細(xì)胞的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用
【專利說(shuō)明】細(xì)胞的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00580039543.3，申請(qǐng)日為2005年6月8日的同名申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及細(xì)胞的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用，更具體而言，涉及細(xì)胞的培養(yǎng)方法和應(yīng)用該方法在細(xì)胞中生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0003]培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，想要得到由該動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的天然型蛋白質(zhì)的情況下，或者培養(yǎng)導(dǎo)入了編碼期望的蛋白質(zhì)的基因的動(dòng)物細(xì)胞，以制備期望的蛋白質(zhì)等的情況下，除了鹽類(lèi)、糖類(lèi)、氨基酸類(lèi)、以及維生素類(lèi)等的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物之外，為了使該動(dòng)物細(xì)胞增殖，通常將來(lái)源于哺乳動(dòng)物的提取物、具體而言，在5?20%的范圍內(nèi)將胎牛血清等血清添加到培養(yǎng)基中。不過(guò)，所涉及的來(lái)源于哺乳動(dòng)物的血清存在占培養(yǎng)基的成本的75?95%、且常因?yàn)槠焚|(zhì)有批次間的差異不能獲得穩(wěn)定的增殖的缺點(diǎn)。此外，由于來(lái)自哺乳動(dòng)物的血清不能用高壓滅菌器等設(shè)備滅菌，可能會(huì)被病毒或者支原體污染，盡管其中多數(shù)是無(wú)害的，但將成為附加于穩(wěn)定生產(chǎn)方面的重要的未知因素。此外，血清中含有500種以上的蛋白質(zhì)，由于這個(gè)原因，造成了從培養(yǎng)中的培養(yǎng)基分離、純化作為細(xì)胞產(chǎn)物的所期望的蛋白質(zhì)的復(fù)雜化。為了消除此類(lèi)在穩(wěn)定生產(chǎn)上的問(wèn)題，進(jìn)行了使用胎球蛋白、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白等的來(lái)源于血清的純化的蛋白質(zhì)以替代血清的方法。此外，從制備成本的觀點(diǎn)出發(fā)，也嘗試了使用從哺乳動(dòng)物提取的培養(yǎng)基成分的方法。
[0004]不過(guò)，由于近年來(lái)對(duì)于來(lái)源于哺乳動(dòng)物的成分，存在與瘋牛病(mad cowdisease)、牛海綿狀腦癥(Bovine Spongiform Encephalopathy:BSE)、傳染性海綿狀腦癥(Transmissible Spongiform Encephalopathy:TSE)、或者人海綿狀腦病(Creutzfeld —Jakob Disease:CJD)等有關(guān)的擔(dān)心，所以從安全性的觀點(diǎn)出發(fā)，期望出現(xiàn)一種不含有這些來(lái)源于哺乳動(dòng)物的成分的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基。
[0005]培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的時(shí)候，如果不向使用的培養(yǎng)基中添加上述這樣的來(lái)源于哺乳動(dòng)物的成分的話，將會(huì)發(fā)生下述問(wèn)題:在培養(yǎng)的早期細(xì)胞的生存率的顯著降低，培養(yǎng)液中的活細(xì)胞數(shù)減少，因而不能進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)或者大量培養(yǎng)。
[0006]為了解決上述問(wèn)題，報(bào)道了向培養(yǎng)用培養(yǎng)基中添加魚(yú)肉的酶分解物或者魚(yú)肉提取物的方法(專利文獻(xiàn)1、2)。通過(guò)該方法，即使不用使用通常必須使用的胎牛血清，也可以高產(chǎn)量地生產(chǎn)蛋白質(zhì)。
[0007]不過(guò)從制備成本的角度出發(fā)，優(yōu)選盡可能提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量的情況，因此期待得到進(jìn)一步的改良。
[0008]專利文獻(xiàn)1:國(guó)際公開(kāi)第99/63058號(hào)小冊(cè)子
[0009]專利文獻(xiàn)2:特開(kāi)2003 - 334068號(hào)公報(bào)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]發(fā)明所要解決的問(wèn)題
[0011]本發(fā)明的目的在于，通過(guò)使用含有魚(yú)肉的酶分解物或者魚(yú)肉提取物的培養(yǎng)基進(jìn)行流加培養(yǎng)，在細(xì)胞中高產(chǎn)量地生產(chǎn)蛋白質(zhì)。
[0012]用于解決問(wèn)題的方法
[0013]本發(fā)明人等為了解決上述課題，進(jìn)行了深入研宄，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用添加了魚(yú)肉的酶分解物或者魚(yú)肉提取物的培養(yǎng)基進(jìn)行流加培養(yǎng)，能夠在細(xì)胞中以更高的產(chǎn)量產(chǎn)生期望的蛋白質(zhì)，由此完成了本發(fā)明。
