一種痛風(fēng)血清miRNAs生物標(biāo)志物及其表達(dá)量的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種痛風(fēng)血清miRNAs生物標(biāo)志物及其表 達(dá)量的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 痛風(fēng)是一種與遺傳有關(guān)的長(zhǎng)期嘌呤代謝障礙或尿酸排泄障礙，導(dǎo)致血尿酸持續(xù)增 高和尿酸鹽結(jié)晶沉積，引起組織損傷的一組臨床綜合征。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是慢性高尿酸血癥 形成的尿酸結(jié)晶在關(guān)節(jié)腔內(nèi)沉積而引發(fā)的關(guān)節(jié)炎，是痛風(fēng)的最重要病癥。隨著人們生活方 式的改變，痛風(fēng)在我國(guó)發(fā)病率不斷上升，南方和沿海經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)發(fā)病率尤高，因此越來(lái)越 受到醫(yī)學(xué)界的重視。痛風(fēng)引起的不可逆的關(guān)節(jié)破壞和功能障礙給人們的健康帶來(lái)了極大的 危害。痛風(fēng)不僅能引起關(guān)節(jié)腫脹，而且可誘發(fā)和加重脂代謝紊亂、糖尿病及心血管疾病等， 增加心腦血管疾病、代謝綜合征及腎臟疾病病人的病死率。因此，痛風(fēng)已成為嚴(yán)重威脅人類(lèi) 健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，高尿酸血癥的患病率越來(lái)越高， 而痛風(fēng)的發(fā)病率也同樣有明顯的升高，但目前臨床尚缺乏有效的治療藥物，亟需更多的研 究進(jìn)一步研究分析痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制和檢測(cè)方法。
[0003] 目前痛風(fēng)最準(zhǔn)確的檢測(cè)方法為關(guān)節(jié)滑液或痛風(fēng)石的抽吸物中的尿酸鹽晶體檢測(cè)， 偏振光顯微鏡下表現(xiàn)為負(fù)性雙折光的針狀或桿狀的單鈉尿酸鹽晶體，是當(dāng)前檢測(cè)痛風(fēng)不可 替代的金標(biāo)準(zhǔn)，急性發(fā)作期，單鈉尿酸鹽晶體可見(jiàn)于關(guān)節(jié)滑液中白細(xì)胞內(nèi)、外，也可見(jiàn)于痛 風(fēng)石的抽吸物中；在發(fā)作間歇期，單鈉尿酸鹽晶體也可見(jiàn)于曾受累關(guān)節(jié)的滑液中，但是尿酸 鹽晶體檢測(cè)不僅會(huì)帶給患者創(chuàng)傷和較重的疼感，而且關(guān)節(jié)滑液的穿刺吸取比較困難，所以， 痛風(fēng)的分子生物學(xué)研究日益受到國(guó)內(nèi)外的重視，需要敏感而特異性的無(wú)創(chuàng)性的血清學(xué)指 標(biāo)，從分子水平上提高對(duì)痛風(fēng)的檢測(cè)水平。
[0004] MicroRNAs (miRNAs)是一類(lèi)分布廣泛的非編碼的單鏈小分子RNA，其通過(guò)對(duì)mRNA 降解或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后對(duì)靶基因的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而參與細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、凋 亡、代謝等功能。目前研究證實(shí)miRNAs在很多疾病中具有重要作用，而且與一些炎癥性疾 病的發(fā)病緊密相關(guān)。研究表明，機(jī)體內(nèi)組織、器官的代謝異?；蚱髻|(zhì)性病變可能導(dǎo)致特定疾 病狀態(tài)下某些血清miRNAs表達(dá)水平的升高或降低。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)血清中存在大量豐富且穩(wěn) 定的miRNAs,通過(guò)對(duì)患者血清中miRNAs表達(dá)譜與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)不同疾病中具 有特定的表達(dá)譜，可為疾病的無(wú)創(chuàng)性早期檢測(cè)提供一條新的途徑。miRNAs在血液中可長(zhǎng)期 穩(wěn)定存在，反復(fù)凍融、長(zhǎng)期保存等各種處理方法均不會(huì)造成血清miRNAs的損失，而外周血 標(biāo)本的獲得卻十分簡(jiǎn)便，在血液中檢測(cè)出痛風(fēng)特異性的miRNAs并將其作為痛風(fēng)的生物學(xué) 標(biāo)志具有重要的意義，目前還未見(jiàn)有關(guān)痛風(fēng)血清miRNAs的公開(kāi)報(bào)道。