一株檢測(cè)銅的大腸埃希氏菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)重金屬銅大腸埃希氏菌工程菌株的構(gòu)建方法及其檢測(cè)水體 中重金屬銅的具體實(shí)施方案，屬于環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 銅（Copper，Cu)作為最常見的重金屬元素之一，是生物體新陳代謝必須的微量元 素。研宄發(fā)現(xiàn)過量的銅或銅離子對(duì)于所有的生命體都是有毒的，其中人體內(nèi)銅的過量沉積 參與了很多疾病的發(fā)生和發(fā)展，銅可蓄積于人體重要器官，如肝、腎、腦等，特別是某些患有 染色體隱性疾病的人。由于膽汁排泄銅的功能紊亂，銅蓄積于肝，引起肝臟損壞，出現(xiàn)慢性、 活動(dòng)性肝炎癥狀，如印度兒童肝硬化、Tyrolean嬰兒慢性間質(zhì)性肝炎和Wilson病；當(dāng)銅蓄 積于腦部，可引起神經(jīng)組織病變，出現(xiàn)小腦運(yùn)動(dòng)失常甚至出現(xiàn)帕金森綜合癥或阿爾茨海默 ?。划?dāng)銅沉積在近側(cè)腎小管時(shí)，則可引起氨基酸尿、糖尿、蛋白尿、磷酸鹽尿和尿酸尿；當(dāng)銅 沉積在眼角膜周圍時(shí)，在后彈力層上出現(xiàn)鐵銹樣環(huán)，影響眼睛的正常功能；銅過量對(duì)男性生 殖也存在不利影響。最新研宄表明，銅對(duì)原核細(xì)菌作用靶點(diǎn)主要是一些具有重要功能的鐵 硫蛋白的鐵硫中心。
[0003] 隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，很多含銅污染物被排放入江河湖泊中，污染土壤、水源甚至是 日常食用的糧食蔬菜，比如在金屬礦山開采、冶金、金屬加工、機(jī)械制造、有機(jī)合成及其它工 業(yè)所產(chǎn)生的廢水中大多含有銅，其中以金屬加工、電鍍工廠所排廢水中含銅最高，每升廢水 含銅幾十至幾百毫克。水體中含銅量達(dá)〇.〇lmg/L時(shí)對(duì)水體自凈有明顯的抑制作用；超過 3mg/L，會(huì)產(chǎn)生異味；超過15mg/L，就無法飲用。若用含銅廢水灌溉農(nóng)田，銅在土壤和農(nóng)作物 中積累，會(huì)對(duì)農(nóng)作物，特別是對(duì)水稻和大麥生長不利，并會(huì)污染糧食。還有銅鹽的廣泛使用， 如常見的波爾多液、硫酸銅、氧化銅、王銅、三氯化銅等作為農(nóng)藥會(huì)污染蔬菜。人們過多的暴 露于高銅的環(huán)境以及高銅飲食都是很強(qiáng)的致病因素，給人們的生活和健康造成了巨大的威 脅。比如眾所周知的紫金山礦業(yè)銅污染事件，江西銅業(yè)重金屬污染事件就是由銅污染引起 的。因此，對(duì)重金屬銅污染的防治已不容忽視，從而對(duì)環(huán)境中銅的檢測(cè)尤為重要。
[0004] 生物有效性（bioavailability)的學(xué)術(shù)定義最初來源于藥物的使用，通常與人體 或組織對(duì)藥物的吸收有關(guān)。生物有效性的定義同樣適用于環(huán)境污染物，其本質(zhì)在于研宄化 學(xué)物質(zhì)與生物體的一種潛在的相互作用關(guān)系，從而將生物體與周圍環(huán)境聯(lián)系起來。重金屬 生物有效性是指能夠被生物體吸收并引起不良反應(yīng)或影響生物體生存的那一部分形式的 重金屬，是衡量重金屬毒力大小的重要指標(biāo)。重金屬生物有效性與相互聯(lián)系的化學(xué)、物理和 生物因素有關(guān)，比如pH、吸附重金屬物質(zhì)的濃度、重金屬離子的化合價(jià)，因此難以明確定義。 微生物對(duì)保持土壤肥力和水體自凈能力是必不可少的，因此研宄重金屬的生物有效性對(duì)環(huán) 境微生物也是非常重要的。由于不同生物體對(duì)重金屬的代謝與抗性機(jī)制存在差異，因此由 一種生物體測(cè)定的生物有效性不一定適用于其他生物體。
