專利名稱：一種增強大腸桿菌l-苯丙氨酸胞外分泌的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種通過基因工程技術和發(fā)酵的手段增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法。
背景技術：
L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)是一種人體必需但自身無法合成的具有生理活性的芳香族氨基酸，也是一種重要的醫(yī)藥和食用化學品中間體，在醫(yī)藥行業(yè)主要用于生產(chǎn)抗腫瘤藥物和氨基酸輸液制劑，在食品行業(yè)主要用于合成二肽甜味劑阿斯巴甜，具有良好的應用前景。生產(chǎn)L-苯丙氨酸的方法主要有水解抽提法、化學合成法、酶法和發(fā)酵法四種，其中，微生物發(fā)酵法所利用原料廉價易得，又可在常溫常壓下進行，是目前國內(nèi)外生產(chǎn)L-苯丙氨酸的主流方法。L-苯丙氨酸在大腸桿菌細胞內(nèi)通過芳香族氨基酸合成代謝途徑合成:葡萄糖進入細胞后經(jīng)過糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑合成磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸-赤蘚糖，在3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶(AroG)的作用下進入莽草酸途徑，在莽草酸激酶(AroK)、莽草酸脫氫酶(YdiB)等酶類的作用下合成分支酸，之后經(jīng)分支酸變位元酶和預苯酸脫水酶(PheA)等酶作用生成芳香族氨基酸前體物，再經(jīng)過酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(TyrB)的作用合成L-苯丙氨酸。從自然界中篩選出的具有產(chǎn)酸能力的微生物菌株一般氨基酸積累量有限；通過特別修飾選育出的突變株雖可提高L-苯丙氨酸的生產(chǎn)效率，但其盲目性大，工作量繁重，生產(chǎn)成本高，且突變株一般攜帶有營養(yǎng)缺陷，產(chǎn)量進一步提高受到限制。通過基因克隆手段解除代謝調(diào)控位點以促進目的產(chǎn)物合成已成功應用于檸檬酸、乳酸、琥珀酸等多種代謝產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)，是L-苯丙氨酸工業(yè)化生產(chǎn)的必然趨勢，但是，L-苯丙氨酸的代謝調(diào)控受限于基因轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄過程、翻譯起始、翻譯過程、酶量、酶活等多水平、不同層次的反饋控制，且由于質(zhì)粒載體的大小受到限制，很難通過過量表達連續(xù)的多個基因來解除所有的調(diào)控位點，此外，大腸桿菌在發(fā)酵過程中會積累副產(chǎn)物一乙酸，其可限制菌體的生長及目的產(chǎn)物的合成，降低產(chǎn)率。總之，可高產(chǎn)L-苯丙氨酸且發(fā)酵成本低廉的基因工程菌株目前尚未見報道，難以形成產(chǎn)業(yè)化。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術存在的上述缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法。本發(fā)明可明顯增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌水平，L-苯丙氨酸產(chǎn)量高，有害副產(chǎn)物乙酸濃度低，發(fā)酵成本低廉，工藝簡單，適宜產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的技術方案如下:一種增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，是將可同時過量表達酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶TyrB、甲基紫羅堿外轉(zhuǎn)運蛋白YddG、3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸_7_磷酸合成酶AroG、分支酸變位酶和預苯酸脫水酶PheA 、莽草酸激酶AroK以及莽草酸脫氫酶YdiB的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌,并通過液體發(fā)酵生產(chǎn)L-苯丙氨酸。
