低溫下β-葡萄糖苷酶活性增強(qiáng)的多肽的制作方法
【專利說明】低溫下葡萄糖苷酶活性增強(qiáng)的多肽
[0001] 由于大量原料的可利用性和對乙醇作為燃料的興趣，用纖維素生產(chǎn)乙醇的可能性 已經(jīng)得到很大的關(guān)注。用于這類工藝的基于纖維素的天然原料被稱為"生物質(zhì)"。已經(jīng)將許 多類型的生物質(zhì)，例如木材、農(nóng)業(yè)廢棄物、草本作物和城市固體垃圾，考慮作為生產(chǎn)生物燃 料的潛在原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。
[0002] 纖維素是由e -1，4鍵連接的葡萄糖分子組成的聚合物，其對降解或解聚合非常 有耐性。一旦纖維素被轉(zhuǎn)化為葡萄糖，后者容易用酵母發(fā)酵成生物燃料，如乙醇。
[0003]研宄的用于將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的最古老的方法是基于酸水解。該工藝可以在 濃酸或稀酸的存在下進(jìn)行。然而，幾個(gè)缺點(diǎn)（例如當(dāng)使用濃酸時(shí)酸回收很少，以及使用稀酸 的情況下葡萄糖的產(chǎn)量低）對于酸水解工藝的經(jīng)濟(jì)性是不利的。
[0004] 為了克服酸水解工藝的缺點(diǎn)，最近的纖維素轉(zhuǎn)化工藝已經(jīng)更多地與酶促水解（使 用纖維素酶類型的酶）相關(guān)。然而，該木質(zhì)纖維素生物質(zhì)（如纖維素）的酶促水解的缺點(diǎn) 是其工業(yè)生產(chǎn)方法較為昂貴。因此，有必要使用越來越有效的分泌纖維素酶的微生物菌株。 在這方面，很多微生物包含水解纖維素的酶，例如真菌-木霉屬（Trichoderma)、黑曲霉屬 (Aspergillus)、腐質(zhì)霉屬（Humicola)、或鐮刀菌屬（Fusarium)，以及細(xì)菌例如高溫單孢菌 屬（Thermomonospora)、芽抱桿菌屬（Bacillus)、纖維單胞菌屬（Cellulomonas)和鏈霉菌 屬（Str印tomyces)。由這些微生物分泌的酶具有用于將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的三種類型的 活性，分為三組：隨機(jī)攻擊纖維素纖維內(nèi)部的內(nèi)切葡聚糖酶，攻擊纖維末端釋放纖維二糖的 外切葡聚糖酶，和將該纖維二糖水解為葡萄糖的葡萄糖苷酶。后者構(gòu)成了纖維素轉(zhuǎn)化 過程的限制性步驟。實(shí)際上，該過程的第一個(gè)難題是纖維二糖到葡萄糖的轉(zhuǎn)化，因?yàn)樵谏?燃料的生產(chǎn)過程中，任何在該過程最后沒有被水解的纖維二糖代表了產(chǎn)量的損失。
[0005]考慮到一些生產(chǎn)纖維素酶的微生物（包括木霉屬）產(chǎn)生非常少的0 _葡萄糖苷 酶，纖維二糖的積累是酶促水解的一個(gè)主要問題。實(shí)際上，由工業(yè)木霉屬菌株分泌的總蛋白 的不到1%是葡萄糖苷酶類型。因此，這樣少量的葡萄糖苷酶導(dǎo)致了將纖維二糖水 解為葡萄糖的低容量，從而造成在系統(tǒng)中纖維二糖的積累。高濃度的纖維二糖碰巧抑制其 他纖維素酶，尤其是抑制其反應(yīng)終產(chǎn)物是纖維二糖的外切葡聚糖酶的活性。為了克服這些 缺點(diǎn)，發(fā)明人在他們的專利申請W02010/029259中開發(fā)了 葡萄糖苷酶基因使其能夠獲 得具有增加的比活性的酶，從而大幅度改進(jìn)將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物燃料的工藝。