[0005] 研宄表明重金屬在土壤和水體沉積物中是以多種形態(tài)存在的，主要包括弱酸溶解 態(tài)（可交換態(tài)及碳酸鹽結(jié)合態(tài)）、可還原態(tài)（Fe或Mn氧化物結(jié)合態(tài)）、可氧化態(tài)（有機(jī)物及 硫化物結(jié)合態(tài)）和殘?jiān)鼞B(tài)（存在礦物晶格中）。其中前3種形態(tài)統(tǒng)稱為可提取態(tài)、不穩(wěn)定， 生物有效性也各自不同。殘?jiān)鼞B(tài)重金屬幾乎不能被生物體利用。因此僅憑重金屬總量難以 有效評(píng)價(jià)環(huán)境中重金屬的生物有效性和毒性效應(yīng)。目前測(cè)定生物有效性的化學(xué)方法很多， 其中由歐共體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)局提出的三級(jí)四步提取法（BCR法）已被科研工作者普遍接受。而 在評(píng)價(jià)生物有效性的生物學(xué)方法中以微生物報(bào)告菌株/全細(xì)胞微生物傳感器最受青睞。因 為微生物相對(duì)高等生物具有傳代快、反應(yīng)快、易培養(yǎng)、易保存和廉價(jià)等優(yōu)勢(shì)。最重要的是經(jīng) 過基因改造的報(bào)告菌株能以劑量依賴方式對(duì)特定化學(xué)物一類化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)和定量，從 而提供一個(gè)真實(shí)的、可測(cè)量的生物有效度。目前該方法已被廣泛用于評(píng)價(jià)環(huán)境中無機(jī)汞、有 機(jī)汞、鎘、銅、鋅、鉛、鉻、鈷和鎳等多種重金屬生物有效性。
[0006] 研宄不同形式重金屬生物毒性效應(yīng)的最終目的是評(píng)價(jià)其對(duì)人體健康的危害風(fēng)險(xiǎn)。 因此，學(xué)術(shù)界在生物有效性的基礎(chǔ)上提出了生物可給性這一概念。重金屬生物可給性指人 類生活環(huán)境中的重金屬直接進(jìn)入人體的消化系統(tǒng)并可被人體胃腸道溶解出的部分。從這一 概念中我們可以看出進(jìn)入人體消化系統(tǒng)中重金屬不可能被人體100%吸收。并且研宄表明 同一樣品的重金屬生物可給性通常大于其生物有效性。因此，重金屬總量同樣不能客觀反 映其對(duì)人體健康的危害風(fēng)險(xiǎn)。
[0007] 目前檢測(cè)水體重金屬污染物的主要方法：原子吸收分光光度法（AAS)、電感耦合 等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS)等，均需要專用儀器設(shè)備、專業(yè)操作人員，不易在基層和現(xiàn)場應(yīng) 用；而化學(xué)顯色法、電化學(xué)法等，靈敏度、選擇性不高，不易準(zhǔn)確定量，特別是針對(duì)水體中 生物有效性重金屬的檢測(cè)，可選的特異、敏感、快速和便攜的檢測(cè)方法更少，難以對(duì)水體中 重金屬生物毒性效應(yīng)進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)。利用模式生物大腸埃希氏菌（Escherichia coli， E. coli)對(duì)特定化學(xué)物質(zhì)分子反應(yīng)的生物檢測(cè)技術(shù)克服了如上不足，因此有必要發(fā)展一種 特異、敏感、快速、廉價(jià)、穩(wěn)定及定量的生物檢測(cè)技術(shù)及其產(chǎn)品來評(píng)價(jià)環(huán)境中銅的生物毒性 大小。