因此，提供一種痛風(fēng) 血清miRNAs生物標(biāo)志物及其表達(dá)量的檢測(cè)方法，確定痛風(fēng)miRNAs表達(dá)譜，篩選痛風(fēng)特異表 達(dá)的miRNAs，建立血清miRNAs診斷模型，有助于實(shí)現(xiàn)對(duì)痛風(fēng)的無(wú)創(chuàng)準(zhǔn)確診斷及早期治療。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)，尋求設(shè)計(jì)提供提供一種痛風(fēng)血清 miRNAs生物標(biāo)志物及其表達(dá)量的檢測(cè)方法，建立痛風(fēng)血清miRNAs表達(dá)譜，揭示血清miRNAs 對(duì)痛風(fēng)檢測(cè)的價(jià)值，為臨床上痛風(fēng)患者的無(wú)創(chuàng)準(zhǔn)確診斷提供支持。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明涉及的痛風(fēng)血清miRNAs生物標(biāo)志物包括上調(diào)表 達(dá)的hsa-miR-3146、hsa-miR-4449 和hsa-miR-4531 以及下調(diào)表達(dá)的hsa_miR-451a、 hsa-miR-223-3p、hsa-miR-589_5p和hsa-miR-885_5p。
[0007] 本發(fā)明涉及的痛風(fēng)血清miRNAs為來(lái)自外周靜脈血的血清。
[0008] 本發(fā)明涉及的痛風(fēng)血清miRNAs生物標(biāo)志物能用于制備痛風(fēng)診斷試劑或生物芯片 等工具。
[0009] 本發(fā)明涉及的痛風(fēng)血清miRNAs生物標(biāo)志物的表達(dá)量的檢測(cè)方法如下：
[0010] (1)逆轉(zhuǎn)錄：采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和miRNAs特異性莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行miRNAs 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系包括3uL5*的逆轉(zhuǎn)錄引物、1.5uL10*的逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、0. 20uL的 RNA抑制劑、0. 15uL100mmol/L的dNTP和dTTP混合物、luL逆轉(zhuǎn)錄酶，每個(gè)反應(yīng)體系中加入 9. 15uLRNA，總反應(yīng)體系為15uL;該方法的反應(yīng)條件為：16°C反應(yīng)30分鐘，42°C反應(yīng)30分 鐘，最后85 °C孵育5分鐘；
[0011] (2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR:反應(yīng)體系包括：0.25uL20*miRNA檢測(cè)探針、2.5uL 2*MasterMix、1.25uL雙蒸水、luL稀釋后的cDNA，共5uL，每個(gè)miRNA檢測(cè)實(shí)施3平行；使 用八81?1^81117900熒光定量？〇?儀檢測(cè)，其反應(yīng)條件：951：10分鐘、951：15秒、601：1分 鐘，以上階段進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，完成對(duì)痛風(fēng)血清miRNAs生物標(biāo)志物的表達(dá)量的檢測(cè)。
[0012] 本發(fā)明采用microRNA Microarray芯片對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、單純高尿酸血 癥及健康對(duì)照者血清標(biāo)本的miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行高通量的對(duì)比分析，篩選出20個(gè)候選 miRNAs，然后采用預(yù)先設(shè)計(jì)的反轉(zhuǎn)錄引物和前向反向檢測(cè)引物，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定 量PCR (RT-PCR)方法，擴(kuò)大樣本量對(duì)20個(gè)候選miRNAs在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎及對(duì)照者血清中的 表達(dá)豐度進(jìn)行驗(yàn)證，建立痛風(fēng)特異血清miRNAs表達(dá)譜；然后采用ROC (Receiver Operator Characteristic Curve)分析方法評(píng)價(jià)血清miRNAs表達(dá)譜對(duì)于痛風(fēng)患者的早期診斷以及 不同臨床分級(jí)、分期的痛風(fēng)患者的診斷價(jià)值。
