抗藥性稗草中的1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶及其編碼基因、突變位點與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及稗草抗藥性相關(guān)基因及其應(yīng)用，特別涉及抗藥性稗草中的1-氨基環(huán) 丙烷-1-羧酸氧化酶及其編碼基因、突變位點與應(yīng)用，屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)申請人所知，稗草（Echinochloa)是一年生禾本科稗屬植物的總稱，目前 全世界已發(fā)現(xiàn)約有35種稗草，生長在熱帶或亞熱帶地區(qū)，其中我國發(fā)現(xiàn)有8種稗草 (Chen&Philips, 2006)。作為全球十大農(nóng)田惡性抗性雜草之一，稗草已對很多類型的除草劑 產(chǎn)生了抗藥性（HeapI，2015)。目前，稗草對除草劑產(chǎn)生抗藥性的機(jī)理研宄主要側(cè)重于除草 劑作用靶標(biāo)蛋白位點突變和非靶標(biāo)蛋白位點突變。
[0003] 20世紀(jì)40年代以前研宄人員就發(fā)現(xiàn)，乙烯是植物體內(nèi)重要的天然激素，不僅具 有催熟作用，而且還是一種內(nèi)源生長調(diào)節(jié)劑，在生理上對植物生長和發(fā)育的許多方面都有 影響，它影響的過程包括：種子萌發(fā)，根和莖的生長，花的發(fā)育，花、葉的衰老和脫落，果實的 成熟。后來的研宄表明，乙烯也參與調(diào)節(jié)了植物一系列對應(yīng)于生物和非生物脅迫的反應(yīng)， 例如機(jī)械傷害、冷害、漬水、病原菌入侵等，另外乙烯也參與了植物程序性死亡和DNA降解。 AdamsD0等（1979)以蘋果組織為研宄對象，發(fā)現(xiàn)了高等植物體內(nèi)乙烯的生物合成途徑： 甲硫氨酸（Met) -S-腺苷甲硫氨酸（SAM) - 1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC)-乙烯（ET)。 YangSF等（1979)對芹菜和番茄等16種蔬菜的根、莖、葉、花和果實的組織進(jìn)行培養(yǎng)試驗， 發(fā)現(xiàn)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸能顯著增加植物組織中乙烯的生成量，肯定了乙烯的生物合成 途徑，也證明了 1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸是一種有效的生長調(diào)節(jié)劑。另外，CameronAC等 (1979)研宄發(fā)現(xiàn)，催化SAM向ACC轉(zhuǎn)化的酶叫ACC合成酶（ACS)，催化ACC向乙烯轉(zhuǎn)化的 酶稱為ACC氧化酶（1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶，簡稱AC0)。從合成途徑中可以看出， 1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC)是乙烯合成過程中的一個重要的中間產(chǎn)物，在有氧條件下， ACC在ACC氧化酶的催化下形成乙烯，該反應(yīng)由ACC氧化酶催化，是乙烯生物合成的關(guān)鍵步 驟之一。
[0004] 隨著除草劑的長期使用，稗草對常用的除草劑一二氯喹啉酸的敏感性正在逐年 下降。前面有人研宄認(rèn)為稗草對二氯喹啉酸產(chǎn)生抗藥性與吸收、傳導(dǎo)、代謝無關(guān)，而與乙 烯的合成途徑變化有密切關(guān)系。Yasuor等（2012)在研宄卡里福利亞水稗（Echinochloa phyllopogon)的抗二氯喹啉酸機(jī)制中也發(fā)現(xiàn)，敏感生物型中乙烯產(chǎn)量比抗性生物型中乙烯 產(chǎn)量要多。國內(nèi)也研宄了西來稗（Echinochloacrus-gallivar.zelayensis)對二氯喹啉 酸的抗性機(jī)制，四個西來稗抗性生物型中的乙烯、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC)的水平比敏 感性生物型中低，且抗性生物型中ACC合成酶和ACC氧化酶的活性比敏感性生物型中低，表 明了乙烯生物合成途徑的抑制導(dǎo)致了西來稗抗藥性的產(chǎn)生（Xuetal.，2013)。
[0005] 經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，公開號為CN100393874C的中國專利公開了類1-氨基環(huán)丙烷-1-羧 酸氧化酶及其編碼基因，特別涉及類1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶及其編碼基因在棉花纖 維生產(chǎn)中的應(yīng)用，該專利中的基因編碼一個類1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶，具有乙烯合 成酶（ACO)的功能，在棉花纖維發(fā)育的起始開始轉(zhuǎn)錄，并在伸長期大量轉(zhuǎn)錄，在棉花纖維組 織中大量表達(dá)，顯著提高了纖維生長速度和長度，說明了乙烯合成數(shù)量與纖維長度的正相 關(guān)性。
[0006] 由于抗衰老和保鮮的生產(chǎn)需要，花丼和水果例如康乃馨、番茄等植物中ACO基因 特征及其表達(dá)的研宄已取得了很大的進(jìn)展。然而，在禾本科植物中有關(guān)ACO的研宄報道相 對較少。迄今為止，ACO基因未見從稗草中克隆，且從基因水平來闡述乙烯生物合成途徑對 稗草抗藥性的影響也未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要實現(xiàn)的發(fā)明目的是：克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種抗藥性稗草 中的1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶及其編碼基因、突變位點與應(yīng)用。
[0008] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0009] 一種抗藥性稗草中的1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶，其氨基酸殘基序列如SEQID NO: 3所示。
[0010] 序列表中的序列3的蛋白質(zhì)由311個氨基酸殘基組成，存在DI0X_N*20G-Fe11_ 〇xy兩個結(jié)構(gòu)域。