其進一步的技術方案為:所述重組質(zhì)粒是將大腸桿菌來源的TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以及YdiB編碼基因進行人工修飾以解除其所受代謝調(diào)控，并插入載體構建而成；所述液體發(fā)酵條件控制如下:發(fā)酵培養(yǎng)基的起始葡萄糖濃度為3 15g/L，發(fā)酵過程中的葡萄糖濃度為I 4g/L ;發(fā)酵溫度35 42°C，發(fā)酵pH值6.5 7.5，通氣量0.5
1.0vvm，溶氧量為初始氧濃度的10 35%，發(fā)酵時間48 72h。所述TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以及YdiB編碼基因的天然啟動子被其它不受末端代謝產(chǎn)物反饋阻遏的強啟動子所替換，以增強其表達水平。所述TyrB編碼基因編碼框的起始堿基序列被SEQ ID NO:1所示的堿基序列替換，以解除其與阻遏蛋白TyrR的結合能力。所述AroG氨基酸序列中第146位的天門冬氨酸被替換成天門冬酰胺，以解除苯丙氨酸對其的反饋抑制。所述PheA的R-domain結構域被刪除，以解除苯丙氨酸對其的反饋抑制。所述強啟動子包括Pk和/或Plj啟動子本發(fā)明的有益技術效果如下:本發(fā)明運用基因工程手段將大腸桿菌來源的TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以及YdiB編碼基因進行人工修飾，如引入強啟動子、刪除結構域、堿基替換、氨基酸突變等，使上述基因所受的代謝調(diào)控得到解除，再插入載體成功構建得到可同時過量表達TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以 及YdiB的表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化該質(zhì)粒的宿主大腸桿菌可高產(chǎn)L-苯丙氨酸；其中，通過增強L-苯丙氨酸合成代謝通路所需酶類(AroG、PheA、AroK、YdiB以及TyrB)的表達水平，可加快L-苯丙氨酸的合成速率，同時，YddG的表達增強可加快L-苯丙氨酸的胞外轉(zhuǎn)運速率，降低胞內(nèi)濃度，從而降低L-苯丙氨酸對代謝合成途徑產(chǎn)生的反饋抑制，最終達到提高其代謝通量和發(fā)酵強度的目的；本發(fā)明方法可明顯增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌水平，L-苯丙氨酸產(chǎn)量高(可達62g/L)，有害副產(chǎn)物乙酸濃度低(< 3g/L)，發(fā)酵成本低廉，工藝簡單，適宜產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明進行具體說明。以下實施例所涉及試驗材料如下:大腸桿菌擬合DNA提取自大腸桿菌Escherichia coli str.K-12 substr.W3110 (購自美國模式菌種收集中心ATCC，保藏編號為ATCC NO:27325) ；pMD 18T_simpleVector購自寶生物工程(大連)有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoR 1、EcoRV、Afl I1、Nco
1、Kpn I，DNA聚合酶，連接酶均購自賽默飛公司；質(zhì)粒pSY130-14 (包含Pl啟動子)由本發(fā)明人實驗室保藏，其構建方法可參照如下文獻報道:S Sugimoto, M Yabuta, NKato,T Seki,T Yoshida, H Taguchi(1987)Hyperproduction of phenylalanine byEscherichia col1:application of a temperature-controllable expression vectorcarrying the repressor-promoter system of bacteriophage lambda.Journal ofBiotechnology.5:237 - 253 ；RNAprep Pure培養(yǎng)細胞/細菌總RNA提取試劑盒(離心柱型含DNAase)購自天根生化科技有限公司；PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time購自寶生物工程(大連)有限公司。其它原料和試劑為市售國產(chǎn)或進口分析純商品。所使用儀器設備均為本領域常規(guī)儀器設備。