基因；[0010]4)將步驟3)獲得的LacZa基因連接到所述線性化質(zhì)粒，獲得連接產(chǎn)物；[0011]5)轉(zhuǎn)化所述連接產(chǎn)物至宿主菌，并在培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)；[0012]6)計算錯配率。[0013]本發(fā)明所述同義突變是指：通過突變獲得與野生型ccdB基因（見序列表SEQIDNo.2)DNA序列不同的突變型ccdB的DNA序列，但是突變型ccdB基因編碼的ccdB蛋白序列與野生型ccdB基因編碼的蛋白序列相同。同義突變的目的是為了在野生型ccdB基因的DNA序列內(nèi)引入內(nèi)切酶的酶切位點，即突變型ccdB基因具有內(nèi)切酶酶切位點。突變型ccdB基因通過同義突變獲得的酶切位點應(yīng)該在步驟1)所述的質(zhì)粒上是唯一的。優(yōu)選地，酶切位點位于突變型ccdB基因序列中間靠近5'端部分。優(yōu)選地，酶切位點為高效內(nèi)切酶識別的位點。[0014]本發(fā)明方法的原理是：ccdB基因是致死基因，其編碼毒素蛋白ccdB，含有ccdB基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入對ccdB蛋白無抗性的宿主菌體，將會導致宿主菌體的死亡。LacZa基因編碼β-半乳糖苷酶（簡稱β-gal)。β-gal比較穩(wěn)定，用X-Gal為底物進行染色時，呈藍色。LacZa基因插入突變型ccdB基因中，破壞了突變型ccdB基因的編碼序列，使其不能表達ccdB蛋白（如圖1和6所示）。[0015]DNA聚合酶擴增LacZa基因，并將其連接到含有突變型ccdB基因的質(zhì)粒中，然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入對ccdB蛋白無抗性的宿主菌體。當LacZa基因不能插入到突變型ccdB基因時，突變型ccdB基因表達ccdB蛋白，會造成宿主菌體的死亡；當LacZa基因插入到突變型ccdB基因時，突變型ccdB基因不表達ccdB蛋白，而表達β-gal，如果LacZa基因無突變，用X-Gal為底物進行染色時，呈藍色（藍斑），如果LacZa基因有突變，用X-Gal為底物進行染色時，呈白色（白斑），白斑數(shù)量與藍斑數(shù)量之和為總菌斑數(shù)量。白斑數(shù)量越多，則DNA聚合酶的錯配率越高，反之則越低。[0016]錯配率直接反映DNA聚合酶的保真性一錯配率越高，保真性越低。因此可以直接將錯配率作為保真性的評價指標。在PCR體系與條件相同的情況下，用不同PCR酶擴增LacZa基因（如圖5所示）并完成上述實驗，便可以根據(jù)數(shù)據(jù)比較不同DNA聚合酶的保真性。即DNA聚合酶的錯配率計算方法為：[0017](1-錯配率）x=藍斑數(shù)/總菌斑數(shù)[0018]將上式變形，最終可得：[0019][0020]其中，步驟（1)中含有突變型ccdB基因的質(zhì)粒構(gòu)建方法可采用常規(guī)的構(gòu)建方法，如對含有野生型ccdB基因的質(zhì)粒進行點突變，或通過PCR的方法突變野生型ccdB基因以獲得突變型ccdB基因，然后將突變型ccdB基因的PCR產(chǎn)物或其內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物連接到載體上，或者通過基因重組的方法連接到載體上，或者其他能夠?qū)崿F(xiàn)相同目的的實驗手段，其中所述載體不含有可表達ccdB蛋白的基因，或可表達與ccdB蛋白相同功能產(chǎn)物的基因。[0021]優(yōu)選地，步驟4)所述LacZα基因連接到所述線性化質(zhì)粒的方法為基因重組或通過DNA連接酶連接。通過基因重組，所述LacZa基因插入到突變型ccdB基因中。其中所述LacZα基因的DNA序列見序列表SEQIDNo.1。[0022]優(yōu)選地，步驟1)所述的質(zhì)粒不表達抗ccdB蛋白毒性的基因。[0023]優(yōu)選地，步驟2)中酶切時內(nèi)切酶識別的位點為步驟1)引入的酶切位點。[0024]優(yōu)選地，步驟5)所述宿主菌為對ccdB蛋白毒性無抗性的細菌，更優(yōu)選為對ccdB蛋白無抗性的大腸桿菌，如DH5α、ToplO或Transl-Tl。[0025]優(yōu)選地，步驟5)所述培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基。優(yōu)選地所述培養(yǎng)基含有X-gal和IPTG，其中X-gal和IPTG的用量為本領(lǐng)域的常規(guī)用量。宿主菌的培養(yǎng)時間根據(jù)菌體性質(zhì)決定。培養(yǎng)結(jié)束后分別計算其中藍斑和白斑的數(shù)量，藍斑和白斑的數(shù)量之和為總菌斑數(shù)量。所述錯配率的計算方法為：[0026](1-錯配率）x=藍斑數(shù)/總菌斑數(shù)[0027]將上式變形，最終可得：[0028][0029]本發(fā)明的有益效果如下：[0030]與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明提供的一種將LacZa基因插入突變型ccdB基因的DNA聚合酶錯配率檢測方法，具有操作簡單、快速且成本低的特點。【附圖說明】[0031]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。[0032]圖1示出制備方法原理圖[0033]圖2不出pEASY-BluntZeroCloningVector質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。