[0013] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，涉及的用于檢測(cè)痛風(fēng)的生物標(biāo)志物hsa-miR-3146、 hsa-miR-4449、hsa-miR-4531、hsa_miR-451a、hsa-miR-223_3p、hsa-miR-589_5p和 hsa-miR-885-5p作為血清重要的生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)，在痛風(fēng)臨床早期準(zhǔn)確診斷有重要價(jià)值， 為以后從分子水平診斷痛風(fēng)及痛風(fēng)血清miRNAs的研究提供了理論依據(jù)，具有重大的理論 意義和潛在的實(shí)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】：
[0014] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例涉及的miRNAs在急性痛風(fēng)病例和單純高尿酸血癥對(duì)照血清 中的表達(dá)差異譜。
[0015] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例涉及的miRNAs在急性痛風(fēng)病例和健康對(duì)照血清中的表達(dá)差 異譜。
[0016]圖3為本發(fā)明實(shí)施例涉及的hsa-miR-3146、hsa-miR-4449、hsa-miR-4531和 hsa-miR-4654在痛風(fēng)病例和健康對(duì)照血清中的表達(dá)。
[0017] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例涉及的hsa-miR-451a、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-361-5p、 hsa-miR-589_5p和hsa-miR-885_5p在痛風(fēng)病例和健康對(duì)照血清中的表達(dá)。
[0018]圖5為本發(fā)明實(shí)施例涉及的hsa-miR-3146、hsa-miR-4449、hsa-miR-4531、 hsa-miR-451a、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-589-5p和hsa-miR-885-5p對(duì)痛風(fēng)的診斷ROC曲 線(xiàn)。
【具體實(shí)施方式】：
[0019] 下面通過(guò)實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，實(shí)施例中未注明的條件和方 法等均按照常規(guī)條件進(jìn)行。
[0020] 本實(shí)施例將痛風(fēng)血清miRNAs生物標(biāo)志物用于檢測(cè)痛風(fēng)，其具體過(guò)程為：
[0021] 1?采用Microarray芯片篩選候選的痛風(fēng)相關(guān)miRNAs:
[0022] 收集4例急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、4例單純高尿酸血癥及4例健康對(duì)照者的血清，使 用凝血管采集全血，采血后兩小時(shí)內(nèi)分離血清，采血后輕輕倒轉(zhuǎn)采血管混合4-5次，直立置 于室溫待血液完全凝固，l〇〇〇g離心10分鐘，分離血清；將分離出的血清轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的凍 存管，按照每500ul/管分裝好；再利用exqion的LNA?microRNAMicroarray對(duì)痛風(fēng)血清 的表達(dá)譜進(jìn)行高通量的篩選；根據(jù)預(yù)設(shè)的條件，從中篩選出痛風(fēng)miRNAs特異表達(dá)譜，然后 依次進(jìn)行血清總RNA的抽提與純化、miRNA熒光標(biāo)記、miRNA芯片雜交后以AxonGenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片，并以GenePixproV6.0讀取芯片各探針的原始熒光強(qiáng)度，最后 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，從而建立痛風(fēng)患者血清miRNAs特異表達(dá)譜，篩選出痛風(fēng)血清候選miRNAs; 篩選標(biāo)準(zhǔn)為：1)表達(dá)水平變化倍數(shù)（FoldChange) >2 (低表達(dá)時(shí)低于0. 5) ;2)P值〈0. 05 ; 3)檢測(cè)率大于75% ;4)通過(guò)差異表達(dá)的火山圖（VolcanoPlot);篩選出在痛風(fēng)患者中 高表達(dá)或低表達(dá)的20個(gè)miRNAs,其中表達(dá)上調(diào)6個(gè)，包括hsa-miR-3146、hsa-miR-4449、 hsa-miR-4531、hsa_miR-3611、hsa-miR-652_5p和hsa-miR-4654 ;表達(dá)下調(diào)的有 14個(gè)，包括 hsa_miR-451a、hsa-miR-223_3p、hsa-miR-4763_5p、hsa-miR-374b_5p、hsa-miR-106b_5p、 hsa-miR-589-5p、hsa-miR-3907、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-361-5p和hsa-miR-30c_5p(見(jiàn) 表1，及圖1和圖2);上述20個(gè)miRNAs的序列見(jiàn)表2。