以下實施例所用種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，其組成為:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，其余成分為水；所用液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為=K2HPO4.3H20 13.57g/L, KH2PO4 4.5g/L, (NH)4SO2 lg/L, MgSO4 lg/L, arginine0.lg/L, histidine 0.lg/L,isolecine 0.lg/L, valine 0.lg/L, proline 0.2g/L, p-aminobenzoic acid 0.02g/L, p-hydroxybenzoic0.02g/L, CaCl2 0.015g/L, VB10.075g/L, FeSO4.7H20 0.1175g/L, Na-Citrate 0.lg/L,微量元素溶液1.5ml/L,其余成分為水(微量元素溶液組成為:Al2(SO4)3.18H20 2g/L, CoSO4.7H20 0.75g/L, CuSO4.5H20 2.5g/L, H3BO3 0.5g/L,MnSO4.7H20 24g/L, Na2MoO4.2H203g/L, NiSO4.6H20 2.5g/L, ZnSO4.7H20 15g/L，其余成分為水)。實施例1構建過量表達AroG、PheA、AroK以及YdiB的質(zhì)粒pR15ABK1.1 3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶AroG代謝調(diào)控的解除以大腸桿菌擬合DNA為模板，用上游引物aroG15_F146 (堿基序列如SEQ ID NO: 2所示)和下游引物aroG_Hind III _RV (堿基序列如SEQ ID NO: 3所示)進行PCR擴增獲得基因片段A，以大腸桿菌擬核DNA為模板，用上游引物aroG_Kpn I _Fff (堿基序列如SEQ ID勵:4所示)和下游引物&1'0615_1 146 (堿基序列如SEQ ID NO: 5所示)進行PCR擴增獲得基因片段B。以基因片段A和B為模板，通過重疊PCR (按照PCR定點突變技術進行，參考文獻如下:Ho, S.N., H.D.Hunt, R.M.Horton, J.K.Pullen, and L.R.Pease (1989) Site-directedmutagenesis by overl ap extension using the polymerase chain reaction.Gene.77:51-59)擴增目的片段，引物設計如下:上游引物aroG_Sma I _FW堿基序列如SEQID N0:6所示，下游引物aroG_Afl II _EcoR I _RV堿基序列如SEQ ID N0:7所示，經(jīng)上海生工生物工程有限公司測序，確定該片段AroG15基因編碼的AroG第146位天門冬氨酸被替換為天門冬酰胺。通過酶切連接反應將上述擴增片段連接到質(zhì)粒pSY130-14上，具體方法參見相應限制性內(nèi)切酶或連接酶說明書，構建得到質(zhì)粒PR15，該質(zhì)粒解除了苯丙氨酸對AroG基因的代謝調(diào)控，通過強啟動子Pk啟動AroG表達。1.2分支酸變位酶和預苯酸脫水酶PheA代謝調(diào)控的解除以大腸桿菌擬合DNA為模板擴增PheA基因催化活性中心第I 900bp堿基序列，刪除負責反饋抑制的R-domain結構域,引物設計如下:上游引物pheA_Sma I _FW堿基序列如SEQ ID NO:8所示，下游引物堿基序列pheA_Nco I _BamH I _EcoR V _RV如SEQ IDN0:9所示；通過酶切連接反應將該擴增片段連接到上述質(zhì)粒PR15，具體方法參見相應限制性內(nèi)切酶或連接酶說明書，構建得到質(zhì)粒pR15A,該質(zhì)粒解除了苯丙氨酸對AroG和PheA基因的代謝調(diào)控，通過強啟動子Pk啟動AroG表達，通過強啟動子啟動PheA表達。1.3莽草酸激酶AroK和莽草酸脫氫酶YdiB代謝調(diào)控的解除通過重疊PCR (方法同1.1)將AroK和YdiB編碼基因連接在一起，引物設計如下:第一對，上游引物ydiB_Sma I _FW堿基序列如SEQ ID NO: 10所示，下游引物ydiB_aroK_RV堿基序列如SEQ ID NO:ll所示，第二對，上游引物aroK_ydiB_FV堿基序列如SEQ ID NO: 12所示，下游引物aroK_Sma I _RV堿基序列如SEQ ID NO: 13所示；通過酶切連接反應將該擴增片段連接到上述質(zhì)粒PR15A，位于PheA編碼基因后，具體方法參見相應限制性內(nèi)切酶或連接酶說明書，構建得到質(zhì)粒PR15ABK，該質(zhì)粒解除了 AroG、PheA、AroK以及YdiB基因所受的代謝調(diào)控，并且使上述基因的天然啟動子被Pk和匕啟動子所替換，通過強啟動子Pk啟動AroG表達，通過強啟動子Pl啟動PheA、AroK以及YdiB的表達。