[0008] 微生物報(bào)告菌株/全細(xì)胞微生物傳感器檢測(cè)技術(shù)的基本原理即是利用模式生物 對(duì)特定化學(xué)物質(zhì)的分子反應(yīng)機(jī)理。對(duì)于生物檢測(cè)技術(shù)而言需要三種必需的元件：針對(duì)特定 或具有相似性質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)的感應(yīng)器（比如特異識(shí)別重金屬的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白）；由感應(yīng)器 控制的啟動(dòng)子；受此啟動(dòng)子控制的報(bào)告基因。在設(shè)計(jì)生物檢測(cè)技術(shù)時(shí)，由于細(xì)菌具有在環(huán)境 中大量存在、生長快速、低成本及易改造等優(yōu)點(diǎn)而受到研宄人員普遍親睞。在過去的研宄中 利用微生物報(bào)告菌株/全細(xì)胞微生物傳感器來檢測(cè)環(huán)境中的特定污染物已經(jīng)引起了極大 的關(guān)注，至今已經(jīng)研發(fā)了一系列針對(duì)特定有機(jī)物和無機(jī)化合物的微生物報(bào)告菌株/全細(xì)胞 微生物傳感器及其產(chǎn)品，如：檢測(cè)重金屬、甲苯及其衍生物等生物傳感器細(xì)胞。
[0009] 經(jīng)檢索目前國內(nèi)外文獻(xiàn)中關(guān)于檢測(cè)重金屬銅的微生物報(bào)告菌株/全細(xì)胞微生物 傳感器的報(bào)告基因絕大部分是連接于質(zhì)粒載體中，因此會(huì)存在報(bào)告基因的熒光本底值高和 細(xì)菌傳代后子代細(xì)胞中質(zhì)?？截悢?shù)不均一（數(shù)量過高或丟失），從而導(dǎo)致熒光檢測(cè)信號(hào)穩(wěn) 定性和獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)性不佳等缺陷。此外，當(dāng)野生型菌株細(xì)胞內(nèi)重金屬含量偏高時(shí)，細(xì)菌會(huì) 啟動(dòng)表達(dá)"外排泵"基因以泵出重金屬的自我保護(hù)機(jī)制，導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度低和線性范圍濃度 偏高，最低檢測(cè)限值高于國家標(biāo)準(zhǔn)中針對(duì)水體中銅標(biāo)準(zhǔn)限值。由于上述原因，重金屬微生物 檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用受到限制而發(fā)展緩慢。而本發(fā)明綜合運(yùn)用基因敲除與基因敲入技術(shù)構(gòu)建了 一種特異、靈敏、快速、廉價(jià)、穩(wěn)定及定量檢測(cè)水體中銅濃度及其生物有效性的大腸埃希氏 菌工程菌株及其產(chǎn)品。經(jīng)檢索本發(fā)明構(gòu)建的大腸埃希氏菌基因工程菌株在國內(nèi)外均無文獻(xiàn) 報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的：一、采用基因工程技術(shù)改造野生型大腸埃希氏菌，構(gòu)建一株熒光本 底值低、穩(wěn)定及定量檢測(cè)水體中重金屬銅的大腸埃希氏菌菌株；二、建立微生物法檢測(cè)水體 中重金屬銅的應(yīng)用方案。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0011] 之一：檢測(cè)重金屬銅大腸埃希氏菌工程菌株的構(gòu)建
[0012] 本發(fā)明的大腸埃希氏菌（Escherichia coli)WMC_007,已于2014年10月08日在 中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其簡稱為CGMCC(地址：北京市朝陽區(qū)北 辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研宄所，郵編100101)保藏，分類命名為大腸埃希氏 菌（Escherichia coli)，保藏編號(hào)為 CGMCC No. 9750。
[0013] 1.本發(fā)明所述大腸埃希氏菌菌株的構(gòu)建方法如下：