[0014]本發(fā)明的內(nèi)容如下所示。
[0015](I)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，在用初始培養(yǎng)基開(kāi)始細(xì)胞的培養(yǎng)，并向正在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中再至少加入一次流加培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法中，向初始培養(yǎng)基或者流加培養(yǎng)基的至少一方中添加魚(yú)肉的酶分解物或者魚(yú)肉提取物。
[0016](2)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，用添加了魚(yú)肉的酶分解物或者魚(yú)肉提取物的培養(yǎng)基開(kāi)始細(xì)胞的培養(yǎng)，向正在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中再至少加入一次魚(yú)肉的酶分解物或者魚(yú)肉提取物。
[0017](3)第⑵項(xiàng)中記載的培養(yǎng)方法，其中，使用流加培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞。
[0018](4)第⑴?(3)的任一項(xiàng)中記載的培養(yǎng)方法，其中，細(xì)胞是導(dǎo)入了編碼期望的蛋白質(zhì)的基因的細(xì)胞。
[0019](5)第(4)項(xiàng)中記載的培養(yǎng)方法，其中，所期望的蛋白質(zhì)是抗體。
[0020](6)第(I)?(5)中任一項(xiàng)所記載的培養(yǎng)方法，其中，細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞。
[0021](7)第(6)項(xiàng)中記載的培養(yǎng)方法，其中，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0022](8)第(7)項(xiàng)中記載的培養(yǎng)方法，其中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
[0023](9)制備方法，是使用初始培養(yǎng)基開(kāi)始細(xì)胞的培養(yǎng)，通過(guò)向正在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中再至少加入一次流加培養(yǎng)基以培養(yǎng)細(xì)胞的制造蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，在初始培養(yǎng)基或者流加培養(yǎng)基的至少一方中添加魚(yú)肉的酶分解物或者魚(yú)肉提取物。
[0024](10)蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，用添加了魚(yú)肉的酶分解物或者魚(yú)肉提取物的培養(yǎng)基開(kāi)始細(xì)胞的培養(yǎng)，向正在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中再至少加入一次魚(yú)肉的酶分解物或者魚(yú)肉提取物。
[0025](11)第(10)項(xiàng)中記載的制備方法，其中，用流加培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞。
[0026](12)第(9)?(11)中任一項(xiàng)記載的制備方法，其中，細(xì)胞是導(dǎo)入了編碼期望的蛋白質(zhì)的基因的細(xì)胞。
[0027](13)第(12)項(xiàng)記載的制備方法，其中，所期望的蛋白質(zhì)是抗體。
[0028](14)第(9)?(13)中任一項(xiàng)記載的制備方法，其中，細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞。
[0029](15)第(14)項(xiàng)中記載的制備方法，其中，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0030](16)第(15)項(xiàng)中記載的制備方法，其中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
[0031]發(fā)明的效果
[0032]在本發(fā)明中，通過(guò)不僅向在細(xì)胞的培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)的培養(yǎng)基中添加魚(yú)肉的酶分解物或者魚(yú)肉提取物，還向正在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入魚(yú)肉的酶分解物或者魚(yú)肉提取物，能夠以更高的產(chǎn)量在細(xì)胞中生產(chǎn)期望的蛋白質(zhì)。
[0033]本說(shuō)明書(shū)包括作為本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)的基礎(chǔ)的日本專利申請(qǐng)、特愿2005 - 000747號(hào)的說(shuō)明書(shū)以及/或者附圖所記載的內(nèi)容。
【附圖說(shuō)明】