[0011] 上述抗藥性稗草中的1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的編碼基因也屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍，該編碼基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
[0012] 序列表中的序列1編碼序列表中SEQIDNO:3蛋白質(zhì)序列的DNA，其核苷酸序列 長度為lOOObp，該基因的開放閱讀框為自序列1的5'端第60位到第995位堿基，編碼區(qū)長 度為936bp。
[0013] 上述抗藥性稗草中的1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶功能區(qū)域的所有突變位點均 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的功能區(qū)域包括蛋白保守結(jié)構(gòu)域 DI0X_N和20G-FeII_0xy;1_氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的氨基酸突變位點為F98 -Y， G101 -D，Q206 -R，G270 -V，A272 -G，其中氨基酸突變位點F98 -Y，G101 -D和 Q206 -R處于蛋白保守結(jié)構(gòu)域DI0X_N和20G-FeII_0xy中；與氨基酸突變相對應(yīng)的堿基 突變位點為T293 -A，G302 -A，A617 -G，G809 -T，C815 -G。
[0014] 本發(fā)明以二氯喹啉酸抗藥性稗草和敏感性稗草為研宄材料，分別提取二者的總 RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（RT-PCR)克隆得到稗草中1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸 氧化酶（簡稱EcACO)的編碼基因，在PCR擴(kuò)增步驟中，引物的核苷酸序列為：
[0015]引物EcACO-F:5' -CAGTTGCACAGAGACATTTCAC-3'
[0016] 引物EcAC0-R:5' -TTACTTTAAGCCGCCGGAGAT-3'。
[0017] 其中，敏感性稗草中的1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的氨基酸殘基序列如SEQ IDNO:4所示，其基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，該基因的開放閱讀框為自序列2 的5'端第60位到第995位堿基。將抗藥性稗草中的1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶記為 EcACO-R，敏感性稗草中的1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶記為EcACO-S，如圖1所示，對二 者進(jìn)行核苷酸序列及氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，二者的氨基酸序列存在5個氨基酸突變位點差 異，具體為F98 -Y，G101 -D，Q206 -R，G270 -V，A272 -G。據(jù)了解，氨基酸突變是由相應(yīng) 位置的堿基異變引起的，與上述氨基酸突變相對應(yīng)的堿基突變位點為T293 -A，G302 -A，A617 -G，G809 -T，C815 -G。其中，F(xiàn)98 -Y，G101 -D和Q206 -R這三處氨基酸突變 位置均處于蛋白保守結(jié)構(gòu)域DI0X_N* 20G-FeII_0xy中，DI0X_N* 20G-FeII_0xy均與 Fe2+的氧化有關(guān)。Fe2+是催化ACC向乙烯轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵輔助因子，這三處氨基酸突變可 能會降低乙烯生成反應(yīng)中Fe2+輔助因子與EcACO蛋白的結(jié)合效率，進(jìn)而抑制了乙烯生物合 成途徑，最終導(dǎo)致稗草對二氯喹啉酸產(chǎn)生抗性。
[0018] 本發(fā)明根據(jù)二氯喹啉酸抗藥性稗草中的EcACO-R基因序列以及敏感性稗草中的 EcACO-S基因序列設(shè)計特異性引物，并設(shè)0-act in基因為內(nèi)參進(jìn)行實時定量PCR分析，重 復(fù)3次試驗，反應(yīng)完成后進(jìn)行溶解曲線檢驗，并按照2_AACT法計算基因的相對表達(dá)量，發(fā)現(xiàn) EcACO-R基因的相對表達(dá)量比EcACO-S基因的相對表達(dá)量低（見圖2)。
[0019] 本發(fā)明將抗藥性稗草EcACO-R基因和敏感性稗草EcACO-S基因分別構(gòu)建到含有麥 芽糖結(jié)合蛋白（MBP)標(biāo)簽的原核表達(dá)載體質(zhì)粒pMAL-c5X中，構(gòu)建原核表達(dá)載體后得到重組 質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株BL21中進(jìn)行融合蛋白的原核表達(dá)，對IPTG誘導(dǎo)后的 蛋白進(jìn)行12 %SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明，抗藥性稗草中的融合蛋白MBP: :EcACO-R和敏感性 稗草中的融合蛋白MBP: :EcACO-S，二者分子量大小均約為75kD(與理論值一致），這兩種融 合蛋白主要存在于上清中，即在大腸桿菌中主要以可溶性蛋白的形式表達(dá)（見圖3)。分別 對這兩種可溶性蛋白進(jìn)行純化并對純化后的可溶性蛋白進(jìn)行蛋白活性測定，以研宄AC0的 酶活性，AC0的酶活性以每小時1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC)生成乙烯（ET)這一步驟所產(chǎn) 生的乙烯量表示，單位為nmol?yf1 測量時，設(shè)乙烯標(biāo)樣為陰性對照，利用裝備A1203 柱子的氣相色譜儀分析單位時間內(nèi)氣體乙烯的生成量，重復(fù)3次試驗，結(jié)果顯示5yg的融 合蛋白MBP: :EcACO-S每小時內(nèi)生成的乙烯量是融合蛋白MBP: :EcACO-R的2. 15倍（見圖 4)，即MBP: :EcAC〇-R的蛋白活性顯著低于MBP: :EcAC〇-S，EcAC