[0006] 水解和發(fā)酵可以根據(jù)各種方案進(jìn)行。最常見的由獨(dú)立的水解和發(fā)酵（SHF)組成。 該方法能夠通過維持最佳反應(yīng)條件來優(yōu)化各個(gè)步驟。發(fā)酵在約28°C至約30°C之間的溫度 即時(shí)進(jìn)行，而水解一般在至少45°C的溫度進(jìn)行。然而，在SHF中，在反應(yīng)最后釋放的糖濃度 非常高，導(dǎo)致對酶的抑制，降低了該方法的效率。
[0007] 為了避免這些缺點(diǎn)，可以設(shè)想另一種方法（SSF-同時(shí)糖化和發(fā)酵）。在SSF中，兩 個(gè)步驟（己糖的水解和發(fā)酵）同時(shí)發(fā)生，防止糖積累到抑制酶的濃度。使用單一反應(yīng)器后， 投資成本也降低了。由于沒有抑制，之后水解度就提高了，因?yàn)獒尫诺奶橇⒓幢挥糜诎l(fā)酵成 乙醇。
[0008]在該方法中，反應(yīng)器的溫度必然由水解和發(fā)酵的最佳溫度之間的平衡構(gòu)成，一般 在約30°C至約35°C之間。然而，纖維素分解酶（包括葡萄糖苷酶）的活性在該溫度被 降低了約30%。
[0009] 因此，需要在SSF方法的最佳水解和發(fā)酵溫度下，尤其是在約30°C至約35°C之間 的溫度下能夠保持有效的葡萄糖苷酶活性的酶。
[0010] 發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了在約30°c至約35°C之間的溫度下具有增強(qiáng)的e-葡萄糖苷酶 活性的多肽，尤其是與野生型BGL1蛋白（序列SEQIDN0 :3)的葡萄糖苷酶活性相比。 BGL1是來自里氏木霉（Trichodermareesei)的0-葡萄糖苷酶。
[0011] 發(fā)明人之前已經(jīng)鑒定出與野生型BGL1蛋白的葡萄糖苷酶活性相比具有增強(qiáng) 的特異性0 _葡萄糖苷酶活性的幾個(gè)克隆。該結(jié)果展示于他們的專利申請W02010/029259 中。更具體地，他們已經(jīng)說明了編碼SEQIDN0:5的多肽的一個(gè)具體克?。ǚQ為100B11)， 在里氏木霉中該克隆在強(qiáng)啟動子控制下的表達(dá)導(dǎo)致了產(chǎn)生的酶雞尾酒與由沒有表達(dá) 該酶的菌株產(chǎn)生的酶雞尾酒相比，其葡萄糖苷酶活性提高了 26.2倍（專利申請 W02010/029259 表 6)。
[0012] 令人驚訝且出乎意料地，他們現(xiàn)在說明了一個(gè)與之前鑒定的克隆100B11相比，編 碼具有增強(qiáng)活性的酶的新克隆，這是在約30°C至約35°C之間的溫度。
[0013] 因此，本發(fā)明涉及具有e-葡萄糖苷酶活性的具有氨基酸序列SEQIDN0 :1的多 肽。
[0014] 本發(fā)明的多肽的氨基酸序列如下：
[0015]MRYRTAAALALATGPFARADSHSTSGASAEAVVPPAGTPWGTAYDKAKAALAKLNLQDKVGIVSGVGWN GGPCVGNTSPASKIGYPQLCLQDGPLGIRFGGSVTAFTPGIQAASTWDTELMRQRGEYLGAEAKGCGIHVLLGPVAG PLGKTPQGGRNWEGFGVDPYLTGIAMAETIEGLQSAGVQACAKHYIVNEQELNRETISSNPDDRTLHELYLWPFADA VHANVASVMCSYNKINGSWACEDQYTLQTVLKDQLGFPGYVMTDWNAQHTTVQSANSGLDMSMPGTDFNGNNRLWGP ALTNAVNSNQVPTSRVDDMVTRILAAWYLTGQDQAGYPSFNISRNVQGNHKTNVRAIARDGIVLLKNDANILPLKKP ASIAVVGSAAIIGNHARNSPSCNDKGCDDGALGMGWGSGAVNYPYFVAPYDAINTRASSQGTQVTLSNTDNTSSGAS