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檢測甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的引物與應(yīng)用

文檔序號:8468731閱讀:1768來源:國知局
檢測甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的引物與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子育種領(lǐng)域,確切地說,涉及一種檢測甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草 劑基因BnALS3R的引物與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來,隨著我國工業(yè)化和城市化進(jìn)程加快,農(nóng)村勞動力大量向城鎮(zhèn)轉(zhuǎn)移,輕簡 化、機械化已成為油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要方向。有效治理田間雜草是實現(xiàn)油菜輕簡化、機械 化的重要技術(shù)環(huán)節(jié)?;瘜W(xué)除草是當(dāng)前農(nóng)田控制雜草的主要手段。然而,當(dāng)前油菜生產(chǎn)上應(yīng) 用的除草劑僅能有效防治單子葉雜草,對大多數(shù)雙子葉類的闊葉雜草缺少安全、高效的除 草劑進(jìn)行防除,油菜生產(chǎn)化學(xué)除草面積非常有限。而磺酰脲類除草劑能高效防除雙子葉類 闊葉雜草,具有低用量、對環(huán)境友好等特點,在我國水稻、小麥、玉米等單子葉作物中廣泛應(yīng) 用。遺憾的是,油菜為雙子葉作物,對磺酰脲類除草劑表現(xiàn)敏感,生產(chǎn)上還未開發(fā)出對油菜 安全、高效的磺酰脲類除草劑,創(chuàng)制對磺酰脲類除草劑具有選擇抗性的油菜新種質(zhì),拓寬現(xiàn) 有磺酰脲類除草劑的應(yīng)用范圍,是解決油菜田雜草防除的一個經(jīng)濟有效途徑。
[0003] 磺酰脲類除草劑是一類高效、低毒的除草劑,屬于乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase,ALS ;EC4. 1. 3. 18)抑制劑類除草劑,其作用靶標(biāo)為植物體內(nèi)的ALS。 ALS 也叫乙酰羥基酸合酶(acetohydroxyacid synthase,AHAS ;EC2. 2. 1. 6),是 植物和微生物3種支鏈氨基酸生物合成過程中的關(guān)鍵酶(McCourt JA, Duggleby RG. AminoAcids,2006, 31:173 - 210)。該酶負(fù)責(zé)催化兩個平行反應(yīng),催化兩分子丙酮酸縮 合形成2-乙酰乳酸放出C02,最終生成纈氨酸和亮氨酸,催化一分子丙酮酸和一分子2-氧 丁酸縮合形成乙酰羥基丁酸,最終生成異亮氨酸(Ronald G D,et al.,PlantPhysiolBi och,2008, 46:309-324)。如果此酶的活力受到抑制或者喪失,會導(dǎo)致植物纈氨酸、亮氨酸 和異亮氨酸合成受阻,影響蛋白質(zhì)合成,最終導(dǎo)致植物生長受阻、直至死亡?;酋k孱惓?草劑作用機理是除草劑通過與ALS形成復(fù)合物阻斷底物進(jìn)入酶活性位點通路,抑制ALS 活性,導(dǎo)致支鏈氨基酸合成受阻,使植物組織失綠、黃化,最后逐漸死亡(McCourt JA,et al. , PNAS, 2006, 103:569-573) 〇
[0004] 隨著研宄的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)某些特定氨基酸殘基突變能引起ALS對磺酰脲 類除草劑產(chǎn)生抗性,其中常見易發(fā)生變異的氨基酸殘基是Pr〇197、Ala205和Trp574(參 照擬南芥 ALS 位置;Walter K L,et al.,Pest ManagSci, 2014, 70 (12): 1831-1839; Ghio C,et al.,TheorAppl Genet, 2013, 126(12) :2957-2968;胡茂龍等,中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012,45(20):4326-4334)。例如,在中國甜菜的sur和萵苣的1個突變體中197位脯氨酸 被組氨酸或絲氨酸所取代;向日葵的Two突變體中205位丙氨酸被纈氨酸所取代;玉米的 XA17 中 574 位色氨酸被亮氨酸所取代(Tan S, et al.,PestManagSci, 2005, 61:246-257)。 通過進(jìn)一步研宄發(fā)現(xiàn),當(dāng)擬南芥ALS與磺酰脲類除草劑相互作用時,除草劑結(jié)合在擬南 芥ALS催化位點的活性空腔里,當(dāng)活性空腔內(nèi)的氨基酸殘基發(fā)生突變時,會引起除草 劑與ALS結(jié)合方式的變化,導(dǎo)致植物產(chǎn)生對磺酰脲類除草劑的抗性(Lee H,et al.,PN AS, 2011, 108(21) :8909-8913) 〇