[0014] 1. 1采用Red重組系統(tǒng)，敲除野生型大腸埃希氏菌E. coli MC4100基因組中三個(gè) 銅離子"外排泵"基因：copA，序列如SEQ ID NO. 1所示，cueO,序列如SEQ ID NO. 2所示，和 cusA，序列如 SEQ ID NO 3 所不，構(gòu)建 E.coli copA-cueCTcusA-突變菌株；
[0015] 1.2采用基因敲入技術(shù)將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告基因gfpmut2,序列如SEQ ID NO. 5所示，置換到E. coli copAYueCTcusA^菌株基因組中copA基因編碼框位置。具體方 法為：通過交叉PCR技術(shù)，形成含有報(bào)告基因gfpmut2和copA基因兩側(cè)同源臂的DNA融合 片段，該DNA融合片段大小約為1. 7kb，然后酶切連接到pKOV條件復(fù)制質(zhì)粒，構(gòu)建copAp:: gfpmut2_pK0V打祀載體，并將該打祀載體轉(zhuǎn)化到E. coli copA^cueCTcusA^菌株中，通過溫度 及蔗糖的選擇，挑選成功發(fā)生兩次同源重組的菌株，并進(jìn)一步通過菌落PCR及測(cè)序鑒定篩 選目的菌株。
[0016] 2.本發(fā)明所述大腸埃希氏菌菌株可以定量檢測(cè)水體中重金屬銅的原理如下：
[0017] 本發(fā)明所述大腸埃希氏菌菌株定量檢測(cè)水體中銅離子是采用copAp啟動(dòng)子，序列 如SEQ ID NO. 4所示，直接啟動(dòng)gfpmut2基因表達(dá)模式。在此構(gòu)建中，當(dāng)未添加外源性銅離 子時(shí)，E. coli WMC-007基因組中cueR基因編碼產(chǎn)生的CueR蛋白結(jié)合于copAp啟動(dòng)子序列 區(qū)，阻止GFPmut2表達(dá)；當(dāng)外源性銅離子進(jìn)入大腸埃希氏菌胞內(nèi)后，Cu+與CueR蛋白結(jié)合， 使CueR蛋白從啟動(dòng)子上脫落，激活E. coli WMC-007基因組中copAp: :gfpmut2融合基因 的表達(dá)，從而產(chǎn)生GFPmut2蛋白，并且產(chǎn)生的GFPmut2蛋白的量或其熒光強(qiáng)度與銅離子濃度 呈劑量依賴關(guān)系，所以通過測(cè)定熒光強(qiáng)度可以達(dá)到定量檢測(cè)銅離子濃度的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0018] 之二：提供一種微生物法檢測(cè)水體中重金屬銅的應(yīng)用實(shí)施方案
[0019] 本發(fā)明所述大腸埃希氏菌菌株檢測(cè)水體中重金屬銅的應(yīng)用實(shí)施方案如下：
[0020] 1.環(huán)境水體樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：
[0021] 取10-50ml待測(cè)環(huán)境水體樣品，12, 000g離心5min，取上清，用0. 5M稀鹽酸或氫氧 化鈉溶液調(diào)節(jié)上清樣品的pH值為6-8,再用0. 2 y m的無菌針頭濾器過濾，過濾后樣品用于 后續(xù)的測(cè)定。
[0022] 2.標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的準(zhǔn)備：
[0023] 把銅單元素標(biāo)準(zhǔn)品用無菌MilliQ級(jí)的純水稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛忍荻?。具體的濃度 需根據(jù)樣品中Cu的濃度而定。初次檢測(cè)可以檢測(cè)0. 025、0. 05、0. 5、1、2. 5、5mg/L這幾個(gè)標(biāo) 準(zhǔn)品濃度，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中根據(jù)樣品中Cu的濃度對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)。
[0024] 3.LB培養(yǎng)基的配