[0023] 表1 :痛風(fēng)患者血清中高表達(dá)及低表達(dá)的miRNAs
[0024]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種痛風(fēng)血清miRNAs生物標(biāo)志物，其特征在于痛風(fēng)血清miRNAs生物標(biāo)志物 包括 hsa-miR-3146、hsa-miR-4449、hsa-miR-4531、hsa_miR-451a、hsa-miR-223_3p、 hsa-miR-589_5p 和 hsa-miR-885_5p〇
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述痛風(fēng)血清miRNAs生物標(biāo)志物，其特征在于痛風(fēng)血清miRNAs為 來(lái)自外周靜脈血的血清。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述痛風(fēng)血清miRNAs生物標(biāo)志物，其特征在于所述痛風(fēng)血清 miRNAs生物標(biāo)志物能用于制備痛風(fēng)診斷試劑或生物芯片。
4. 一種如權(quán)利要求1所述痛風(fēng)血清miRNAs生物標(biāo)志物的表達(dá)量的檢測(cè)方法，其特征在 于包括以下步驟： (1) 逆轉(zhuǎn)錄：采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和miRNAs特異性莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行miRNAs逆 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系包括3uL 5*的逆轉(zhuǎn)錄引物、I. 5uL 10*的逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、0. 20uL的RNA 抑制劑、〇. 15uL lOOmmol/L的dNTP和dTTP混合物、IuL逆轉(zhuǎn)錄酶，每個(gè)反應(yīng)體系中加入 9. 15uLRNA，總反應(yīng)體系為15uL ;該方法的反應(yīng)條件為：16°C反應(yīng)30分鐘，42°C反應(yīng)30分 鐘，最后85 °C孵育5分鐘； (2) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR :反應(yīng)體系包括：0. 25uL 20*miRNA檢測(cè)探針、2. 5uL 2*Master 1^1、1.251^雙蒸水、11^稀釋后的〇0嫩，共5此，每個(gè)11^1?隱檢測(cè)實(shí)施3平行；使用八81 ?1^81117900熒光定量？〇?儀檢測(cè)，其反應(yīng)條件 ：951：10分鐘、951：15秒、601：1分鐘，以 上階段進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，完成對(duì)痛風(fēng)血清miRNAs生物標(biāo)志物的表達(dá)量的檢測(cè)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種痛風(fēng)血清miRNAs生物標(biāo)志物及其表達(dá)量的檢測(cè)方法,痛風(fēng)血清miRNAs生物標(biāo)志物包括hsa-miR-3146、hsa-miR-4449、hsa-miR-4531、hsa-miR-451a、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-589-5p和hsa-miR-885-5p，這些標(biāo)志物作為血清重要的生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)，能用于制備痛風(fēng)診斷試劑或生物芯片等工具，在痛風(fēng)臨床早期準(zhǔn)確診斷有重要價(jià)值，為以后從分子水平診斷痛風(fēng)及痛風(fēng)血清miRNAs的研究提供了理論依據(jù)，具有重大的理論意義和潛在的實(shí)用價(jià)值。
【IPC分類(lèi)】C12Q1-68, C12N15-113
【公開(kāi)號(hào)】CN104651513
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510080131
【發(fā)明人】王顏剛, 趙世華, 侯旭
【申請(qǐng)人】青島大學(xué)附屬醫(yī)院
【公開(kāi)日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2015年2月15日