[0005] 2013年,利用EMS誘變和定向選育技術(shù),我們獲得了甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草 劑突變體M342(公知公用,浦惠明等,專利申請?zhí)?01310054645. 9)。在苯磺隆除草劑雜草 防治的推薦使用濃度下,抗性突變體M342噴藥后無任何藥害癥狀,仍能正常生長。進(jìn)一步 通過分子生物學(xué)技術(shù)克隆獲得了抗性突變體M342抗性基因BnALS3R(胡茂龍等,一種甘藍(lán) 型油菜抗磺酰脲類除草劑基因及其應(yīng)用;中國專利ZL201310111739.5)??剐曰虻陌l(fā)現(xiàn) 為我國抗磺酰脲類除草劑油菜品種的培育提供了自主知識產(chǎn)權(quán)的種質(zhì)資源。利用該抗性種 質(zhì)資源,常規(guī)育種方法是將含BnALS3R基因的M342與生產(chǎn)上推廣的主栽品種進(jìn)行雜交和回 交,然后在每個分離后代中噴施除草劑進(jìn)行鑒定,最終選擇含抗磺酰脲基因BnALS3R的抗 性單株。在每個分離后代除草劑鑒定過程中,如果除草劑劑量使用不當(dāng)或噴施不均勻極易 導(dǎo)致誤選。另外,有時在抗除草劑基因研宄過程中需要保存不抗的材料,用作比較研宄。為 此,若能根據(jù)該基因BnALS3R的突變位點特性,開發(fā)出檢測抗性基因的功能性標(biāo)記,從而進(jìn) 行標(biāo)記輔助選擇,區(qū)分出育種材料中抗性基因的不同基因型,則可指導(dǎo)田間選育,加快育種 進(jìn)程,為標(biāo)記輔助選擇進(jìn)行油菜抗除草劑新品種選育提供選擇方法和技術(shù)支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 技術(shù)問題
[0007] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種檢測甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除 草劑基因BnALS3R的分子標(biāo)記引物。
[0008] 本發(fā)明的另一個目的在于提供所述檢測甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因 BnALS3R分子標(biāo)記引物的應(yīng)用方法。
[0009] 技術(shù)方案
[0010] 本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0011] 一種檢測甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的分子標(biāo)記引物,其核甘酸 序列為:
[0012] SEQ ID NO. 1 :5'-GTTTGCGAGCAGGGCTAAGA-3'
[0013] SEQ ID NO. 2 :5'-GACATCCAACAGGTACGGTCCA-3'
[0014] 所述的分子標(biāo)記引物用于檢測甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的方 法,其特征在于,包括以下步驟:
[0015] 以待測甘藍(lán)型油菜總DNA為模板,用權(quán)利要求1所述引物的核甘酸序列SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2進(jìn)行PCR擴增;將PCR擴增的產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶BsrDI消化; 將消化的酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測:
[0016] 如果電泳檢測表明的酶切產(chǎn)物含有分子量為766bp -種條帶時,則為含抗磺酰脲 類除草劑基因BnALS3R的純合型抗性油菜;
[0017] 如果電泳檢測表明的酶切產(chǎn)物含有分子量為766bp、570bp和196bp三種條帶時, 則為含抗性基因BnALS3R雜合型抗性油菜;
[0018] 如果電泳檢測表明的酶切產(chǎn)物含有分子量為570bp、196bp兩種條帶時,則為不含 抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的純合型敏感性油菜。
[0019] 所述的分子標(biāo)記引物在輔助選擇選育抗除草劑甘藍(lán)型油菜品種中的應(yīng)用。
[0020] 所述的應(yīng)用,其特征在于,用所述引物的核甘酸序列SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2 對以恢復(fù)系為母本、以含甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的品種為父本進(jìn)行 雜交的F1單株自交獲得的F2群體中的植株進(jìn)行抗性基因PCR擴增檢測,將含有分子量 為766bp條帶的可育單株套袋自交,自交后代即為獲得的含有抗磺酰脲類除草劑基因 BnALS3R純合型的含甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的F3種子;在含有分子量 為766bp條帶的可育單株套袋自交后代中選擇可育的單株套袋自交,自交后代即育出抗磺 酰脲類除草劑的MI CMS恢復(fù)系。