AARGKDVAIVFITADSGEGYITVEGNAGDRNNLDPWHNGNALVQAVAGANSNVIVVVHSVGAIILEQILALPQVKAV VWAGLPSQESGNALVDVLWGDVSPSGKLVYTIAKSPNDYNTRIVSGGSDSFSEGLFIDYKHFDDANITPRYEFGYGL SYTKFNYSRLSVLSTAKSGPATGAVVPGGPSDLFQNVATVTVDIANSGQVTGAEVAQLYITYPSSAPRTPPKQLRGF AKLNLTPGQSGTATFNIRRRDLSYWDTASQKWWPSGSFGISVGASSRDIRLTSTLSVA。
[0016] 該多肽由核酸序列SEQIDN0 :2編碼。
[0017] 優(yōu)選地，具有氨基酸序列SEQIDN0 :1的該多肽在約30°C至約35°C之間的溫度具 有增強(qiáng)的葡萄糖苷酶活性，尤其是與在這些相同溫度下的具有序列SEQIDN0 :3的野 生型BGL1蛋白的0 -葡萄糖苷酶活性相比。BGL1蛋白由核酸序列SEQIDN0 :4編碼。
[0018] 更優(yōu)選地，具有氨基酸序列SEQIDN0 :1的該多肽在約30°C至約35°C之間的溫度 與在相同溫度下的具有氨基酸序列SEQIDN0 :5的100B11多肽的葡萄糖苷酶活性相 比具有增強(qiáng)的0 -葡萄糖苷酶活性。100B11多肽由核酸序列SEQIDN0 :6編碼。
[0019] 此外，根據(jù)本發(fā)明的多肽具有對葡萄糖的抑制不太敏感的優(yōu)點(diǎn)，因此在高葡萄糖 濃度存在下保留更好的葡萄糖苷酶活性。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施方案中，如之前所述的多肽在葡萄糖存在下測定的葡萄糖苷酶活 性與野生型蛋白BGL1(SEQIDN0 :3)在沒有葡萄糖時(shí)測定的葡萄糖苷酶活性相比增 強(qiáng)。
[0021] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與具有氨基酸序列SEQIDNO:5的100B11多肽的 0 _葡萄糖苷酶活性相比，本發(fā)明的多肽在約30°C至約35°C之間的溫度下的0 -葡萄糖苷 酶活性增強(qiáng)至少10 %、優(yōu)選增強(qiáng)至少20 %、優(yōu)選增強(qiáng)至少30 %、甚至更優(yōu)選增強(qiáng)至少40 %。
[0022] 例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過酶活性測試手段使用底物對硝基苯基-D-葡 萄糖苷（PNPG)確定根據(jù)本發(fā)明的多肽的酶活性的增加或換句話說改進(jìn)。在葡萄糖苷 酶作用后所得的對硝基苯酚的量可以，例如，通過讀取414nm的光學(xué)密度來確定。
[0023] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用來確定根據(jù)本發(fā)明的多肽與野生型BGL1蛋白相比是否具 有增強(qiáng)的酶活性的方案的實(shí)例如下：
[0024]-制備表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的多肽的大腸桿菌（E.coli)的原種培養(yǎng)物，在37°C過 夜；
[0025]-于20°C用1 %的原種培養(yǎng)物接種LB培養(yǎng)基24小時(shí)；
[0026] -在13000rpm下離心2分鐘；
[0027]-用pH5的100mM琥珀酸鹽緩沖液重新懸浮細(xì)胞沉淀（最終0D6QQ= 100);
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