實施例2酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶TyrB代謝調(diào)控的解除以大腸桿菌擬合DNA為模板進行PCR擴增獲得tyrB編碼基因，引物設計如下:上游引物tyrB_EcoRV_SD_SB_FW堿基序列如SEQ ID NO: 14所示，下游引物tyrB_Afl II _EcoR I _RV堿基序列如SEQ ID NO: 15所示，其中，SD序列AAGGAGGAACAGAC為核糖體結合位點，SB序列ATGTTCCAGAAGGTCGATG (如SEQ ID NO:1所示)為替換后的tyrB基因編碼框起始堿基序列。將擴增獲得TyrB編碼基因與pMD 18T_simple Vector連接，經(jīng)上海生工生物工程有限公司測序并鑒定正確后，通過酶切連接反應(具體方法參見相應限制性內(nèi)切酶或連接酶說明書)與實施例1構建的質(zhì)粒PR15ABK連接，將tyrB編碼基因置于強啟動子Pk后方，從而構建得到可同時過量表達TyrB、AroG、PheA、AroK以及YdiB的質(zhì)粒，通過強啟動子Pk啟動AroG和tyrB表達，通過 強啟動子啟動PheA、AroK以及YdiB的表達；按照《分子克隆實驗指南》所述操作步驟轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli str.K-12 substr.W3110進行液體發(fā)酵，發(fā)酵結束，測得發(fā)酵液中L-苯丙氨酸濃度為45g/L，乙酸濃度為2.2g/L。上述液體發(fā)酵生產(chǎn)方法具體如下:種子培養(yǎng):取菌株接種于LB培養(yǎng)基，于33°C振蕩培養(yǎng)12h，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，得到活化種子液。液體發(fā)酵培養(yǎng):用高濃度葡萄糖液調(diào)整液體發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖濃度為15g/L，用濃氨水調(diào)整pH值至6.5 7.5，并調(diào)整通氣量為0.5vvm，發(fā)酵溫度為35°C，以體積百分比5%的接種量接種上述活化種子液，當菌體0D_=3.0時，調(diào)整發(fā)酵溫度為42°C，通氣量為
0.8vvm,改變攪拌轉(zhuǎn)速控制溶氧量為初始氧濃度的10 35%，通過流加高濃度葡萄糖液控制培養(yǎng)基葡萄糖濃度為4g/L，并通過流加濃氨水控制pH值為6.5 7.5，發(fā)酵48h。上述L-苯丙氨酸濃度測定方法:采用C18反向色譜柱，以7%甲醇為流動相，檢測波長210nm。上述乙酸濃度測定方法:采用Shodex SHlOll離子交換色譜柱在50°C的溫度下，以0.0lmol/L的稀硫酸為流動相，流速0.8ml/min，利用示差檢測器進行監(jiān)測。實施例3甲基紫羅堿外轉(zhuǎn)運蛋白(methyl viologen efflux pump,YddG)代謝調(diào)控的解除以大腸桿菌擬合DNA為模板進行PCR擴增獲得yddG編碼基因，引物設計如下:上游引物 yddG_EcoRV_SD_FW 堿基序列如 SEQ ID NO: 16 所示，下游引物 yddG_NcoI_KpnI_RV堿基序列如SEQ ID NO: 17所示，其中，SD序列AAGGAGGAACAGAC為核糖體結合位點。將擴增獲得的yddG編碼基因與pMD 18T_simple Vector連接，經(jīng)上海生工生物工程有限公司測序并鑒定正確后，通過酶切連接反應(具體方法參見相應限制性內(nèi)切酶或連接酶說明書)與實施例2構建的質(zhì)粒連接，將yddG編碼基因置于強啟動子匕后方，構建得到可同時過量表達YddG、TyrB、AroG、PheA、AroK以及YdiB的的重組表達質(zhì)粒，通過強啟動子Pk啟動AroG和tyrB表達，通過強啟動子Pl啟動PheA、AroK、YdiB以及YddG的表達。按照《分子克隆實驗指南》所述操作步驟轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli str.K-12 substr.W3110，構建得到增強型L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌株E.coli W14，以E.coliW14作為發(fā)酵菌株，按照實施例2所述方法進行液體發(fā)酵，發(fā)酵結束，測得發(fā)酵液中L-苯丙氨酸濃度為55g/L，乙酸濃度為3g/L，測定方法同實施例1。