[0034]圖1是表示使用添加了 5g/L狐鰹水解物的不含來(lái)自哺乳動(dòng)物成分的培養(yǎng)基(初始培養(yǎng)基)以及添加了 30g/L狐鰹水解物的不含來(lái)自哺乳動(dòng)物成分的培養(yǎng)基(流加培養(yǎng)基)培養(yǎng)的CHO細(xì)胞在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的抗體蛋白質(zhì)濃度(g/L)的圖。
[0035]圖2是表示用添加了 15g/L狐鰹水解物的不含來(lái)自哺乳動(dòng)物成分的培養(yǎng)基(初始培養(yǎng)基)以及添加了 75g/L狐鰹水解物的不含來(lái)自哺乳動(dòng)物成分的培養(yǎng)基(流加培養(yǎng)基)培養(yǎng)的CHO細(xì)胞在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的抗體蛋白質(zhì)濃度(g/L)的圖。
[0036]圖3是表示用添加了 5g/L狐鰹水解物的不含來(lái)自哺乳動(dòng)物成分的培養(yǎng)基(初始培養(yǎng)基)以及添加了 30g/L狐鰹水解物的不含來(lái)自哺乳動(dòng)物成分的培養(yǎng)基(流加培養(yǎng)基)培養(yǎng)的CHO細(xì)胞在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的抗體蛋白質(zhì)濃度(g/L)的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0037]下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。
[0038]在本發(fā)明中以初始培養(yǎng)基開(kāi)始細(xì)胞的培養(yǎng)，然后，向正在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中至少一次加入流加培養(yǎng)基。此處，初始培養(yǎng)基或者流加培養(yǎng)基的至少一方添加有魚(yú)肉的酶分解物或者魚(yú)肉提取物。
[0039]此外，作為本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，使用添加了魚(yú)肉的酶分解物或者魚(yú)肉提取物的培養(yǎng)基開(kāi)始細(xì)胞的培養(yǎng)，然后，向正在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中至少I(mǎi)次加入魚(yú)肉的酶分解物或者魚(yú)肉提取物。
[0040]根據(jù)本發(fā)明，即使不在目前通常作為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基使用的培養(yǎng)基中添加來(lái)源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的成分，也能很好地進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)。
[0041]通常，細(xì)胞培養(yǎng)的方法分類(lèi)為分批法(batch culture)、連續(xù)法(continuousculture)、流加培養(yǎng)法(fed — batch culture)。本發(fā)明的方法中可以使用任何一種培養(yǎng)方法，但優(yōu)選使用流加培養(yǎng)法或者連續(xù)法，特別優(yōu)選使用流加培養(yǎng)法。
[0042]分批法是向培養(yǎng)基中加入少量的種培養(yǎng)液，在培養(yǎng)過(guò)程中添加新的培養(yǎng)基或者不排出培養(yǎng)液，使細(xì)胞增殖的培養(yǎng)方法。
[0043]連續(xù)法是在培養(yǎng)過(guò)程中連續(xù)地加入培養(yǎng)基，并且連續(xù)地使之排出的培養(yǎng)方法。需要說(shuō)明的是，連續(xù)法也包含灌流培養(yǎng)。
[0044]流加培養(yǎng)法因?yàn)榻橛诜峙ê瓦B續(xù)法之間，所以也稱為半分批法(semi — batchculture)，是在培養(yǎng)過(guò)程中連續(xù)地或者逐次地加入培養(yǎng)基，但不像連續(xù)法那樣地進(jìn)行連續(xù)的培養(yǎng)液的排出的培養(yǎng)方法。流加培養(yǎng)的時(shí)候加入的培養(yǎng)基(以下稱為流加培養(yǎng)基)無(wú)需是和已經(jīng)在培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基(下面稱為初始培養(yǎng)基)相同的培養(yǎng)基，可以添加不同的培養(yǎng)基，也可以僅添加特定的成分。
[0045]本發(fā)明中初始培養(yǎng)基指的是通常在細(xì)胞培養(yǎng)的最初的階段所使用的培養(yǎng)基。不過(guò)在多次分開(kāi)添加流加培養(yǎng)基成分的情況下，也可以將分別添加流加培養(yǎng)基之前的培養(yǎng)基作為初始培養(yǎng)基。
[0046]在本發(fā)明的方法中，采用流加培養(yǎng)法的情況下，可以在流加培養(yǎng)基或者初始培養(yǎng)基的任何一方中含有魚(yú)肉的酶分解物或者魚(yú)肉提取物，但優(yōu)選在流加培養(yǎng)基以及初始培養(yǎng)基二者中含有魚(yú)肉的酶分解物或者魚(yú)肉提取物。此外，與初始培養(yǎng)基中的魚(yú)肉的酶分解物或者魚(yú)肉提取物的濃度相比較，優(yōu)選流加培養(yǎng)基中的魚(yú)肉的酶分解物或者魚(yú)肉的提取物的濃度高。初始培養(yǎng)基中的魚(yú)肉的酶分解物或者魚(yú)肉提取物的濃度通常在I?30g/L是適當(dāng)?shù)?，?yōu)選3?20g/L、更優(yōu)選5?15g/L。流