[0034]圖3不出缺失LacZa基因后的pEASY-BluntZeroCloningVector(記為PlasmidI)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。[0035]圖4示出突變后的Plasmid1質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。[0036][0037]圖5示出LacZα基因的PCR擴增產(chǎn)物。[0038]圖6示出LacZa基因在突變產(chǎn)生的酶切位點處插入ccdB基因后，生成的重組質(zhì)粒?！揪唧w實施方式】[0039]為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實施例和附圖對本發(fā)明做進一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標記進行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護范圍。[0040]實施例中所用的材料及來源分別為：pEASY_BluntZeroCloningVector、EasyTaqDNAPolymerase、TransTaqHiFiDNAPolymerase、TransStartFastPfuDNAPolymerase、FastMutagenesisSystem、EasyPureQuickGelExtractionKit、T4DNALigase、pEASY-UniSeamlessCloningandAssemblyKit、Transl_TlPhageResistantChemicallyCompetentCell(北京全式金生物技術(shù)有限公司），SmaI、EcoRV限制性內(nèi)切酶（NEB公司），OneShot?ccdBSurvival?2TlRCompetentCells(感受態(tài)細胞）、引物合成、測序（Lifetechnologies公司）。[0041]實施例1:DNA聚合酶錯配率的檢測[0042]1.制備含有野生型ccdB基因的質(zhì)粒[0043]用反向PCR然后自連的方法，缺失pEASY-BluntZeroCloningVector載體中的LacZa基因，僅保留載體上的野生型ccdB基因。[0044]反向PCR引物為5'磷酸化引物，序列如下：[0045]PlasmidIPrimerF:5'-CAGTTTAAGGTTTACACC-3'（見序列表SEQIDNo.3)[0046]PlasmidIPrimerR:5'-CATAGCTGTTTCCTGTGTG-3'（見序列表SEQIDNo.4)[0047]pEASY-BluntZeroCloningVector為模板（Template)，其含有LacZα與ccdB的融合基因，質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖2所示，PCR反應(yīng)體系如下：[0048]pEASY-BluntZeroCloningVectorIμLPlasmidIPrimerF(10μΜ)IμLPlasmidIPrimerR(10μΜ)IμL2><TransStartFastPfuPCRSuperMix(-dye)25μLddH20加至50μ1[0049]PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5分鐘；94°C20秒，55°C20秒，72°C1分鐘，共25個循環(huán)；72°C10分鐘；PCR結(jié)束后，取5μ1于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。[0050]然后用EasyPureQuickGelExtractionKit回收純化PCR產(chǎn)物，用T4DNALigase自連，轉(zhuǎn)化OneShot?ccdBSurvival?2TlRCompetentCells(感受態(tài)細胞），挑單克隆，測序驗證，對測序正確的菌落提質(zhì)粒，質(zhì)粒記為Plasmid1。[0051]2.含有突變型ccdB基因的質(zhì)粒的構(gòu)建：[0052]在野生型ccdB基因中突變產(chǎn)生SmaI酶切位點。[0053]野生型ccdB基因突變引物如下：[0054]MutationForwardPrimer:5'-GATATTATTGACACCCCGGGGCGACG-3'（見序列表SEQIDNo.5)[0055]MutationReversePrimer:5'-GGTGTCAATAATATCACTCTGTACA-3'（見序列表SEQIDNo.6)[0056]Plasmid1為模板（Template)，其含有野生型ccdB基因，質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖3所示，突變反應(yīng)體系如下：[0057]Plasmid110ngMutationForwardPrimer(10μΜ)IμLMutationReversePrimer(10μΜ)IμL2><TransStartFastPfuPCRSuperMix(-dye)25μΙddH2O加申.50μL[0058]PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5分鐘；94°C20秒，55°C20秒，72°C1分鐘，共25個循環(huán)；72°C10分鐘；PCR結(jié)束后，取5μ1于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。[0059]然后用DMT酶（或DpnI酶）消化PCR產(chǎn)物，取2μ1酶消化產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化OneShot?cc當前第1頁1 2