實施例4 TyrB和YddG過量表達的熒光定量PCR驗證取E.coli W14 和 E.coli W3110 (含轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 pR15ABK 的大腸桿菌 Escherichiacoli str.K-12substr.W3H0)分別接種于LB培養(yǎng)基，于33°C過夜振蕩培養(yǎng)，然后以體積百分比5%的接種量接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基(補加終濃度為5g/L的葡萄糖)，于35°C振蕩培養(yǎng)9h，再轉(zhuǎn)為38°C培養(yǎng)，并于培養(yǎng)第Ilh和第15h取樣，采用RNApr印Pure培養(yǎng)細胞/細菌總RNA提取試劑盒(離心柱型含DNAase)提取總RNA，具體操作步驟參見試劑盒使用說明書，并米用 PrimeScriptRT Master Mix Perfect Real Time 在 CFX96 Bio-Rad Real-Time PCRDetection System (Bio-Rad)進行熒光定量 PCR，以 ihfB 作為內(nèi)參基因，以 E.coli W3110作為對照菌株，于 CFX96 Bio-Rad Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)分別對tyrB,yddG和ihfB基因進行熒光定量PCR擴增，tyrB、yddG和ihfB基因的擴增上下游引物堿基序列(TyrBa、TyrBb，YddGa、YddGb，ihfBa、ihfBb)分別如 SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19，SEQ ID NO:20, SEQ ID N0:21 以及 SEQ ID N0:22、SEQ ID NO:23 所示，擴增條件如下:預變性95°C 30s,然后95°C 5s, 60°C 35s循環(huán)40次，并采用梯度稀釋法獲得標準曲線，yddG:y=-3.286X+11.895 (E=IOl.5%R2=0.981) ；tyrB:y=-3.334x+15.335 (E=99.5%R2=0.988)；ihfB:y=-3.364+21.121 (E=98.3.1%R2=0.988)，采用 Th' 法(參考文獻如下:LivakK, Shmittgen TD (2001)Analysis of relative gene expression data using real-timequantitative PCR and t\\e2^^ Δετ method.Methods25:402 - 408)計算 tyrB 和 yddG 的表達水平，與E.coli W3110相比，E.coli W14菌株中tyrB和yddG的表達水平在培養(yǎng)第Ilh分別提高至4.85和5.17，第15h分別提高至12.57和5.97，證明E.coli W14菌株可同時過量表達tyrB和yddG。以上數(shù)據(jù)分析采用CFX Manager 3.0 (Bio-Rad)進行。實施例5 yddG的過量表達對胞內(nèi)和胞外L-苯丙氨酸濃度的影響M9培養(yǎng)基中胞內(nèi)胞外L-苯丙氨酸濃度測定方法:將E.coli W14和E.coliW3110(同實施例4，對照菌株)分別接種于LB培養(yǎng)基，于200rpm培養(yǎng)9h后，升溫至38°C繼續(xù)培養(yǎng)2h，取出菌體用無菌生理鹽水(0.9%NaCl)洗滌兩次，再用M9培養(yǎng)基(先配制5XM9鹽溶液=Na2PO4.7H20 12.8g，KH2PO4 3.0g, NaCl0.5g，NH4Cl 1.0g，滅菌，使用時取 5XM9 鹽溶液200ml,加入已滅菌的 lmol/L 的 MgSO4 2ml, lmol/L 的 CaCl2 0.1ml, 20%葡萄糖溶液 20ml,用滅菌雙蒸水定容至1000ml)調(diào)整0D_至6，于38°C培養(yǎng)，在lh、2h、3h和8h取樣測定胞內(nèi)胞外L-苯丙氨酸濃度。胞內(nèi)L-苯丙氨酸測定方法如下:取適量發(fā)酵液調(diào)整0D_至3 (相當于菌體數(shù)量為I 2X109CFU/ml)，離心收集ImL菌體，水洗兩次，加入250 μ L 35%高氯酸于振蕩器劇烈振蕩5min，加入280 μ L 2.7mol/L Na2CO3中和，離心除去細胞碎片，用作液相分析，L-苯丙氨酸濃度測定方法同實施例1 (假設大腸桿菌細胞體積為I μ m3)。實驗結果參見表I和表2。 表I M9培養(yǎng)基中胞外L-苯丙氨酸濃度變化
權利要求