[0021] 所述的應(yīng)用,還可以以抗磺酰脲類除草劑油菜為父本,普通油菜為母本雜交獲得 F1,然后以普通油菜為輪回親本,在每次回交世代前,采用本發(fā)明的分子標(biāo)記BsrDI-ALS3R 進(jìn)行基因型檢測,將含分子量為766bp、570bp和196bp三種條帶的抗性基因雜合型單株與 輪回親本回交,通過多次回交,在最后一代自交的群體中用權(quán)利要求1所述引物的核甘酸 序列SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2對甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R進(jìn)行分子 標(biāo)記輔助基因型檢測,選擇含分子量為766bp條帶的抗性基因純合型單株即培育出抗除草 劑油菜。
[0022] 有益效果
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有下列優(yōu)點和效果:
[0024] 1、本發(fā)明找到一種檢測甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的CAPS分子 標(biāo)記方法,克服了甘藍(lán)型油菜基因組復(fù)雜、在四倍體油菜中應(yīng)用分子標(biāo)記難度很大的問題。
[0025] 本發(fā)明開展了大量的檢測甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的AS-PCR 分子標(biāo)記、ARMS-PCR分子標(biāo)記、CAPS分子標(biāo)記的開發(fā)研宄,摸索試驗中發(fā)現(xiàn)敏感性油菜的 乙酰乳酸合酶III基因正義鏈起始密碼子第一個核甘酸下游的+1662至+1667位點,該位 點的6個核甘酸序列為"GCAATG",能夠被限制性核酸內(nèi)切酶BsrDI酶識別并剪切,而抗磺酰 脲類除草劑基因BnALS3R在+1662至+1667的對應(yīng)序列為"GCAATT",不能被限制性核酸內(nèi) 切酶BsrD I酶識別并剪切,從而克服了甘藍(lán)型油菜為白菜型油菜(A基因組)和甘藍(lán)(C基 因組)天然雜交自然加倍而來的異源四倍體(2n = 38),基因組相對復(fù)雜,二倍體研發(fā)的分 子標(biāo)記在四倍體油菜的應(yīng)用難度很大的問題,找到一種檢測甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑 基因BnALS3R的CAPS分子標(biāo)記方法,
[0026] 2、本發(fā)明提供的分子標(biāo)記檢測方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、容易判斷。
[0027] 本發(fā)明的分子標(biāo)記位于敏感性油菜的乙酰乳酸合酶III基因正義鏈起始密碼子 第一個核甘酸下游的+1662至+1667位點,該位點的6個核甘酸序列為"GCAATG",能夠被限 制性核酸內(nèi)切酶BsrDI酶識別并剪切,而抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R在+1662至+1667 的對應(yīng)序列為"GCAATT",不能被限制性核酸內(nèi)切酶BsrD I酶識別并剪切。由此,可以開發(fā) 一個能夠檢測甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的CAPS分子標(biāo)記BsrDI-ALS3R。
[0028] 該分子標(biāo)記是一個共顯性標(biāo)記,操作者僅需要通過簡單的分子生物學(xué)實驗手段 (PCR擴增和酶切反應(yīng))就能對不同抗性基因型進(jìn)行鑒定,快速、準(zhǔn)確的區(qū)分出抗磺酰脲類 除草劑基因BnALS3R的純合型、雜合型和不抗除草劑的敏感型油菜植株。
[0029] 3、本發(fā)明提供的分子標(biāo)記檢測方法能有效用于抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R 引起的油菜對磺酰脲類除草劑抗性的標(biāo)記輔助選擇育種。
[0030] 常規(guī)育種方法是利用含BnALS3R基因的抗性油菜M342與生產(chǎn)上推廣的主栽品種 進(jìn)行雜交和回交,然后在每個分離后代中噴施除草劑進(jìn)行鑒定,最終選擇含抗磺酰脲類除 草劑BnALS3R的抗性單株。在每個分離后代除草劑鑒定過程中,如果除草劑劑量使用不當(dāng) 或噴施不均勻極易可能導(dǎo)致誤選或所需要的材料死亡。另外,有時在抗除草劑基因研宄過 程中需要保存不抗的材料,用作比較研宄。因此,利用與BnALS3R基因直接相關(guān)的PCR分子 標(biāo)記對植株DNA進(jìn)行檢測,可以在油菜任何時期鑒定出抗性基因純合基因型單株以及優(yōu)良 性狀的不抗單株,淘汰其它單株,這樣不僅可以節(jié)約田間育種成本,而且可以大大提高抗除 草劑油菜品種的選擇進(jìn)程。
[0031] 4、本發(fā)
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