1.一種增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法,其特征在于:將可同時過量表達酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶TyrB、甲基紫羅堿外轉(zhuǎn)運蛋白YddG、3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸_7_磷酸合成酶AroG、分支酸變位酶和預苯酸脫水酶PheA、莽草酸激酶AroK以及莽草酸脫氫酶YdiB的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌，并通過液體發(fā)酵生產(chǎn)L-苯丙氨酸。
2.根據(jù)權利要求1所述增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，其特征在于:所述重組質(zhì)粒是將大腸桿菌來源的TyrB、YddG, AroG、PheA、AroK以及YdiB編碼基因進行人工修飾以解除其所受代 謝調(diào)控，并插入載體構建而成。
3.根據(jù)權利要求1所述增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，其特征在于所述液體發(fā)酵條件控制如下:發(fā)酵培養(yǎng)基的起始葡萄糖濃度為3 15g/L，發(fā)酵過程中的葡萄糖濃度為I 4g/L;發(fā)酵溫度35 42°C，發(fā)酵pH值6.5 7.5，通氣量0.5 1.0vvm，溶氧量為初始氧濃度的10 35%，發(fā)酵時間48 72h。
4.根據(jù)權利要求2所述增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，其特征在于:所述TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以及YdiB編碼基因的天然啟動子被其它不受末端代謝產(chǎn)物反饋阻遏的強啟動子所替換，以增強其表達水平。
5.根據(jù)權利要求2所述增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，其特征在于:所述TyrB編碼基因編碼框的起始堿基序列被SEQ ID NO:1所示的堿基序列替換，以解除其與阻遏蛋白TyrR的結合能力。
6.根據(jù)權利要求2所述增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，其特征在于:所述AroG氨基酸序列中第146位的天門冬氨酸被替換成天門冬酰胺，以解除苯丙氨酸對其的反饋抑制。
7.根據(jù)權利要求2所述增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，其特征在于:所述PheA的R-domain結構域被刪除，以解除苯丙氨酸對其的反饋抑制。
8.根據(jù)權利要求4所述增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，其特征在于:所述強啟動子包括Pk和/或Plj啟動子。
全文摘要
本發(fā)明公開一種增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，是將可同時過量表達酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶TyrB、甲基紫羅堿外轉(zhuǎn)運蛋白YddG、3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶AroG、分支酸變位酶和預苯酸脫水酶PheA、莽草酸激酶AroK以及莽草酸脫氫酶YdiB的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌，并通過液體發(fā)酵生產(chǎn)L-苯丙氨酸，所述重組質(zhì)粒是將大腸桿菌來源的TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以及YdiB編碼基因進行人工修飾以解除其所受代謝調(diào)控，并插入載體構建而成。本發(fā)明可明顯增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌水平，L-苯丙氨酸產(chǎn)量高，有害副產(chǎn)物乙酸濃度低，發(fā)酵成本低廉，工藝簡單，適宜產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/19GK103146773SQ201310074890
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月8日 優(yōu)先權日2013年3月8日
發(fā)明者劉雙平, 石貴陽, 張梁, 丁重陽, 何冬旭, 李贏 申請人:江南大學